CN106442753B

CN106442753B - 一种测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法

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Publication number: CN106442753B
Application number: CN201610764923.3A
Authority: CN
Inventors: 熊巍; 韶济民; 庞夙; 陶晓秋; 黄玫; 张海燕; 杨雪
Original assignee: SICHUAN PROVINCE Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp
Current assignee: SICHUAN PROVINCE Co OF CHINA NATIONAL TOBACCO Corp
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: CN106442753A

Abstract

本发明公开一种测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法，包括以下步骤：烟气捕集、提取目标物、净化、标准储备液和标准工作液的配制和超高效液相色谱‑串联质谱测定的步骤。本发明与传统的GC‑TEA检测方法比较，采用醋酸铵萃取，涡旋振荡，过滤进样的方式，简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。与现有的LC‑MS/MS方法相比，本发明用涡旋振荡法振荡时间明显短于超声萃取或振荡萃取，提取效率增加，振荡时间缩短了6倍。本发明具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

Description

一种测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法

技术领域

本发明属于卷烟烟气分析技术领域，具体涉及卷烟烟气有害成分的检验，特别是卷烟主流烟气中特有TSNAs含量的测定方法。

背景技术

烟草特有TSNAs(TSNAs)主要包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基TSNAs基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)等。国际癌症研究机构(IARC)、Hecht研究团队等，加拿大政府名单中有害成分的毒性评价结果表明，且有足够的证据认为，TSNAs中的NNK对实验室动物有致癌性。近年，国家烟草专卖局组织实施的“卷烟危害性指标体系研究”项目也表明，在卷烟烟气的实际环境下，对人体影响最大的7种有害化学成分指标中，NNK是其中之一。

目前，卷烟主流烟气中TSNAs的检测方法主要有气相色谱-热能分析法(GC-TEA)、气质联用法(GC–MS)和液相色谱串联质谱联用法(LC-MS/MS)。GC-TEA法作为CORESTA推荐的主流烟气中TSNAs的检测方法，使用的最为广泛。但是GC-TEA方法的样品前处理过程复杂，选择性较差。现行最为流行的LC-MS/MS法一般选取醋酸铵水溶液萃取，然后直接上样分析，方法简单，但是对于TSNAs含量较低的中式烤烟型卷烟的测定较为困难，特别是含量最低的NAB，测定较为困难。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种前处理相对简单、灵敏度更高、分析速度快的TSNAs含量检测方法，该方法专用于分析卷烟主流烟气中TSNAs含量。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法，包括以下步骤：

步骤a)烟气捕集

选取玻璃纤维滤片捕集卷烟主流烟气；

步骤b)提取目标物

将捕集过主流烟气的滤片放入萃取管，加入萃取液和内标,将第一离心管置于第一涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；所述萃取管为离心管；

步骤c)净化

吸取上清液于第二离心管，加入陶瓷均质子、硫酸镁和N-丙基乙二胺，将第二离心管置于第二涡旋振荡仪，涡旋振荡，离心；上清液经有机相滤膜过滤，滤液待测；

步骤d)标准储备液和标准工作液的配制

用甲醇配置TSNAs标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，低温保存；量取储备液用甲醇稀释定容，制得TSNAs工作液；

用甲醇准确配置TSNAs-d4内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，并储存于棕色玻璃瓶中；所有的储备液低温保存，使用前将其恢复到室温；

用萃取液配制不同浓度的TSNAs标准工作溶液；

步骤e)超高效液相色谱-串联质谱测定

吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS***，按内标法以峰面积计算出样品待测液中TSNAs含量。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤a)中，捕集主流烟气的滤片直径为44mm。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤b)中，第一离心管为50mL，加入100mmol/L的萃取液15mL和1μg/mL混合内标150μL；所述萃取液为醋酸铵水溶液。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤b)中，所述第一涡旋振荡仪的涡旋振荡时间为5min，涡旋振荡转速为2000转/min。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤c)中，第二离心管为2mL，移取的上清液为1mL,加入陶瓷均质子两颗，加入的无水硫酸镁和N-丙基乙二胺分别为150mg和25mg。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤c)中，所述第二涡旋震荡仪的涡旋振荡时间为2min，涡旋振荡转速为2000转/min。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤c)中，离心时间为4min，离心机转速为6000转/min。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤e)具体操作为：吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS***，绘制TSNAs的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤d)中，UPLC-MS/MS***的色谱条件：选用色谱柱为C18，规格为100mm×2.1mm，1.7μm；流动相A：0.1％甲酸水和流动相B：甲醇；梯度洗脱条件为：0～0.5min，80％A～80％A；0.5～1.0min，80％A～10％A；1.0～2.9min，10％A～10％A；2.9～3.5min，10％A～80％A；3.51～5.0min，80％A～80％A；流动相流速为0.6mL/min。

根据本发明测定卷烟主流烟气中烟草特有亚硝胺含量的方法的一个实施方式，所述步骤d)中，串联质谱检测的条件为：电喷雾离子源，喷雾电压(IS)3.0kV；离子化温度450℃；雾化气流量800L/Hr；锥孔气流量50L/Hr；碰撞气为氩气，流量0.15ml/min；其余气体为氮气；驻留时间为100msec，正离子MRM模式采集。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：

1、与传统的GC-TEA检测方法比较，采用醋酸铵萃取，涡旋振荡，过滤进样的方式，简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。

2、与现有的LC-MS/MS方法相比，用涡旋振荡法振荡时间明显短于超声萃取或振荡萃取，提取效率增加，振荡时间缩短了6倍。

3、与现有的LC-MS/MS方法相比，选取了分散固相萃取净化主流烟气样品，有利于低TSNAs含量的烤烟型卷烟的测定。

4、本发明选取了超高效液相色谱柱，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩短，提高检测通量。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于吸烟者主流烟气中低含量TSNAs的测定。

5、本发明使用内标为氘代内标，使用氘代内标定量，有效消除基质干扰和前处理过程中引起的误差。

6、本发明具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

附图说明

图1是振荡萃取-LC-MS/MS法检测1号烤烟样品中TSNAs的选择离子流色谱图。

图2是本发明检测1号烤烟样品中TSNAs的选择离子流色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实例做进一步描述。

本实施例所用仪器与试剂为：Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配备电喷雾电离源(ESI)；VtexMixer 230VeU振荡器(美国Labnet公司)。

甲酸为HPLC级(浓度为49-51％，德国Sigma公司)；乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Thermo-Fisher公司)；TSNAs，TSNAs-d₄(纯度：98％；同位素纯度：99％，Toronto ResearchChemicals Inc.)，水为超纯水。

本发明采用醋酸铵水溶液为萃取液，涡旋振荡萃取，基质分散萃取净化，氘代内标定量，UPLC-MS/MS测定等步骤对主流烟气中TSNAs进行测定，可快速、准确、同时检测出主流烟气中4种TSNAs的含量，即N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基TSNAs基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)的含量。

1、主流烟气捕集

根据《卷烟：取样》(ISO 8243:2006)来选取样品烟支,按照《烟草和烟草制品调节和试验用大气》(ISO 3402:1999)来平衡烟支；采用《常规分析卷烟吸烟机.定义和标准条件》(ISO 3308:2000)来捕集卷烟主流烟气。

2、提取主流烟气中的分析物

取捕集过卷烟主流烟气的滤片，放入50mL具塞离心管，加入15mL 100mmol/L醋酸铵萃取液，并加入150μL 1μg/mL氘代混合内标，在2000转/分钟的条件下涡旋振荡5min，取1mL上清液于2mL旋盖离心管中，加入150mg无水硫酸镁和25mgPSA，在2000转/分钟的条件下涡旋振荡2min，在6000转/分钟的条件下离心4min。上清液过0.22μm有机相滤膜，取5μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。

3、UPLC-MS/MS测定

(1)UPLC-MS/MS条件：

色谱条件：Atiantis UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm，美国Waters公司)；流动相A：0.1％甲酸水和流动相B：甲醇；梯度洗脱条件为：0～0.5min，80％A～80％A；0.5～1.0min，80％A～10％A；1.0～2.9min，10％A～10％A；2.9～3.5min，10％A～80％A；3.51～5.0min，80％A～80％A；流动相流速为0.6mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源，喷雾电压(IS)3.0kV；离子化温度450℃；雾化气流量800L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为100msec，正离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1。

表1多反应监测模式下四种烟草特有TSNAs及其氘代内标的部分质谱参数

*定量离子对。

(2)标准储备液的配制

储备液及工作液的配制：用甲醇准确配制11.00μg/mL NNN，11.20μg/mL NNK，10.14μg/mL NAB，5.00μg/mL NAT标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。量取各化合物储备液进行混合，配制得到1μg/mL TSNAs混合标准溶液。

用甲醇配制100μg/mL NNN-d₄，50μg/mL NAT-d₄，100μg/mL NAB-d₄和250μg/mLNNK-d₄的内标储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。准确量取的各内标储备液，混合后配成1μg/mL混合内标溶液。

(3)TSNAs含量的测定：

吸取配制好的不同浓度的TSNAs的混合标准工作溶液各5μL，注入UPLC-MS/MS；TSNAs的线性回归方程见表2，方程中y代表分析物与内标峰面积的比值，x表示主流烟气中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中TSNAs的含量。

(4)该方法的线性范围和检出限

本实施例以空白烤烟基质配制标准曲线，分别移取1μg/mL标准储备液0μL，10μL，20μL,50μL,100μL，200μL，500μL和800μL于8个10mL棕色容量瓶中，每个容量瓶移入100μL 1μg/mL氘代混合内标工作液，用甲醇定容至10mL。各标准工作溶液的浓度分别为0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL和80ng/mL。对各标样峰面积与内标的峰面积的比值(y)和其浓度(x)进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见表2。各种化合物线性关系良好(相关系数r²≥0.99),可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限,详见表2。

表2 TSNAs的线性范围、相关系数、检测限及保留时间

(5)本发明方法的重复性和加标回收率：

在主流烟气样品萃取过程中添加一定量的TSNAs标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本实验选用高、中、低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，除了较低含量的NAB在加入量为10.1ng时的回收率为82.5％之外，其它点的回收率都在90％-95％之间。方法的精密度以回收率的相对标准偏差(RSD)来评价，对同一样品平行测定5次，3种化合物回收率的RSD范围为4.9％～9.8％，结果见表3。

表3主流烟气中TSNAs的回收率和精密度(n＝5)

(6)本发明方法与传统的超声萃取方法的比较：

传统的LC-MS/MS测定主流烟气的TSNAs主要是选取回旋振荡或者超声萃取30min,我们选取了四个样品，两个烤烟型样品，两个混合型样品，盒标焦油量范围为3mg-11mg，分别用传统的超声萃取方法和本发明的涡旋振荡基质分散固相萃取方法进行比对，每个样品测定6

个平行，通过回归分析显示两种方法的NNN,NNK,NAB和NAT相关系数分别为0.983,0.930,0.835和0.996,四个指标都显著相关(P<0.001),测定结果见表4，两种方法的相关性分析的结果见表5。振荡萃取-测定LC-MS/MS测定1号烤烟型卷烟主流烟气中TSNAs的选择离子流色谱图如图1所示，同一样品中采用本方法处理测定主流烟气的TSNAs的选择离子流色谱图如图2所示，从图中可以看出，本发明由于加入简单的净化步骤后，目标分析物的响应增强，干扰物明显降低。表4采用振荡萃取的LC-MS/MS方法和本发明方法测定四种卷烟的检测数据

注：A,B为烤烟型卷烟，C,D为混合型卷烟。

表5振荡萃取-LC-MS/MS方法和本发明方法测定数据的回归分析

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，所述TSNAs包括N-亚硝基降烟碱、4-（甲基TSNAs基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮、N-亚硝基假木贼碱和N-亚硝基新烟碱，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a）烟气捕集

选取玻璃纤维滤片捕集卷烟主流烟气；

步骤b）提取目标物

将捕集过主流烟气的滤片放入萃取管，加入萃取液和内标, 将第一离心管置于第一涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；所述萃取管为离心管；所述萃取液为醋酸铵水溶液；

步骤c）净化

步骤d）标准储备液和标准工作液的配制

用甲醇配置TSNAs标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存；量取储备液用甲醇稀释定容，制得TSNAs工作液；

用甲醇准确配置TSNAs-d₄内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，并储存于棕色玻璃瓶中；所有的储备液-20℃保存，使用前将其恢复到室温；

用萃取液配制不同浓度的TSNAs标准工作溶液；

步骤e）超高效液相色谱-串联质谱测定

吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS***，按内标法以峰面积计算出样品待测液中TSNAs含量；

UPLC-MS/MS***的色谱条件：选用色谱柱为Atiantis UPLC BEH C18，规格为100 mm×2.1mm，1.7μm；流动相A：0.1%甲酸水和流动相B：甲醇；梯度洗脱条件为：0~0.5min，80%A~80%A；0.5~1.0min，80%A~10%A；1.0~2.9min，10%A~10%A；2.9~3.5min，10%A~80%A；3.51~5.0min，80%A~80%A；流动相流速为0.6 mL/min；

串联质谱检测的条件为：电喷雾离子源，喷雾电压3.0kV；离子化温度450℃；雾化气流量800L/Hr；锥孔气流量50L/Hr；碰撞气为氩气，流量0.15ml/min；其余气体为氮气；驻留时间为100msec，正离子MRM模式采集。

2.根据权利要求1所述的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，其特征在于，所述步骤a）中，捕集主流烟气的滤片直径为44 mm。

3.根据权利要求1所述的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，其特征在于，所述步骤b）中，第一离心管为50mL，加入100mmol/L的萃取液15mL和1μg/mL混合内标150μL。

4.根据权利要求1或2所述的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，所述步骤b）中，所述第一涡旋振荡仪的涡旋振荡时间为5min，涡旋振荡转速为2000转/min。

5.根据权利要求1所述的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，所述步骤c）中，第二离心管为2 mL，移取的上清液为1mL,加入陶瓷均质子两颗，加入的无水硫酸镁和N-丙基乙二胺分别为150mg和25mg。

6.根据权利要求1或5所述的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，所述步骤c）中，所述第二涡旋震荡仪的涡旋振荡时间为2min，涡旋振荡转速为2000转/min。

7.根据权利要求1或5所述的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，所述步骤c）中，离心时间为4min，离心机转速为6000转/min。

8.根据权利要求1所述的测定卷烟主流烟气中TSNAs含量的方法，所述步骤e）具体操作为：吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS***，绘制TSNAs的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。