CN104965040B - 乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法 - Google Patents
乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为一种乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法，同位素稀释高效液相色谱串联离子阱质谱法，检测乳及乳制品中游离态与蛋白结合态羧甲基赖氨酸。本发明避免了离子对试剂的使用而不需要任何衍生化前处理步骤，且有高效、精确、灵敏度高、重现性好、线性范围宽的特点，在分析乳及乳制品中游离态和蛋白结合态羧甲基赖氨酸含量方面有其独到之处，能够快速、准确的对乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸进行定性、定量分析，可非常好的应用于乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测分析技术领域，具体涉及一种同位素稀释高效液相色谱串联离子阱质谱法，检测乳及乳制品中游离态与蛋白结合态羧甲基赖氨酸。
背景技术
食品加工过程中，美拉德反应易产生以糖基化终产物(AGEs)为代表的有害物。羧甲基赖氨酸作为一种结构明确的AGEs标志物，在食品中广泛存在。
赖氨酸具有ε-氨基，很容易成为高反应活性的羰基靶点，因此富含赖氨酸的食品及生物组织更易发生美拉德反应。而乳制品作为一种富含蛋白质的食品，不仅赖氨酸含量丰富，还原性的乳糖含量也颇高(乳糖比葡萄糖和麦芽糖两种还原糖更容易与赖氨酸反应生成羧甲基赖氨酸)。众多研究表明，牛奶及奶粉在热处理加工过程中因Maillard反应产生的羧甲基赖氨酸远远高于其它种类食品。
目前国内外还尚无推荐的食品中羧甲基赖氨酸标准检测方法出台。
由于羧甲基赖氨酸的极性大、电离能力强，在一般C18色谱柱上无法保留或保留时间很短。为解决该问题需在流动相中加入离子对试剂如三氟乙酸(TFA)、九氟戊酸(NFPA)。离子对试剂在增加保留时间的同时却抑制了离子化效率，减小了质谱信号相应值，目标物色谱峰的保留时间也不稳定，最终减低了检测方法的灵敏度，不利于定性和定量分析。另一方面由于离子对试剂很难从色谱柱上冲洗干净，对色谱柱产生不可逆的损害，从而大大缩短色谱柱的使用寿命，此外NFPA也对质谱仪器损害较大。为避免离子对试剂的使用，2013年11月3日公布的中国专利CN103293243A利用9-芴甲基氯甲酸酯对羧甲基赖氨酸进行柱前衍生将羧甲基赖氨酸在C18色谱柱上的保留时间延长到了4.95min左右，这却又增加了前处理的复杂程度。2014年3月5日公布的中国专利CN103616466A采用亲水性色谱柱(HILLIC)来代替C18柱检测羧甲基赖氨酸，然而保留时间仅有3.47min，保留效果也并不是非常理想。HILLIC色谱柱使用范围较窄，适用性不强，只针对少部分亲水性较强的化合物具有很好的保留效果，并没有C18柱使用的普遍。
发明内容
本发明提供一种快速、准确的乳及乳制品中游离态与蛋白结合态羧甲基赖氨酸的检测方法，不仅能对乳及乳制品中游离态与蛋白结合态羧甲基赖氨酸进行准确的定性分析，还可以进行定量分析。
一种乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法，其特征在于按如下检测条件进行：
1、样品的前处理：固体乳粉样品准确称取0.1g，加1mL超纯水涡旋混匀制成样品溶液，液态乳制品直接量取1mL；向样品制备液中加入2～3mL正己烷，摇匀后以4000r/min离心10min，弃去正己烷层，重2～3次以彻底除去脂肪，脱脂乳及乳粉可免去该步骤；加入1.5mL0.2mol/L，pH9.4的硼酸钠缓冲液，1mL硼氢化钠溶液，4℃下反应6h；加入两倍于样品体积的60％三氯乙酸溶液，8000r/min，4℃离心10min，分离上清和蛋白质沉淀，分别收集后待进一步处理；向上清中加100μL 0.2μg/mL的D4-羧甲基赖氨酸同位素内标，过SPE柱净化；将上述蛋白沉淀加入4mL 6mol/L的盐酸，通入氮气保护110℃水解24h，将水解液稀释定容至5mL，向水解液中加入100μL 50μg/mL的D4-羧甲基赖氨酸，上固相萃取柱净化；将HiCaptMCX固相萃取柱依次用3mL甲醇，3mL水活化平衡，上样后，再用3mL水，3mL甲醇淋洗，最后用5mL氨水：甲醇＝5:95，v/v的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹吹干后，准确加入1mL超纯水复溶，涡旋混匀后过0.22μm纤维素膜。D4-羧甲基赖氨酸的结构图如图7所示。
2、样品的HPLC检测：HPLC条件为色谱柱为Waters Symmetry C18、150mm×4.5mm、5μm；柱温为25℃；进样量为10μL；流动相选择质量百分数为0.3％甲酸水溶液和甲醇；流动相流速为200μL/min；运行时间：12min；采用梯度洗脱方式进行检测，梯度洗脱方式的步骤为：
0～7分钟：0.3％甲酸水溶液5％，甲醇95％，
7～8分钟：0.3％甲酸水溶液22％，甲醇78％，
8～12分钟：0.3％甲酸水溶液5％，甲醇95％；
3、样品的质谱检测：质谱条件为色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为200μL/min，离子源为电喷雾ESI+模式；鞘气流速为40arb；辅助气流速为10arb；电喷雾电压为4.5kv；毛细管温度为275℃；毛细管电压为16V；透镜电压为45V；载气为氮气；碰撞气为氦气；采用一级质谱全扫描模式检测模式，50～500m/z；二级质谱为选择性检测SRM模式，羧甲基赖氨酸准离子峰为205m/z；特征碎片离子峰为130m/z和80m/z；分离宽度为1.5m/z；碰撞能量25％。
4、检测方法的方法确证：由标准储备液稀释配制质量浓度为0.1～100ng/mL(含内标20ng/mL)和0.25～20μg/mL(含内标5μg/mL)的系列标准溶液，以目标组分峰面积与相应内标峰面积的比值Y对目标组分的质量浓度X，分别绘制自由态和蛋白结合态羧甲基赖氨酸的标准曲线回归方程和相关系数。以加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于3(S/N＝3)对应的质量浓度为方法的检出限(LOD)，S/N＝10对应的质量浓度为方法的定量限(LOQ)。两种状态羧甲基赖氨酸的检测线性方程、线性范围、相关系数(R2)、检出限和定量限。
所述检测方法的线性范围为：游离态的羧甲基赖氨酸0.1～100ng/mL，蛋白结合态的羧甲基赖氨酸0.25～20μg/mL。
所述检测方法的最低检测限为0.03ng/kg，定量限为0.1ng/kg。
所述检测方法用以检测游离态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.1X+0.0417，R2＝0.9997，蛋白结合态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.28X+0.0177，R2＝0.9999。
本发明的有益效果是：本发明避免了离子对试剂的使用而不需要任何衍生化前处理步骤，且有高效、精确、灵敏度高、重现性好、线性范围宽的特点，在分析乳及乳制品中游离态和蛋白结合态羧甲基赖氨酸含量方面有其独到之处。乳及乳制品中羧甲基赖氨酸主要以蛋白结合态形式存在，含量在ppm级，游离态含量在ppb级。为确保两种形态羧甲基赖氨酸在两个数量级上定量准确性，节省内标使用量，本发明采取两条定量曲线的方法，增加了检测的线性范围，提高定量准确性，游离态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.1X+0.0417，R2＝0.9997，蛋白结合态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.28X+0.0177，R2＝0.9999，表明结合态在ppm级，游离态在ppb级，峰面积和进样量呈良好的线性关系。
本发明能够快速、准确的对乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸进行定性、定量分析，可非常好的应用于乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测。
说明书附图
图1羧甲基赖氨酸一级质谱图；
图2为羧甲基赖氨酸二级质谱图；
图3羧甲基赖氨酸标准品离子色谱图；
图4为牛奶样品中游离态羧甲基赖氨酸检测离子色谱图；
图5为牛奶样品中蛋白结合态羧甲基赖氨酸检测离子色谱图；
图6 HiCapt MCX固相萃取柱的回收率柱形图；
图7 D4-羧甲基赖氨酸的分子结构图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案，但不以任何方式限制本发明。
1、样品的前处理：固体乳粉样品准确称取0.1g，加1mL超纯水涡旋混匀制成样品溶液，液态乳制品直接量取1mL；向样品制备液中加入2～3mL正己烷，摇匀后以4000r/min离心10min，弃去正己烷层，重2～3次以彻底除去脂肪，脱脂乳及乳粉可免去该步骤；加入1.5mL0.2mol/L，pH9.4的硼酸钠缓冲液，1mL硼氢化钠溶液，4℃下反应6h；加入两倍于样品体积的60％三氯乙酸溶液，8000r/min，4℃离心10min，分离上清和蛋白质沉淀，分别收集后待进一步处理；向上清中加100μL 0.2μg/mL的D4-羧甲基赖氨酸同位素内标，过SPE柱净化；将上述蛋白沉淀加入4mL 6mol/L的盐酸，通入氮气保护110℃水解24h，将水解液稀释定容至5mL，向水解液中加入100μL 50μg/mL的D4-羧甲基赖氨酸，上固相萃取柱净化；将HiCaptMCX固相萃取柱依次用3mL甲醇，3mL水活化平衡，上样后，再用3mL水，3mL甲醇淋洗，最后用5mL氨水：甲醇＝5:95，v/v的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹吹干后，准确加入1mL超纯水复溶，涡旋混匀后过0.22μm纤维素膜。从图6可以看出MCX混合型阳离子的回收率为104％～115％，表明MCX小柱对羧甲基赖氨酸有很好的吸附净化能力。
2、样品的HPLC检测：HPLC条件为色谱柱为Waters Symmetry C18、150mm×4.5mm、5μm；柱温为25℃；进样量为10μL；流动相选择质量百分数为0.3％甲酸水溶液和甲醇；流动相流速为200μL/min；运行时间：12min；采用梯度洗脱方式进行检测，梯度洗脱方式的步骤为：
0～7分钟：0.3％甲酸水溶液5％，甲醇95％，
7～8分钟：0.3％甲酸水溶液22％，甲醇78％，
8～12分钟：0.3％甲酸水溶液5％，甲醇95％；
3、样品的质谱检测：色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为200μL/min，对保留时间为5.7min左右的峰进行质谱分析，采用电喷雾(ESI)电离，正离子扫描模式，鞘气流速为40arb；辅助气流速为10arb；电喷雾电压为4.5kv；毛细管温度为275℃；毛细管电压为16V；透镜电压为45V；载气为氮气；碰撞气为氦气；采用一级质谱全扫描模式检测模式，扫描范围50～500m/z，得到m/z 205的离子峰；再对m/z 205离子峰进行二级质谱扫描，选择性检测SRM模式，分离宽度为1.5m/z；碰撞能量25％。图1中m/z 205.02为羧甲基赖氨酸准离子峰[M+H]+；图2中m/z 129.87和m/z 83.80为羧甲基赖氨酸二级质谱特征碎片离子。
4、检测方法的方法确证：乳及乳制品中羧甲基赖氨酸主要以蛋白结合态形式存在，含量在ppm级，游离态含量在ppb级。为确保两种形态羧甲基赖氨酸在两个数量级上定量准确性，节省内标使用量，本发明采取两条定量曲线的方法，增加了检测的线性范围，提高定量准确性。
精确称取10.0mg羧甲基赖氨酸和1.0mgD4-羧甲基赖氨酸标准品分别置于10mL棕色容量瓶中，用超纯水溶解定容至刻线，配制成1.0mg/mL的羧甲基赖氨酸标准储备液和0.1mg/mL D4-羧甲基赖氨酸内标储备液。由羧甲基赖氨酸标准储备液稀释制备100μg/mL和1000ng/mL的标准工作液。由D4-羧甲基赖氨酸标准储备液稀释制备50μg/mL和200ng/mL标准工作液。从1000ng/mL羧甲基赖氨酸标准液开始，用移液器准确移取体积，按照倍比梯度稀释的方式得到100、20、10、5、1、0.5、0.1ng/mL的系列标准溶液，各取0.9mL标准溶液于进样瓶中，分别加入0.1mL的200ng/mL D4-羧甲基赖氨酸涡旋混匀，上机测定；从100μg/mL羧甲基赖氨酸标准液开始，用移液器准确量取体积，按照倍比梯度稀释的方式得到20、10、5、2.5、1、0.5、0.25μg/mL的系列标准溶液，各取0.9mL标准溶液于进样瓶中，分别加入0.1mL的50μg/mL D4-羧甲基赖氨酸涡旋混匀，上机测定。按照上述仪器检测条件，以目标组分峰面积与相应内标峰面积的比值Y对目标组分的质量浓度X，分别绘制游离态和蛋白结合态羧甲基赖氨酸的标准曲线回归方程和相关系数。以加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于3对应的质量浓度为方法的检出限，信噪比等于10对应的质量浓度为方法的定量限。两种状态羧甲基赖氨酸的检测线性方程、线性范围、相关系数(R2)、检出限和定量限。以加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于3对应的质量浓度为方法的检出限，信噪比等于10对应的质量浓度为方法的定量限。
所述检测方法的线性范围为：游离态的羧甲基赖氨酸0.1～100ng/mL，蛋白结合态的羧甲基赖氨酸0.25～20μg/mL。
所述检测方法的最低检测限为0.03ng/kg，定量限为0.1ng/kg。
所述检测方法用以检测游离态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.1X+0.0417，R2＝0.9997，蛋白结合态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.28X+0.0177，R2＝0.9999。
可以看出本发明方法检测两种状态的羧甲基赖氨酸线性范围宽、相关性好、检出限和定量限低，表明该发明具有较高的灵敏度。
图3为羧甲基赖氨酸标准品离子色谱图。通过优化好的条件，采用液相质谱联用对羧甲基赖氨酸标准品母离子和选定的子离子色谱图优化效果进行验证，结果如附图3所示。
5、检测方法回收率的测定：处理前按照表一所示添加量分别加入4个不同浓度水平的羧甲基赖氨酸和20μg/kg的D4-羧甲基赖氨酸内标，重复测定3次，计算各加标水平的平均回收率和相对标准偏差(RSD)见表1。由表1知，该发明方法的回收率为104％～115％，RSD小于5.13％，可见本法回收率好，精密度高，能满足乳制品中羧甲基赖氨酸定量检测要求。
图4为牛奶样品中游离态羧甲基赖氨酸检测离子色谱图，对加标的乳制品样品进行游离态和蛋白结合态的羧甲基赖氨酸检测，分离效果好，从图中可以看出在此条件下羧甲基赖氨酸及D4-羧甲基赖氨酸响应良好，无其他杂质干扰。
图5为牛奶样品中蛋白结合态羧甲基赖氨酸检测离子色谱图，对加标的乳制品样品进行游离态和蛋白结合态的羧甲基赖氨酸检测，分离效果好，从图中可以看出在此条件下羧甲基赖氨酸及D4-羧甲基赖氨酸响应良好，无其他杂质干扰。
表1为乳制品中羧甲基赖氨酸检测的加标回收率(n＝3)
表2乳制品中羧甲基赖氨酸检测方法的稳定性
6、检测方法回收率的测定：重复性与精密度：取同一待测样品，于1天内6个不同时间点进行检测，连续监测6天，计算日内差和日间差的RSD，考察方法的稳定性。如表2所示，本发明的日内精密度RSD为4.22％和2.75％，日间精密RSD为10.57％和7.88％，证明方法的稳定性良好，满足定量分析要求。
7、对不同种类的样品按本发明所述方法进行检测，以具体实施步骤1对样品进行前处理，仪器检测液相条件参照实施步骤2，质谱检测条件参照具体实施步骤3，每份样品平行测定三次。结果如表3和表4。
表3不同种类的固体乳粉中游离态和蛋白结合态羧甲基赖氨酸检测结果(n＝3)
表4不同种类液体乳中游离态和蛋白结合态羧甲基赖氨酸检测结果(n＝3)
本发明的有益效果是：本发明避免了离子对试剂的使用而不需要任何衍生化前处理步骤，且有高效、精确、灵敏度高、重现性好、线性范围宽的特点，在分析乳及乳制品中游离态和蛋白结合态羧甲基赖氨酸含量方面有其独到之处。乳及乳制品中羧甲基赖氨酸主要以蛋白结合态形式存在，含量在ppm级，游离态含量在ppb级。为确保两种形态羧甲基赖氨酸在两个数量级上定量准确性，节省内标使用量，本发明采取两条定量曲线的方法，增加了检测的线性范围，提高定量准确性，游离态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.1X+0.0417，R2＝0.9997，蛋白结合态的羧甲基赖氨酸标准曲线Y＝0.28X+0.0177，R2＝0.9999，表明结合态在ppm级，游离态在ppb级，峰面积和进样量呈良好的线性关系。
本发明能够快速、准确的对乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸进行定性、定量分析，可非常好的应用于乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测。
Claims (4)
1.一种乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法，其特征在于按如下检测条件进行：
HPLC条件为色谱柱为Waters Symmetry C18、150mm×4.5mm、5μm；柱温为25℃；进样量为10μL；流动相选择质量百分数为0.3％甲酸水溶液和甲醇；流动相流速为200μL/min；运行时间：12min；采用梯度洗脱方式进行检测，梯度洗脱方式的步骤为：
0～7分钟：0.3％甲酸水溶液5％，甲醇95％，
7～8分钟：0.3％甲酸水溶液22％，甲醇78％，
8～12分钟：0.3％甲酸水溶液5％，甲醇95％；
质谱条件为色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为200μL/min，离子源为电喷雾ESI+模式；鞘气流速为40arb；辅助气流速为10arb；电喷雾电压为4.5kv；毛细管温度为275℃；毛细管电压为16V；透镜电压为45V；载气为氮气；碰撞气为氦气；采用一级质谱全扫描模式检测模式，50～500m/z；二级质谱为选择性检测SRM模式，羧甲基赖氨酸准离子峰为205m/z；特征碎片离子峰为130m/z和80m/z；分离宽度为1.5m/z；碰撞能量25％。
2.根据权利要求1所述的一种乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括样品的前处理，所述样品的前处理方法为：固体乳粉样品准确称取0.1g，加1mL超纯水涡旋混匀制成样品溶液，液态乳制品直接量取1mL；向样品制备液中加入2～3mL正己烷，摇匀后以4000r/min离心10min，弃去正己烷层，重复2～3次以彻底除去脂肪，脱脂乳及乳粉可免去该步骤；加入1.5mL0.2mol/L，pH9.4的硼酸钠缓冲液，1mL硼氢化钠溶液，4℃下反应6h；加入两倍于样品体积的60％三氯乙酸溶液，8000r/min，4℃离心10min，分离上清和蛋白质沉淀，分别收集后待进一步处理；向上清中加100μL 0.2μg/mL的D4-羧甲基赖氨酸同位素内标，过SPE柱净化；将上述蛋白沉淀加入4mL 6mol/L的盐酸，通入氮气保护110℃水解24h，将水解液稀释定容至5mL，向水解液中加入100μL 50μg/mL的D4-羧甲基赖氨酸，上固相萃取柱净化；将HiCapt MCX固相萃取柱依次用3mL甲醇，3mL水活化平衡，上样后，再用3mL水，3mL甲醇淋洗，最后用5mL氨水：甲醇＝5:95，v/v的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹吹干后，准确加入1mL超纯水复溶，涡旋混匀后过0.22μm纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的一种乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法，其特征在于：所述检测方法的线性范围为：游离态的羧甲基赖氨酸0.1～100ng/mL，蛋白结合态的羧甲基赖氨酸0.25～20μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种乳及乳制品中游离态与结合态羧甲基赖氨酸的检测方法，其特征在于：所述检测方法的最低检测限为0.03ng/kg，定量限为0.1ng/kg。
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| CN103293243A (zh) * | 2013-06-03 | 2013-09-11 | 福建省产品质量检验研究院 | 食品中羧甲基赖氨酸成分的检测方法及应用 |
| CN103616466A (zh) * | 2013-11-27 | 2014-03-05 | 上海海洋大学 | 一种羧甲基赖氨酸的检测方法及应用 |
| CN103884787A (zh) * | 2014-02-21 | 2014-06-25 | 华南理工大学 | 一种肽-晚期糖基化终末产物的检测方法 |
| CN103884801A (zh) * | 2014-02-21 | 2014-06-25 | 华南理工大学 | 一种酱油中羧甲基赖氨酸的检测方法 |
| CN104634897A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-20 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 一种检测卷烟主流烟气中晚期糖基化终末产物的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104965040A (zh) | 2015-10-07 |
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