CN103267819A

CN103267819A - 一种衍生化法分析烟草糖苷的方法

Info

Publication number: CN103267819A
Application number: CN2013101241439A
Authority: CN
Inventors: 向章敏; 蔡凯; 耿召良; 周淑平; 葛永辉; 张婕
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2013-08-28

Abstract

本发明公开了一种衍生化法分析烟草糖苷的方法，采用衍生化试剂N-甲基双(三氟乙酰胺)直接对提取净化后的烟草糖苷进行衍生化，然后利用气质联用仪进行定性定量分析，具有设计简单、重现性好、准确度高、分析速度快等特点，适合不同类型烟草中多种糖苷成分的同时检测。

Description

一种衍生化法分析烟草糖苷的方法

技术领域

本发明属于烟草化学分析领域，具体涉及了一种衍生化法分析烟草糖苷的方法。

背景技术

糖苷是单糖或低聚糖的半缩醛羟基和另一分子中的羟基、氨基、硫羟基等失水而产生的化合物，是糖或糖的衍生物与配基通过苷键连接形成的化合物。烟草糖苷类物质是烟草在生长发育过程中形成的次级代谢产物，它可以通过自身酶解释放出游离态的香气成分。糖苷还可以经过高温加热或燃烧裂解释放出具有香气香味的化合物，从而改善卷烟烟气的香气质，增加香气量。此外，糖苷本身也能提供芳香、甜及典型烟草本香的吃味。所以糖苷类化合物对烟草的品质及风格特征具有重要影响。

烟叶中糖苷的分析常采用色谱方法进行分析，目前，酸解或酶解-气相色谱-质谱联用（GC-MS）及液相色谱-质谱联用法（LC-MS）为主要的分析方法。酸解主要是在加热和酸性条件下，将糖苷键断裂，释放出游离态香气成分及对应的糖残基。尽管酸解具有简单、易操作及易对分离的化合物定性等特点，但糖苷在酸解时，其糖苷配基(香气物质部分)常常会产生重排，导致检测的物质不是烟草中实际存在的成分，从而产生错误的判断。此外，该方法对糖残基的组成也无法得知。酶解是利用糖苷酶的专一及高效性，用对应的糖苷酶把糖苷键水解，从而释放出对应的糖苷配基及糖残基。酶解糖苷结合态香气成分不会产生重排，能够准确的鉴定对应的糖苷配基，对糖苷的鉴定有很大的帮助，但糖苷酶水解糖苷的程度受到糖苷配基结构的影响，导致不同结构的糖苷在相同的酶解条件下酶解程度不同，从而产生一定的误差。此外，酶解耗时较长，不利于大批样品的检测。液相色谱-质谱联用测定烟草中的糖苷香气成分也有少量的报道。液相色谱最大的优点是糖苷提取物无需酸解、酶解或衍生化，直接进样分析即可。尽管液相色谱-质谱前处理条件简单，但结构确认方面存在很大的缺陷，此外，液相色谱对结构非常类似的糖苷也无法很好的分离，分离度比气相色谱较低。

本发明针对现有分析烟草糖苷成分技术中存在的不足进行改进，专门设计了一种衍生化试剂直接对提取净化后的烟草糖苷成分进行衍生化，然后利用气质联用仪进行定性定量分析，可用于烟草中多种糖苷成分的分析与品质评价。该方法设计简单实用，能同时对不同类型烟草中多种糖苷成分进行分析。该方法比现有的方法相比，烟草糖苷配基不会受到外界条件（如酸解）的影响而产生重排反应，同时不同糖苷成分在相同的衍生化条件下其衍生化效率一致，保证了不同糖苷同时分析的一致性。同时该方法具有设计简单、重现性好、准确度高、分析速度快等特点，适合不同类型烟草中多种糖苷成分的同时检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：针对现有技术中的酸解处理方法存在重排反应，而酶水解糖苷的程度受到糖苷配基结构的影响，导致不同结构的糖苷在相同的酶解条件下酶解程度不同，会产生一定的实验误差等不足，本发明设计了一种衍生化试剂直接对提取净化后的烟草糖苷成分进行衍生化，然后利用气质联用仪进行定性定量分析，可用于烟草中多种糖苷成分的分析，从而对烟草品质进行客观评价，本发明具有设计简单、重现性好、准确度高、分析速度快等特点，适合不同类型烟草中多种糖苷成分的同时检测。

本发明对烟草中糖苷成分的测定方法包括以下步骤：

（1）提取：称取烟草粉末至具塞三角瓶中，加入甲醇提取液超声，静置后取上层清液过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至近干，待净化；

（2）净化：将上述（1）中的提取液用去离子水将其溶解，将溶解液转移至XAD-2大孔树脂柱中，先用水淋洗，再用***淋洗，收集用乙酸乙酯进行洗脱的洗脱液，洗脱液用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪将其浓缩，待衍生化；

（3）衍生化：将上述（2）净化后的浓缩液转移至色谱瓶中用氮吹仪吹干，同时加入吡啶溶液和N-甲基双(三氟乙酰胺) （MBTFA）衍生化试剂，充分摇匀后在水浴中反应，反应结束后冷却，待进样分析；

（4）用气质联用仪进行定性定量分析，选择质谱的两种电离方式-电子轰击离子源（EI）和负化学离子源(NCI)同时对目标化合物进行定性鉴定，选择内标相对定量法对糖苷化合物进行定量分析。

本发明中选择的气质联用（GC-MS）分析条件：

气相色谱-电子电离-质谱（GC-EI-MS）方法：色谱柱：HP-5MS (60 m×0.25 mmi.d.×0.25 μmd.f.)；进样量：2 μL；不分流；载气：氦气；流速：0.8 mL/min；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度150℃。保持2min，然后以每分钟4℃的速度升高到210℃，保持2 min，再以每分钟5℃的速度升高到280℃，保持30 min；离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70 eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围40-600 aum，溶剂延迟：8.00 min；采集模式：全扫描(Scan)采集。

气相色谱-负化学电离-质谱（GC-NCI-MS）方法：色谱柱：HP-5MS (60 m×0.25 mmi.d.×0.25 μmd.f.)；进样量：2 μL；不分流；载气：氦气；流速：0.8 mL/min；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度150℃；保持2 min，然后以每分钟4℃的速度升高到210℃，保持2 min，再以每分钟5℃的速度升高到280℃，保持30 min；离子源温度：150℃，四级杆温度：150℃；电离能：128 eV，灯丝电流为49.5 μA传输线温度：280℃，甲烷气（99.995%）流量为40 mL/min，全扫描质量数范围100-1050 amu，溶剂延迟：8.00 min；采集模式：全扫描(Scan)采集。

本发明中，所选择的气质联用仪由Agilent提供，选择的旋转蒸发仪由HEIDOLPH提供，选择的氮吹仪由美国Organomation提供。

本发明中选择的衍生化试剂为N-甲基双(三氟乙酰胺)（MBTFA）。

本发明中选择的净化柱为XAD-2大孔树脂柱。

本发明中选择的内标化合物为苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本发明达到的有益效果：通过分析在电子轰击离子源(EI)和负化学离子源（NCI）两种不同离子源作用下的质谱信息，其气质分离效果分别见附图2和附图3，分别对衍生化后的糖基和糖苷配基进行质谱鉴定，鉴定了烟草中16种糖苷化合物的基本结构。解决了现有技术中的酸解处理方法存在重排反应；酶水解糖苷的程度受到糖苷配基结构的影响，导致不同结构的糖苷在相同的酶解条件下酶解程度不同，会产生一定的实验误差等不足。

本发明同时经过平行五次的精密度测试，所分析烟草16种糖苷化合物的稳定性较好，其相对标准偏差（RSD）均低于10%以下，其中除P8、P12、P14糖苷化合物的相对标准偏差（RSD）介于5%-10%之外，其余糖苷化合物的相对标准偏差（RSD）均低于5%以下，表明该方法具有较好的稳定性和重现性。

附图说明：图1 为烟草糖苷类衍生化的化学方程式。

图2 为烟草糖苷衍生化后GC-EI-MS色谱图。

图3 烟草糖苷衍生化后GC- NCI -MS色谱图。

具体实施方式：

本发明通过以下具体实例作进一步描述，但并不限制本发明。

实施例1

（1）前处理

称取2.0000g烟草粉末样品至100 mL具塞三角瓶中，加入250 μg的内标苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，同时加入20 mL的甲醇超声提取30 min，静置15 min后取上层清液过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩至近干。然后用25 mL的去离子水将其溶解，将溶解液转移至XAD-2大孔树脂柱中，先用50 mL水淋洗弃掉，再用50 mL***淋洗弃掉，最后用100 mL乙酸乙酯进洗脱，洗脱液用无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪将其蒸至1 mL，再用氮吹仪将其吹干，同时加入500 μL的吡啶与30 μL的N-甲基双(三氟乙酰胺)（MBTFA）衍生化试剂，充分摇匀后在60℃水浴反应50 min，反应结束后冷却，最后气质联用对样品进行定性定量分析。

（2）仪器的定性及定量分析：

本发明通过单四级杆质谱的两种电离源方式-电子轰击离子源(EI)和负化学离子源（NCI）分别对衍生化后的烟草糖苷成分进行定性分析，并采用内标相对定量法进行定量分析，同时对本方法进行精密度测试（n=5），其分析结果见表1。

气相色谱-电子电离-质谱（GC-EI-MS）分析条件：色谱柱：HP-5MS (60 m×0.25 mmi.d.×0.25 μmd.f.)；进样量：2 μL；不分流；载气：氦气；流速：0.8 mL/min；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度150℃；保持2min，然后以每分钟4℃的速度升高到210℃，保持2 min，再以每分钟5℃的速度升高到280℃，保持30 min；离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70 eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围40-600 aum，溶剂延迟： 8.00 min；采集模式：全扫描(Scan)采集。

气相色谱-负化学电离-质谱（GC-NCI-MS）分析条件：色谱柱：HP-5MS (60 m×0.25 mmi.d.×0.25 μmd.f.)；进样量：2 μL；不分流；载气：氦气；流速：0.8 mL/min；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度150℃。保持2 min，然后以每分钟4℃的速度升高到210℃，保持2 min，再以每分钟5℃的速度升高到280℃，保持30 min；离子源温度：150℃，四级杆温度：150℃；电离能：128 eV，灯丝电流为49.5 μA传输线温度：280℃，甲烷气（99.995%）流量为40 mL/min，全扫描质量数范围100-1050 amu，溶剂延迟：8.00 min；采集模式：全扫描(Scan)采集。

采用本发明方法得到的烟草中16种糖苷化合物的质谱信息和精密度数据，相对标准偏差 (RSD) 测量次数为五次，具体数据见表1。

Figure 2013101241439100002DEST_PATH_IMAGE004

Figure 2013101241439100002DEST_PATH_IMAGE006

实施例2

采用本发明实施例1的方法分别选择了初烤烟、香料烟和晒烟进行糖苷成分含量的检测分析。初烤烟产地为贵州贵定，香料烟产地为云南凉山，晒烟产地为贵州剑河，均为中部叶片，所用样品均为未加工前的烟叶叶片，烟叶进过复烤或加工处理后，糖苷的含量有可能会有变化。数据均为三次测量平均值，其分析结果见表2：

Claims

1.一种衍生化法分析烟草糖苷的方法，包括以下步骤：

（3）衍生化：将上述（2）净化后的浓缩液转移至色谱瓶中用氮吹仪吹干，同时加入吡啶溶液和N-甲基双(三氟乙酰胺)衍生化试剂，充分摇匀后在水浴中反应，反应结束后冷却，待进样分析；

（4）用气质联用仪进行定性定量分析，选择质谱的两种电离方式-电子轰击离子源和负化学离子源同时对目标化合物进行定性鉴定，选择内标相对定量法对糖苷化合物进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的一种衍生化法分析烟草糖苷的方法，其特征在于：气相色谱-电子电离-质谱分析条件：色谱柱：HP-5MS；进样量：2 μL；不分流；载气：氦气；流速：0.8 mL/min；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度150℃；保持2min，然后以每分钟4℃的速度升高到210℃，保持2 min，再以每分钟5℃的速度升高到280℃，保持30 min；离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70 eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围40-600 aum，溶剂延迟：8.00 min；采集模式：全扫描采集。

3.根据权利要求1所述的一种衍生化法分析烟草糖苷的方法，其特征在于：

气相色谱-负化学电离-质谱分析条件：色谱柱：HP-5MS；进样量：2μL；不分流；载气：氦气；流速：0.8 mL/min；进样口温度：280℃；程序升温：初始温度150℃；保持2 min，然后以每分钟4℃的速度升高到210℃，保持2 min，再以每分钟5℃的速度升高到280℃，保持30 min；离子源温度：150℃，四级杆温度：150℃；电离能：128 eV，灯丝电流为49.5 μA，传输线温度：280℃，甲烷气流量为40 mL/min，全扫描质量数范围100-1050 amu，溶剂延迟：8.00 min；采集模式：全扫描采集。

4.根据权利要求1~3任一项所述的一种衍生化法分析烟草糖苷的方法，其特征在于：内标化合物为苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。