CN115015429A - 一种同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法。本发明属于食品检测领域。本发明的目的是为了解决当前缺少针对黄精中糖基化终末产物进行检测的方法，明确了适合黄精产品中糖基化终产物的代表产物羧甲基赖氨酸及羧乙基赖氨酸的同步检测方法。本发明的同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法包括：黄精产品前处理、衍生化反应、固相萃取、标准曲线绘制以及含量测定，使用UPLC‑MS/MS在一定条件下，对黄精在加工过程中产生的羧甲基赖氨酸及羧乙基赖氨酸进行同步检测。
Description
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及一种同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法。
背景技术
由于黄精具有较强的刺激性，不宜直接服用，通常采用不同的加工方式以去除其刺激性。黄精富含多糖类成分，在高温加工中极容易发生糖基化反应，生成的糖基化终末产物会诱导糖尿病等疾病，与黄精多糖治疗二型糖尿病的功能背道而驰。
目前，针对糖基化终末产物的检测方法多集中在乳制品、水产品以及油炸食品领域，由于检测时针对不同种类的待测物的前处理方法不同，而前处理方法涉及到原始待测物中糖基化终末产物的含量的保留率，进而影响检测方法的准确性，当前，还没有针对黄精中糖基化终末产物进行检测的方法，因此，开发一种同步检测晚期糖基化终末产物的技术手段，用于检测黄精产品中主要的糖基化中末产物羧甲基赖氨酸及羧乙基赖氨酸，解决现有手段检测不精准，效率低的问题显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决当前缺少针对黄精中糖基化终末产物进行检测的方法，以及现有手段检测不精准，效率低的技术问题，明确了适合黄精产品中糖基化终产物的代表产物羧甲基赖氨酸及羧乙基赖氨酸的同步检测方法。
本发明的一种同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法按以下步骤进行：
步骤1：将黄精粉碎过筛，然后将黄精粉与正己烷混合，洗脱3-5次，再加入四硼酸钠溶液进行还原反应，然后采用Sevag溶液进行洗脱，向沉淀物中加入盐酸，在100-120℃下孵育20-24h，过滤得到水解液；
步骤2：向水解液中加入CML-d4和CEL-d4的混合同位素内标物混匀，然后调节pH至8.0，纯水稀释5倍后，加入乙腈溶液和与内标物等量的四硼酸钠溶液混匀，混合过程中再次加入乙腈溶液，混匀后静置10min，然后加入甲酸终止反应，得到衍生液；
步骤3：将衍生液经甲醇活化和甲酸溶液平衡，然后通过SPE柱进行固相萃取，得到待测液；
步骤4：绘制标准曲线；
步骤5：采用UPLC-MS/MS对待测液中晚期糖基化终末产物进行检测，根据标准曲线计算实际含量。
进一步限定，步骤1中黄精由鲜黄精除杂、洗净、切片，然后重复隔水蒸制和干燥9次得到，每蒸制2h，100℃干燥3h。
进一步限定，步骤1中黄精粉的质量与正己烷的体积比为3g：(20-30)mL。
进一步限定，步骤1中黄精粉的质量与四硼酸钠溶液的体积比为1g：(10-20)mL，四硼酸钠溶液浓度为0.1-0.3mol/L。
进一步限定，步骤1中Sevag溶液为氯仿和正丁醇按4:1的体积比的混合液。
进一步限定，步骤1中沉淀物的质量与盐酸的体积比为1g：(15-25)mL，盐酸浓度为5-7mol/L。
进一步限定，步骤2中水解液与内标物体积比为1：(0.15-0.25)，内标物中CEL-d4的浓度为0.7-0.9μg/mL。
进一步限定，步骤2中第一次加入的乙腈溶液与水解液的体积比为(0.4-0.6)：1，四硼酸钠溶液的质量浓度为4-6％，再次加入的乙腈溶液与水解液的体积比为(0.1-0.3)：1。
进一步限定，步骤2中甲酸与水解液的体积比为(0.004-0.006)：1。
进一步限定，步骤3中甲醇与衍生液的体积比为1：(2-4)，甲酸溶液与衍生液的体积比为1：(2-4)，甲酸溶液的体积浓度为0.4-0.6％。
进一步限定，步骤3中通过SPE柱进行固相萃取的过程为：以0.8-1.2mL/min的流速通过SPE柱，然后用20％的乙腈溶液淋洗，真空抽干后使用二氯甲烷淋洗，再真空抽干，然后以氨水/甲醇溶液洗脱并收集洗脱液，洗脱液氮吹，浓缩干燥，最后用乙腈溶液重溶，旋涡混匀，氨水/甲醇溶液中氨水、甲醇的体积比5：95。
进一步限定，步骤4绘制标准曲线的具体过程为：(1)将羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品各10.0mg用超纯水配成质量浓度为100μg/mL的混合标准品储备液，-20℃条件下储存；(2)用80％的乙腈溶液梯度稀释，分别得到质量浓度为2、4、6、8、10μg/mL的羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品溶液，按液相色谱条件进样，每个浓度平行进样三次；(3)以标准品浓度为横坐标，峰面积的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
进一步限定，步骤5中液相色谱-串联质谱检测条件为：
液相色谱条件：色谱柱：Waters cortecs HILIC(2.1×100mm,1.6μm)，流速0.4mL/min，柱温35℃，进样量3μL，流动相A为0.4％甲酸-乙腈，B为50mmol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱程序：0-3min，60-80％A、3-3.5min，50-60％A、3.5-4.5min，50％A、4.5-5min，50-80％A、5-7min，80％A；质谱条件：电离方式为ESI+，扫描方式为MRM，毛细管电压为3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气流量1000L/h，碰撞气流量0.20mL/min。
质谱条件：电离方式为ESI+，扫描方式为MRM，毛细管电压为3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气流量1000L/h，碰撞气流量0.20mL/min。
本发明与现有技术相比具有的显著效果：
1)本发明明确了检测黄精产品中羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸含量时黄精前处理的手段，其主要目的为洗脱黄精中多余的蛋白质、脂肪及杂质，避免在检测过程中出现过多的杂峰，以减少对检测结果的影响。
2)本发明中衍生化反应的目的是完成同位素内标，这在目前糖基化终产物检测的技术手段中较为少见，利用待测物与内标物的响应丰度比值进行线性回归，通过对同位素丰度的准确测量，做到对待测物的定量测定，此方法能够有效消除基质的干扰，且不需要对待测物进行定量分离，提高了检测的精准性。
附图说明
图1为实施例1中羧甲基赖氨酸标准曲线图；
图2为实施例1中羧乙基赖氨酸标准曲线图；
图3为实施例1中羧甲基赖氨酸标准品(浓度为2μg/mL)的液相色谱图；
图4为实施例1中羧乙基赖氨酸标准品(浓度为2μg/mL)的液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
下述实施例中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。
本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式的一种同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法按以下步骤进行：
步骤1：将黄精粉碎过筛，然后将黄精粉与正己烷混合，洗脱3-5次，再加入四硼酸钠溶液进行还原反应，然后采用Sevag溶液进行洗脱，向沉淀物中加入盐酸，在100-120℃下孵育20-24h，过滤得到水解液；
步骤2：向水解液中加入CML-d4和CEL-d4的混合同位素内标物混匀，然后调节pH至8.0，纯水稀释5倍后，加入乙腈溶液和与内标物等量的四硼酸钠溶液混匀，混合过程中再次加入乙腈溶液，混匀后静置10min，然后加入甲酸终止反应，得到衍生液；
步骤3：将衍生液经甲醇活化和甲酸溶液平衡，然后通过SPE柱进行固相萃取，得到待测液；
步骤4：绘制标准曲线；
步骤5：采用UPLC-MS/MS对待测液中晚期糖基化终末产物进行检测，根据标准曲线计算实际含量。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤1中黄精由鲜黄精除杂、洗净、切片，然后重复隔水蒸制和干燥9次得到，每蒸制2h，100℃干燥3h。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤1中黄精粉的质量与正己烷的体积比为3g：(20-30)mL，黄精粉的质量与四硼酸钠溶液的体积比为1g：(10-20)mL，四硼酸钠溶液浓度为0.1-0.3mol/L，pH＝9.2，Sevag溶液为氯仿和正丁醇按4:1的体积比的混合液，沉淀物的质量与盐酸的体积比为1g：(15-25)mL，盐酸浓度为5-7mol/L。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤2中水解液与内标物体积比为1：(0.15-0.25)，内标物中CEL-d4的浓度为0.7-0.9μg/mL。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤2中第一次加入的乙腈溶液与水解液的体积比为(0.4-0.6)：1，四硼酸钠溶液的质量浓度为4-6％，pH＝9.0，再次加入的乙腈溶液与水解液的体积比为(0.1-0.3)：1。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤2中甲酸与水解液的体积比为(0.004-0.006)：1。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤3中甲醇与衍生液的体积比为1：(2-4)，甲酸溶液与衍生液的体积比为1：(2-4)，甲酸溶液的体积浓度为0.4-0.6％。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤3中通过SPE柱进行固相萃取的过程为：以0.8-1.2mL/min的流速通过SPE柱，然后用20％的乙腈溶液淋洗，真空抽干5min后使用二氯甲烷淋洗，再真空抽干5min，然后以氨水/甲醇溶液洗脱并收集洗脱液，洗脱液氮吹，浓缩干燥，最后用乙腈溶液重溶，旋涡混匀，氨水/甲醇溶液中氨水、甲醇的体积比5：95。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤4绘制标准曲线的具体过程为：(1)将羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品各10.0mg用超纯水配成质量浓度为100μg/mL的混合标准品储备液，-20℃条件下储存；(2)用80％的乙腈溶液梯度稀释，分别得到质量浓度为2、4、6、8、10μg/mL的羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品溶液，按液相色谱条件进样，每个浓度平行进样三次；(3)以标准品浓度为横坐标，峰面积的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤5中液相色谱-串联质谱检测条件为：液相色谱条件：色谱柱：Waters cortecs HILIC色谱柱(2.1×100mm,1.6μm)，流速0.4mL/min，柱温35℃，进样量3μL，流动相A为0.4％甲酸-乙腈，B为50mmol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱程序：0-3min，60-80％A、3-3.5min，50-60％A、3.5-4.5min，50％A、4.5-5min，50-80％A、5-7min，80％A；质谱条件：电离方式为ESI+，扫描方式为MRM，毛细管电压为3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气流量1000L/h，碰撞气流量0.20mL/min。质谱条件：电离方式为ESI+，扫描方式为MRM，毛细管电压为3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气流量1000L/h，碰撞气流量0.20mL/min。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
实施例1、本实施例的一种同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法按以下步骤进行：
步骤1的具体过程如下：
S1：取鲜黄精除杂、洗净、切片，然后隔水蒸制2h，取出晾干，然后于100℃烘箱中干燥3h，重复隔水蒸制和干燥9次，得到黄精产品；
S2：将黄精用打磨机粉碎，过60目筛，然后取10g黄精粉与100mL正己烷混合，洗脱3次；
S3：取3g步骤S2处理后的黄精粉末，加入45mL浓度为0.2mol/L的四硼酸钠溶液进行还原反应，还原12h；
S4：采用Sevag溶液(氯仿：正丁醇v：v＝4:1)对S3还原后黄精粉末进行洗脱，弃去上清液，收集沉淀物，重复洗脱3次，然后向沉淀物中加入15mL浓度为6mol/L的盐酸，在110℃下孵育24h，过滤得到水解液；
步骤2：向4mL水解液中加入800μL CML-d4和CEL-d4的混合同位素内标物混匀，内标物中CEL-d4的浓度为0.8μg/mL，然后用50％氢氧化钾溶液调节pH至8.0，纯水稀释5倍后，加入2mL乙腈溶液和800μL质量浓度为5％的四硼酸钠溶液混匀，混合过程中再次加入800μL乙腈溶液，混匀后静置10min，然后加入20μL甲酸终止衍生反应，得到衍生液；
步骤3：
S1：将1mL衍生液经3mL甲醇活化和3mL体积浓度为0.5％的甲酸溶液平衡；
S2：通过SPE柱进行固相萃取，以1mL/min的流速通过SPE柱，然后用20％的乙腈溶液淋洗，真空抽干5min后使用二氯甲烷淋洗，再真空抽干5min，然后以氨水/甲醇(氨水：甲醇v：v＝5：95)溶液洗脱并收集洗脱液，洗脱液氮吹，浓缩干燥，最后按照1:2的体积比用50％乙腈溶液重溶，旋涡混匀，得到待测液；
步骤4：绘制标准曲线的具体过程为：
(1)将羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品各10.0mg用超纯水配成质量浓度为100μg/mL的混合标准品储备液，-20℃条件下储存；
(2)用80％的乙腈溶液梯度稀释，分别得到质量浓度为2、4、6、8、10μg/mL的羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品溶液，按步骤5中液相色谱条件进行检测，每个浓度平行进样三次；液相色谱条件：色谱柱：Waters cortecs HILIC色谱柱(2.1×100mm,1.6μm)，流速0.4mL/min，柱温35℃，进样量3μL，流动相A为0.4％甲酸-乙腈，B为50mmol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
(3)以标准品浓度为横坐标(X)，峰面积的平均值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线(如图1-2所示)，计算回归方程，得到羧甲基赖氨酸标准曲线的回归方程为Y＝36.7327X-5.17226，R2为0.997，羧乙基赖氨酸的回归方程为Y＝65.2657X-5.40813，R2为0.995，浓度为2μg/mL的羧甲基赖氨酸标准品液相色谱图见图3，浓度为2μg/mL的羧乙基赖氨酸标准品液相色谱图见图4。
步骤5：采用UPLC-MS/MS对待测液中晚期糖基化终末产物进行检测，根据标准曲线计算实际含量；
液相色谱条件：色谱柱：Waters cortecs HILIC色谱柱(2.1×100mm,1.6μm)，流速0.4mL/min，柱温35℃，进样量3μL，流动相A为0.4％甲酸-乙腈，B为50mmol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱程序见表1。
质谱条件：电离方式为ESI+，扫描方式为MRM，毛细管电压为3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气流量1000L/h，碰撞气流量0.20mL/min，质谱检测参数设定表和待测物性能指标表见表2-3。
表2质谱检测参数设定表
表3性能指标表
根据检测分别得到羧甲基赖氨酸及羧乙基赖氨酸的色谱峰面积为12％、0.2768％，带入回归方程，计算得到黄精中的羧甲基赖氨酸含量为458.59μg/g，羧乙基赖氨酸含量为12.66μg/g。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，鉴于本发明所属领域的技术人员可以对上述实施方式进行适当的变更和修改，因此，本发明并不局限于上面所述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种同步检测黄精中晚期糖基化终末产物的方法，其特征在于，该方法按以下步骤进行：
步骤1：将黄精粉碎过筛，然后将黄精粉与正己烷混合，洗脱3-5次，再加入四硼酸钠溶液进行还原反应，然后采用Sevag溶液进行洗脱，向沉淀物中加入盐酸，在100-120℃下孵育20-24h，过滤得到水解液；
步骤2：向水解液中加入CML-d4和CEL-d4的混合同位素内标物混匀，然后调节pH至8.0，纯水稀释5倍后，加入乙腈溶液和与内标物等量的四硼酸钠溶液混匀，混合过程中再次加入乙腈溶液，混匀后静置10min，然后加入甲酸终止反应，得到衍生液；
步骤3：将衍生液经甲醇活化和甲酸溶液平衡，然后通过SPE柱进行固相萃取，得到待测液；
步骤4：绘制标准曲线；
步骤5：采用UPLC-MS/MS对待测液中晚期糖基化终末产物进行检测，根据标准曲线计算实际含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中黄精由鲜黄精除杂、洗净、切片，然后重复隔水蒸制和干燥9次得到，每蒸制2h，100℃干燥3h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中黄精粉的质量与正己烷的体积比为3g：(20-30)mL，黄精粉的质量与四硼酸钠溶液的体积比为1g：(10-20)mL，四硼酸钠溶液浓度为0.1-0.3mol/L，Sevag溶液为氯仿和正丁醇按4:1的体积比的混合液，沉淀物的质量与盐酸的体积比为1g：(15-25)mL，盐酸浓度为5-7mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中水解液与内标物体积比为1：(0.15-0.25)，内标物中CEL-d4的浓度为0.7-0.9μg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中第一次加入的乙腈溶液与水解液的体积比为(0.4-0.6)：1，四硼酸钠溶液的质量浓度为4-6％，再次加入的乙腈溶液与水解液的体积比为(0.1-0.3)：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中甲酸与水解液的体积比为(0.004-0.006)：1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中甲醇与衍生液的体积比为1：(2-4)，甲酸溶液与衍生液的体积比为1：(2-4)，甲酸溶液的体积浓度为0.4-0.6％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中通过SPE柱进行固相萃取的过程为：以0.8-1.2mL/min的流速通过SPE柱，然后用20％的乙腈溶液淋洗，真空抽干后使用二氯甲烷淋洗，再真空抽干，然后以氨水/甲醇溶液洗脱并收集洗脱液，洗脱液氮吹，浓缩干燥，最后用乙腈溶液重溶，旋涡混匀，氨水/甲醇溶液中氨水、甲醇的体积比5：95。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4绘制标准曲线的具体过程为：(1)将羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品各10.0mg用超纯水配成质量浓度为100μg/mL的混合标准品储备液，-20℃条件下储存；(2)用80％的乙腈溶液梯度稀释，分别得到质量浓度为2、4、6、8、10μg/mL的羧甲基赖氨酸和羧乙基赖氨酸标准品溶液，按液相色谱条件进样，每个浓度平行进样三次；(3)以标准品浓度为横坐标，峰面积的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5中液相色谱-串联质谱检测条件为：液相色谱条件：色谱柱：Waters cortecs HILIC，流速0.4mL/min，柱温35℃，进样量3μL，流动相A为0.4％甲酸-乙腈，B为50mmol/L甲酸铵溶液，梯度洗脱程序：0-3min，60-80％A、3-3.5min，50-60％A、3.5-4.5min，50％A、4.5-5min，50-80％A、5-7min，80％A；质谱条件：电离方式为ESI+，扫描方式为MRM，毛细管电压为3.0kV，离子源温度150℃，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气流量1000L/h，碰撞气流量0.20mL/min。
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