CN113702546A - 一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法,其包括:将乳制品离心脱脂后加入同位素内标品,再加入硼酸盐缓冲液和硼氢化钠溶液,获得混合液;将混合液进行酸水解,真空离心浓缩至近干,加水复溶,过滤去除杂质,获得处理后的乳制品;向处理后的乳制品中加入AGEs以制作各种AGEs标准品,将各标准品与其对应的同位素内标品的积分色谱面积比乘以对应的同位素内标品的浓度作为各标准品浓度的函数来绘制标准曲线;将处理后的乳制品进行UPLC‑MS/MS检测,得到乳制品中AGEs的峰面积,代入标准曲线计算得各AGEs的浓度。从而实现对食品中多种AGEs的含量进行全面准确分析。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域,具体涉及一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法。
背景技术
晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end-products,AGEs)是蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等物质的游离氨基与还原糖的羰基经过缩合、重排、裂解及氧化修饰等一系列反应后形成的一类稳定终末产物的总称。目前已经表征和确定的AGEs超过40种,其中在食品中发现的约有15种,包括游离型和肽/蛋白结合型AGEs,有些AGEs如羧甲基赖氨酸(CML)是由赖氨酸衍生而成,而有些AGEs则是经精氨酸修饰产生,或者同时交联这两种氨基酸反应得到的。
乳及乳制品以其丰富的营养和独特的风味,成为人们日常生活主要的营养来源之一。乳制品富含乳糖、乳清蛋白及酪蛋白等组分,在食品加工、储藏和运输过程中易发生美拉德反应,形成各类AGEs。
越来越多的证据表明,食源性AGEs的摄入对人体健康有不利影响,并且与糖尿病、慢性肾病等多种慢性疾病密切相关。由于食品基质的复杂性和难处理性,以及AGEs种类繁多,结构复杂等原因,对于食品中AGEs的检测一直缺少通用、准确、高效的方法。目前食品中AGEs的检测手段主要有酶联免疫法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。其中,酶联免疫法由于准确度和抗体特异性的限制应用较少;而气相色谱-质谱法需要对目标进行衍生化,方法比较繁琐,目标物的回收率不高;液相色谱法虽然仪器普及率较高,操作简单,但是检测灵敏度并不理想。
在检测AGEs时,将液相色谱仪与质谱仪串联使用,其灵敏度、选择性和分析速度将会大大提高。但是,相关技术中液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)仅能检测一到三种AGEs产物,且效率较低,难以客观反映食物中不同AGEs的含量和分布情况。此外,由于质谱定量技术易受样品基质效应的影响产生误差,因此在检测不同基质的样品时需充分考虑基质效应,以提高结果的准确性。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提出一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法,该方法可一次性检测乳制品中11种AGEs,包括羧甲基赖氨酸CML、羧乙基赖氨酸CEL、吡咯素pyrraline、戊糖素pentosidine、甲基乙醛-羟基咪唑酮异构体MG-H1/MG-H2/MG-H3、精嘧啶argpyrimidine、乙二醛-氢咪唑酮G-H1、乙二醛-赖氨酸二聚体GOLD和甲基乙二醛-赖氨酸二聚体MOLD,以实现对食品中各AGEs的含量进行全面准确分析。
为了实现上述目的,本发明的实施例在一方面提出了一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法,其包括以下步骤:
(1)将乳制品离心脱脂后加入同位素内标品,再加入硼酸盐缓冲液和硼氢化钠溶液,获得混合液;
(2)将混合液进行酸水解,真空离心浓缩至近干,加水复溶,过滤去除杂质,获得处理后的乳制品;
(3)向处理后的乳制品中加入AGEs以制作各种AGEs标准品,将各标准品与其对应的同位素内标品的积分色谱面积比乘以对应的同位素内标品的浓度作为各标准品浓度的函数来绘制标准曲线;
(4)将处理后的乳制品进行UPLC-MS/MS检测,得到乳制品中AGEs的峰面积,代入标准曲线计算得各AGEs的浓度。
根据本发明实施例的一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法,该方法通过同位素内标品与对应标准品的浓度、峰高/面积计算校正因子,然后利用校正因子校正样品因前处理所造成的误差。其前处理步骤简单,易于操作,且杂质较少,并且以乳类基质制作标准曲线,大大减小基质效应对检测的干扰。该方法可一次性检测CML、CEL、pyrraline、pentosidine、MG-H1/3、MG-H2、argpyrimidine、G-H1、GOLD和MOLD 11种AGEs,且11种AGEs得到了理想的分离效果,以实现对样品中各AGEs的含量进行全面准确分析。
另外,根据本发明上述实施例提出的一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法,还可以具有如下附加的技术特征:
可选地,步骤(1)中,同位素内标品包括CML-d4、CEL-d4、GOLD-15N2、MG-H1-d3和G-H1-13C2。
可选地,步骤(1)中,每毫升乳制品中加入10mL~15mL 0.2mol/L pH 9.2的硼酸盐缓冲液和5mL~8mL 1mol/L用0.1moL/L氢氧化钠溶液配制的硼氢化钠溶液,室温条件下孵育2~4h,获得混合液。
可选地,步骤(2)中,酸水解条件为每毫升乳制品中加入20mL~25mL 6mol/L HCl,110℃酸水解24~25h。
可选地,步骤(1)中,所述同位素内标品的浓度为100ng/mL~200ng/mL。
可选地,步骤(1)中,离心脱脂的条件为:转速4500~6000g,温度0~5℃,时间10~15min。
可选地,步骤(2)中,真空离心浓缩条件为:真空度0~1mbar,转速200~300g,温度不高于-20℃。
可选地,步骤(3)中,CML的标准曲线为Y=0.01143X+0.000163,CEL的标准曲线为Y=0.02832X-0.01327,Pyrraline的标准曲线为Y=0.13448X-0.02140,Pentosidine的标准曲线为Y=0.00876X+0.01663,MG-H1/3的标准曲线为Y=0.00878X-0.00238,MG-H2的标准曲线为Y=0.00519X-0.00110,Argpyrimidine的标准曲线为Y=0.05723X+0.05402,G-H1的标准曲线为Y=0.00913X-0.00137,GOLD的标准曲线为Y=0.01109X-0.00384,MOLD的标准曲线为Y=0.04551X-0.0044。
可选地,步骤(4)中,UPLC条件为:色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3 100mm×2.1mm18μm;流动相A:含有0.1%v/v甲酸的水溶液;流动相B:乙腈;柱温:30℃;流速:0.25mL/min;进样量:5μL;采用梯度洗脱的方式洗脱样品,梯度设置为98%A:2%B、95%A:5%B、90%A:10%B、92%A:8%B、98%A:2%B。由此,通过优化色谱柱、流动相、洗脱梯度等液相条件,缩短了检测时间,11种AGEs可在10min内完成检测,极大地提高了检测效率。
可选地,步骤(4)中,三重四极杆质谱条件为:离子源:电离子喷雾;扫描方式:正离子模式;检测模式:MRM;脱溶剂气温度:600℃;离子源温度:120℃;脱溶剂气流速:1000L/h;进样锥气体流速:200L/h;碰撞气体流速:0.20mL/min;毛细管电压:600V;碎裂电压:40V。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是本发明实施例的可以定量的11种AGEs化学式示意图;
图2是本发明实施例的定量超高温瞬时灭菌乳中CML的离子色谱图;
图3是本发明实施例的定量超高温瞬时灭菌乳中CEL的离子色谱图;
图4是本发明实施例的定量超高温瞬时灭菌乳中MG-H1/3的离子色谱图;
图5是本发明实施例的定量超高温瞬时灭菌乳中MG-H2的离子色谱图;
图6是本发明实施例的定量超高温瞬时灭菌乳中G-H1的离子色谱图;
图7是本发明实施例的定量超高温瞬时灭菌乳中GOLD的离子色谱图;
图8是本发明实施例的乳类基质中CML的标准曲线;
图9是本发明实施例的乳类基质中CEL的标准曲线;
图10是本发明实施例的乳类基质中MG-H1/3的标准曲线;
图11是本发明实施例的乳类基质中MG-H2的标准曲线;
图12是本发明实施例的乳类基质中G-H1的标准曲线;
图13是本发明实施例的乳类基质中GOLD的标准曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解,本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤;还应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且,除非另有说明,各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具,而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围,其相对关系的改变或调整,在无实质变更技术内容的情况下,当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案,下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例,然而应当理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反,提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明,并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的仪器和试剂为:
Agilent 1290型超高效液相色谱仪,美国Agilent Technologies
Agilent 6470型三重四极杆质谱仪,美国Agilent Technologies
AUW220D型电子天平,日本Shimadzu Corporation
Allegra X-30R型多功能台式高速离心机,德国Beckman Coulter
ED56型自然对流烘箱,德国Binder GmbH
Milli-Q Advantage A10型超纯水仪,美国Bedford
ZLS-2型真空离心浓缩仪,湖南赫西仪器装备有限公司
CML、CEL标准品,美国Cayman Chemical
Pyrraline、pentosidine、MG-H1/3、MG-H2、argpyrimidine、G-H1、GOLD、MOLD、CML-d4、CEL-d4、GOLD-15N2、MG-H1-d3、G-H1-13C2标准品,德国Iris Biotech GmbH
四硼酸钠、硼氢化钠、氢氧化钠、盐酸、甲酸、乙腈,上海阿拉丁生化科技股份有限公司
存储瓶,美国Agilent Technologies
0.22μm滤膜、2.5mL注射器、螺纹管、进样瓶、离心管,生工生物工程(上海)股份有限公司。
下面参考具体实施例,对本发明进行描述,需要说明的是,这些实施例仅仅是描述性的,而不以任何方式限制本发明。
实施例
提取AGEs:
取1mL超高温瞬时灭菌牛乳于1.5mL离心管中,在4500g离心15min下脱脂,从离心管的底层取100μL样品于螺纹管中,加入10μL 10μg/mLCML-d4、10μL 10μg/mL CEL-d4、10μL10μg/mL GOLD-15N2、10μL 10μg/mL MG-H1-d3和10μL 10μg/mL G-H1-13C2的同位素内标品以校正误差,再加入1mL 0.2mol/L pH 9.2的硼酸盐缓冲液和0.5mL 1mol/L氢氧化钠溶液配制的硼氢化钠溶液,室温下孵育2h,获得混合液。
向混合液中加入1.5mL 6mol/L HCl,110℃下酸解24h以解离结合态的AGEs,使其变成游离态AGEs;之后,于真空度0.1mbar,转速200g,-20℃下真空离心浓缩至近干后加入5mL超纯水复溶,获得复溶液。
将复溶液过0.22μm滤膜后,得滤液。
采用离子源为电离子喷雾的质谱对食品样品中的目标分析物进行分析,可能会因为色谱洗脱基质组分而导致电离抑制或电离增强,从而影响定量结果。因此通过测量基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率变化(%)对所建立的方法的基质效应水平进行评价,基质效应的水平由以下公式计算:
基质效应(%)=(基质标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率)/基质标准曲线的斜率
基质效应结果负水平(≤10%)表示基质可能抑制质谱信号,而正水平(>10%)表示基质可能增强质谱信号。当基质效应水平保持在-10~10%的范围内时,在目标分析物的分析过程中可以被认为没有基质效应。
制作标准曲线:
用5μg/mL CML、5μg/mL CEL、5μg/mL pyrraline、5μg/mL pentosidine、5μg/mLMG-H1、5μg/mL MG-H2、5μg/mL MG-H3、5μg/mL argpyrimidine、5μg/mL G-H1、5μg/mL GOLD、5μg/mL MOLD配制成每个标准品终浓度为1μg/mL的混合标准品溶液,再用10μg/mL CML-d4、10μg/mL CEL-d4、10μg/mL GOLD-15N2、10μg/mL MG-H1-d3、10μg/mL G-H1-13C2配制成每个内标品终浓度为1μg/mL的混合内标品溶液,最后配制成1mL含0.1μg/mL混合内标品的5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL和500ng/mL混合标准品溶液,基质是上述步骤获得的滤液,标准溶液配制条件如表1。
表1标准溶液配制条件
溶剂标准曲线的标准溶液配制条件是将表1中添加的基质等量替换成超纯水。
将各标准品与其对应同位素内标品的积分色谱峰面积比乘以每个相应同位素内标品的浓度(Y)作为标准品浓度(X)的函数来绘制标准曲线,得到方程。如图8-图13所示。CML的标准曲线为Y=0.01143X+0.000163,CEL的标准曲线为Y=0.02832X-0.01327,pyrraline的标准曲线为Y=0.13448X-0.02140,pentosidine的标准曲线为Y=0.00876X+0.01663,MG-H1/3的标准曲线为Y=0.00878X-0.00238,MG-H2的标准曲线为Y=0.00519X-0.00110,argpyrimidine的标准曲线为Y=0.05723X+0.05402,G-H1的标准曲线为Y=0.00913X-0.00137,GOLD的标准曲线为Y=0.01109X-0.00384,MOLD的标准曲线为Y=0.04551X-0.0044。
根据基质效应公式计算得到基质效应水平结果。CML的基质效应为-3.2%,CEL的基质效应为-2.6%,pyrraline的基质效应为-1.7%,pentosidine的基质效应为-5.4%,MG-H1/3的基质效应为-4.8%,MG-H2的基质效应为-2.9%,argpyrimidine的基质效应为-3.5%,G-H1的基质效应为-2.8%,GOLD的基质效应为-1.7%,MOLD的基质效应为-4.1%。
UPLC-MS/MS检测:
UPLC条件:
色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3(100mm×2.1mm 18μm);
流动相A:含有0.1%(v/v)甲酸的水溶液;
流动相B:乙腈;
柱温:30℃;
流速:0.25mL/min;
进样量:5μL;
梯度洗脱如表2;
表2梯度洗脱程序
采用上述的梯度洗脱使CML、CEL、pyrraline、pentosidine、MG-H1/3、MG-H2、argpyrimidine、G-H1、GOLD、MOLD具有极短的检测时长和极好的分离效果,各物质的保留时间分别为4.32min、4.92min、5.67min、8.64min、6.22min、7.29min、5.61min、8.12min、8.33min,有利于提高分析定量的准确度和精确性;而且在此洗脱梯度下,分析物保留值适宜且峰形较好。
三重四极杆质谱条件:
离子源:电离子喷雾;
扫描方式:正离子模式;
检测模式:MRM;
脱溶剂气温度:600℃;
离子源温度:120℃;
脱溶剂气流速:1000L/h;
进样锥气体流速:200L/h;
碰撞气体流速:0.20mL/min;
毛细管电压:600V;
碎裂电压:40V;
MRM质谱参数如表3:
表3 MRM质谱参数
表中定量离子对标注“*”。
将处理后的样品进行UPLC-MS/MS检测,检测模式为MRM,得到样品中AGEs的峰面积,求得样品中AGEs浓度。
结果如图2-图7所示,超高温瞬时灭菌乳中CML、CEL、MG-H1/3、MG-H2、G-H1、GOLD的离子色谱峰,根据标准曲线分别求得CML浓度为0.555μg/mL,CEL浓度为0.240μg/mL,MG-H1/3浓度为19.917μg/mL,MG-H2浓度为154.239μg/mL,G-H1浓度为8.708μg/mL,GOLD浓度为1.346μg/mL。其余AGEs的浓度均低于仪器的定量限。
综上,根据本发明的实施例,可对食品中各AGEs的含量进行全面准确分析。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种检测乳制品中多种晚期糖基化终末产物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将乳制品离心脱脂后加入同位素内标品,再加入硼酸盐缓冲液和硼氢化钠溶液,获得混合液;
(2)将混合液进行酸水解,真空离心浓缩至近干,加水复溶,过滤去除杂质,获得处理后的乳制品;
(3)向处理后的乳制品中加入AGEs以制作各种AGEs标准品,将各标准品与其对应的同位素内标品的积分色谱面积比乘以对应的同位素内标品的浓度作为各标准品浓度的函数来绘制标准曲线;
(4)将处理后的乳制品进行UPLC-MS/MS检测,得到乳制品中AGEs的峰面积,代入标准曲线计算得各AGEs的浓度。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,同位素内标品包括CML-d4、CEL-d4、GOLD-15N2、MG-H1-d3和G-H1-13C2。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,每毫升乳制品中加入10mL~15mL0.2mol/L pH 9.2的硼酸盐缓冲液和5mL~8mL 1mol/L用0.1moL/L氢氧化钠溶液配制的硼氢化钠溶液,室温条件下孵育2~4h,获得混合液。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,酸水解条件为每毫升乳制品中加入20mL~25mL 6mol/L HCl,110℃酸水解24~25h。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述同位素内标品的浓度为100ng/mL~200ng/mL。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,离心脱脂的条件为:转速4500~6000g,温度0~5℃,时间10~15min。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,真空离心浓缩条件为:真空度0~1mbar,转速200~300g,温度不高于-20℃。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,CML的标准曲线为Y=0.01143X+0.000163,CEL的标准曲线为Y=0.02832X-0.01327,pyrraline的标准曲线为Y=0.13448X-0.02140,pentosidine的标准曲线为Y=0.00876X+0.01663,MG-H1/3的标准曲线为Y=0.00878X-0.00238,MG-H2的标准曲线为Y=0.00519X-0.00110,argpyrimidine的标准曲线为Y=0.05723X+0.05402,G-H1的标准曲线为Y=0.00913X-0.00137,GOLD的标准曲线为Y=0.01109X-0.00384,MOLD的标准曲线为Y=0.04551X-0.00447。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,UPLC条件为:色谱柱:WatersACQUITY HSS T3 100mm×2.1mm 18μm;流动相A:含有0.1%v/v甲酸的水溶液;流动相B:乙腈;柱温:30℃;流速:0.25mL/min;进样量:5μL;采用梯度洗脱的方式洗脱样品,梯度设置为98%A:2%B、95%A:5%B、90%A:10%B、92%A:8%B、98%A:2%B。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,三重四极杆质谱条件为:离子源:电离子喷雾;扫描方式:正离子模式;检测模式:MRM;脱溶剂气温度:600℃;离子源温度:120℃;脱溶剂气流速:1000L/h;进样锥气体流速:200L/h;碰撞气体流速:0.20mL/min;毛细管电压:600V;碎裂电压:40V。
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