CN104614456B - 一种同时检测血浆中脑心通胶囊主要成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种液相色谱串联质谱法(HPLC‑MS/MS)同时检测血浆样本中脑心通胶囊主要成分芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的方法。所述液相色谱中，流动相由乙腈和体积分数为0.1％的甲酸水溶液组成，采用梯度洗脱。所述质谱采用正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式。同时测定给药脑心通胶囊后，大鼠血浆中这几种主要成分的血药浓度变化情况。方法学考察结果表明所建立的方法符合体内生物样品测定要求，方法灵敏度好，专属性强，稳定、可靠，适宜含量较低物质的检测。

Description

一种同时检测血浆中脑心通胶囊主要成分的方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种同时检测血浆中脑心通胶囊主要成分的方法及其在药代动力学中的应用。

背景技术

脑心通胶囊是由陕西步长制药有限公司独家生产，其国家药品批准文号为国药准字Z20090527。脑心通胶囊是由黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、红花、乳香(制)、没药(制)、鸡血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龙、全蝎、水蛭，十六味中药组成的上市中成药。临床主要用于气虚血滞、脉络瘀阻所致中风中经络，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短；脑梗塞、冠心病心绞痛属上述证候者。文献报道其主要成分为黄芪皂苷类、酚酸类、丹参酮类、黄酮类等，并且黄芪皂苷、酚酸类、丹参酮类成分在片剂中的含量较高。芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA，分别是黄芪、赤芍、丹参、当归、川芎、桃仁、鸡血藤、桑枝中的主要成分，大量文献对其药理活性进行了报道。但还没有文献同时对这几种成分的药代动力学进行报道，对脑心通胶囊药效物质基础研究的文章也未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时检测血浆样本中脑心通胶囊的主要成分，如芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA等成分的方法。并采用该方法对前述脑心通胶囊中的主要成分进行药代动力学研究，以期进一步明确脑心通胶囊的吸收入血成分及其血药浓度变化情况，从而为脑心通胶囊的用药安全、用药效果提供保障。

本发明所提供的方法包括：步骤(1)样品的制备和步骤(2)采用液相色谱串联质谱法进行检测；

步骤(1)样品的制备采用包括以下步骤的方法：

a)向待测血浆样品中加入混合内标溶液、甲酸，并混匀；

b)加入乙腈沉淀蛋白，混匀后静置；

c)离心，收集上清液，氮气吹干，收集干燥物；

d)将得到的干燥物用甲醇复溶，混匀、离心，取上清液。

步骤a)中，所述混合内标溶液中所述内标为绿原酸、栀子苷、番泻苷B、葛根素。所述混合内标溶液具体通过包括下述步骤的方法配制：精密称取绿原酸、栀子苷、番泻苷B、葛根素各1mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容至刻度线，分别配成内标绿原酸、栀子苷、番泻苷B、葛根素的储备液；精密移取各内标储备液适量，用甲醇稀释，配制成含绿原酸、栀子苷、番泻苷B、葛根素均为1.00μg/mL-1的混合内标溶液。

所述步骤a)中，所述待测血浆样品与甲酸的体积比为100:10。

所述步骤b)中，所述静置的时间为2-5min。所述待测血浆样品与乙腈的体积比为1:4。

所述步骤d)中，在离心步骤前还可包括对混匀后的产物进行超声的步骤。

所述超声的时间为30-60s。

步骤a)、b)、c)和d)中，所述混匀均采用涡旋的方式，涡旋的时间均为1-2min。

步骤c)和d)中，所述离心的条件均为18000×g-19000×g离心10-15min。

步骤(2)检测所用液相色谱条件如下：

色谱柱为C18柱；

流动相由乙腈和体积分数为0.1％(v/v)的甲酸水溶液组成；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如下：

0-10min：乙腈的体积分数维持在30％不变；

10-15min：乙腈的体积分数由30％增加至80％；

15-20min：乙腈的体积分数由80％增加至95％；

20-30min：乙腈的体积分数维持在95％不变；

步骤(2)检测所用质谱条件如下：采用API 3200^TMLC/MS/MS液质分析***；

离子源，正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式。

所述液相色谱条件中，色谱柱具体为Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6mm×100mm,1.8μm)；流动相流速为300μL/min；柱温为30℃；进样量为10μL。

所述质谱条件中，所述正负离子快速切换分析模式中，正离子模式参数设置为：气帘气(CUR)：10psi；碰撞气(CAD)：80psi；离子喷雾电压(IS)：5000V；温度(TEM)：500℃；气流1(GS1)：40psi；气流2(GS2)：30psi；加热(Ihe)：On；负离子模式参数设置为：气帘气(CUR)：20psi；碰撞气(CAD)：8psi；离子喷雾电压(IS)：-4500V；温度(TEM)：500℃；气流1(GS1)：30psi；气流2(GS2)：30psi；加热(Ihe)：On。

所述MRM方法的参数如下：

芍药苷：母离子质量数(Q1)：478.6；碎片离子质量数(Q3)：121.1；解簇电压(DP)：-45V；入口电压(EP)：-4V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-30V；碰撞池出口电压(CXP)：-1V；保留时间(Rt)：4.47min；

β蜕皮甾酮：母离子质量数(Q1)：478.9；碎片离子质量数(Q3)：159.0；解簇电压(DP)：-60V；入口电压(EP)：-10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-37V；碰撞池出口电压(CXP)：-1V；保留时间(Rt)：4.48min；

苦杏仁苷：母离子质量数(Q1)：455.8；碎片离子质量数(Q3)：322.8；解簇电压：-50V；入口电压(EP)：-4.5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-20V；碰撞池出口电压(CXP)：-22V；保留时间(Rt)：4.49min；

桑皮苷A：母离子质量数(Q1)：567.0；碎片离子质量数(Q3)：242.6；解簇电压：60V；入口电压(EP)：10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：38V；碰撞池出口电压(CXP)：16V；保留时间(Rt)：4.53min；

咖啡酸：母离子质量数(Q1)：178.9；碎片离子质量数(Q3)：134.9；解簇电压：35V；入口电压(EP)：3.5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：24V；碰撞池出口电压(CXP)：0.5V；保留时间(Rt)：5.28min；

阿魏酸：母离子质量数(Q1)：192.8；碎片离子质量数(Q3)：133.9；解簇电压：-31V；入口电压(EP)：-4V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-23V；碰撞池出口电压(CXP)：-1V；保留时间(Rt)：7.32min；

丹酚酸B：母离子质量数(Q1)：716.5；碎片离子质量数(Q3)：518.5；解簇电压：-55V；入口电压(EP)：-4.5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-25V；碰撞池出口电压(CXP)：-40V；保留时间(Rt)：8.92min。

黄芪甲苷：母离子质量数(Q1)：807.0；碎片离子质量数(Q3)：807.0；解簇电压：140V；入口电压(EP)：10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：50V；碰撞池出口电压(CXP)：55V；保留时间(Rt)：18.79min。

芒柄花黄素：母离子质量数(Q1)：267.0；碎片离子质量数(Q3)：251.8；解簇电压：-16V；入口电压(EP)：-2V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-27V；碰撞池出口电压(CXP)：-5V；保留时间(Rt)：20.43min。

隐丹参酮：母离子质量数(Q1)：297.0；碎片离子质量数(Q3)：254.2；解簇电压：50V；入口电压(EP)：9V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：35V；碰撞池出口电压(CXP)：15V；保留时间(Rt)：25.64min。

丹参酮ⅡA：母离子质量数(Q1)：295.2；碎片离子质量数(Q3)：277.1；解簇电压：58V；入口电压(EP)：10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：27V；碰撞池出口电压(CXP)：21V；保留时间(Rt)：27.53min。

栀子苷(IS)：母离子质量数(Q1)：387.0；碎片离子质量数(Q3)：224.7；解簇电压：-40V；入口电压(EP)：-9V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-15V；碰撞池出口电压(CXP)：-15V；保留时间(Rt)：4.47min。

番泻苷B(IS)：母离子质量数(Q1)：860.6；碎片离子质量数(Q3)：385.9；解簇电压：-87V；入口电压(EP)：-10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-60V；碰撞池出口电压(CXP)：-2V；保留时间(Rt)：4.43min。

葛根素(IS)：母离子质量数(Q1)：414.8；碎片离子质量数(Q3)：266.9；解簇电压：-50V；入口电压(EP)：-9V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-46V；碰撞池出口电压(CXP)：-2V；保留时间(Rt)：4.44min。

绿原酸(IS)：母离子质量数(Q1)：352.8；碎片离子质量数(Q3)：190.9；解簇电压：-33V；入口电压(EP)：-4V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-32V；碰撞池出口电压(CXP)：-2V；保留时间(Rt)：4.45min。

本发明还包括一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量的方法，具体包括下述步骤：

1)标准曲线的制备：取一系列浓度的芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对应的峰面积；以芍药苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芍药苷浓度X为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程；以β蜕皮甾酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以β蜕皮甾酮浓度X为横坐标，制备β蜕皮甾酮的线性回归方程；以苦杏仁苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以苦杏仁苷浓度X为横坐标，制备苦杏仁苷的线性回归方程；以桑皮苷A与内标峰面积比值Y为纵坐标，以桑皮苷A浓度X为横坐标，制备桑皮苷A的线性回归方程；以咖啡酸与内标峰面积比值Y为纵坐标，以咖啡酸浓度X为横坐标，制备咖啡酸的线性回归方程；以阿魏酸与内标峰面积比值Y为纵坐标，以阿魏酸浓度X为横坐标，制备阿魏酸的线性回归方程；以丹酚酸B与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹酚酸B浓度X为横坐标，制备丹酚酸B的线性回归方程；以黄芪甲苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以黄芪甲苷浓度X为横坐标，制备黄芪甲苷的线性回归方程；以芒柄花黄素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芒柄花黄素浓度X为横坐标，制备芒柄花黄素的线性回归方程；以隐丹参酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以隐丹参酮浓度X为横坐标，制备隐丹参酮的线性回归方程；以丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹参酮ⅡA浓度X为横坐标，制备丹参酮ⅡA的线性回归方程；

2)待测血浆样品中芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量测定：将待测血浆样品按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对应的峰面积；计算芍药苷与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芍药苷的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芍药苷的浓度；计算β蜕皮甾酮与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述β蜕皮甾酮的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中β蜕皮甾酮的浓度；计算苦杏仁苷与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述苦杏仁苷的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中苦杏仁苷的浓度；计算桑皮苷A与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述桑皮苷A的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中桑皮苷A的浓度；计算咖啡酸与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述咖啡酸的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中咖啡酸的浓度；计算阿魏酸与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述阿魏酸的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中阿魏酸的浓度；计算丹酚酸B与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述丹酚酸B的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中丹酚酸B的浓度；计算黄芪甲苷与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述黄芪甲苷的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中黄芪甲苷的浓度；计算芒柄花黄素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芒柄花黄素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芒柄花黄素的浓度；计算隐丹参酮与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述隐丹参酮的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中隐丹参酮的浓度；计算丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述丹参酮ⅡA的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中丹参酮ⅡA的浓度。

本发明所述方法可成功用于脑心通胶囊主要成分(芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA)的药代动力学研究。

所述脑心通胶囊由下列质量份的原料制成：黄芪66重量份、赤芍27重量份、丹参27重量份、当归27重量份、川芎27重量份、桃仁27重量份、红花13重量份、制乳香13重量份、制没药13重量份、鸡血藤20重量份、牛膝27重量份、桂枝20重量份、桑枝27重量份、地龙27重量份、全蝎13重量份、水蛭27重量份组成。将地龙、全蝎，粉碎成细粉；其余黄芪等十四味粉碎成细粉，与地龙、全蝎粉末配研，过筛，混匀，装入胶囊，即得胶囊剂。

本发明建立了沉淀蛋白的大鼠血浆样品处理方法、采用液质联用(LC-ESI-MS/MS)的分析法，同时测定给药脑心通胶囊后，大鼠血浆中芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的血药浓度变化情况，并对其进行方法学考察。结果表明所建立的方法符合体内生物样品测定要求，方法灵敏度好，专属性强，稳定、可靠，适宜含量较低物质的检测。

本发明所建立的HPLC-MS/MS检测血浆样本中脑心通胶囊主要成分芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的方法，具有方法灵敏度好、专属性强、稳定性可靠的特点，具体有以下有益效果：

1、用本发明所建立的HPLC-MS/MS检测血浆样本中脑心通胶囊的主要11个入血的有效物质成分，并选择了栀子苷、番泻苷、葛根素、绿原酸作为内标，测定芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的血药浓度-时间曲线，确定各个成分的药代动力学参数。这些实验结果也进一步揭示脑心通能有效治疗心脑血管疾病的有效物质成分群，证实了中药复方多组分协同治疗疾病的物质基础；其中本发明技术方案选择以阿魏酸、丹酚酸B、、隐丹参酮、丹参酮ⅡA为测定指标成分，现代药理学实验表明，这些成分可以抑制血小板聚集，且能明显改善脑缺血再灌损伤大鼠的神经功能缺陷，其具有抗血栓的作用，这与脑心通具有活血化瘀的功能相类似，这些成果，这也为进一步为脑心通口服给药的药代动力学的研究，奠定坚实的基础，具有重要的指导意义。

2、考察了血浆样品中脑心通胶囊主要成分的专属性验证、精密度、准确度、提取回收率、基质效应、最低定量限及稳定性，方法学结果表明，所测得的11个目标测定化合物及4个内标成分的分离度高，峰形良好，血浆中无内源性物质干扰测定；十一种化合物的最低定量限均从0.075-10ng mL-1这说明，建立的分析方法具有较高灵敏度，可用于血浆中低浓度药物的检测；测定芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的LC-MS/MS分析方法具有较好准确度和精密度，符合生物样品测定精密度要求；血浆样品在2个星期内完成样品测定，各个化合物结果RSD值均符合要求，表明所建立的方法稳定性良好。

3、采用本发明所建立的HPLC-MS/MS检测方法，测定给药大鼠后脑心通胶囊主要成分的血药浓度-时间曲线，结果证实了，大鼠口服脑心通胶囊后，咖啡酸、阿魏酸、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA均能够吸收入血，咖啡酸、阿魏酸、芒柄花黄素有吸收快和消除快，隐丹参酮、丹参酮ⅡA有吸收快和消除较慢等特点；同时随着给药剂量的增加，五种化合物AUC也变大，表明其吸收增加。也进一步阐述了脑心通有效物质成分物质代谢过程，所建立的方法具有灵敏度好、专属性强、稳定、准确、可靠，可适宜含量较低物质的检测。

4、本发明所建立的HPLC-MS/MS检测方法可以一次性检测脑心通胶囊中的多种活性成分的血药浓度数据，且检测结果准确，灵敏度高。

附图说明

图1为测定的血浆样品的色谱图，其中，(A)为空白血浆色谱图；(B)为空白血浆中加入各化合物及内标的色谱图；(C)为大鼠给1.5g/kg脑心通通胶囊后30min的血浆色谱图。

图2为大鼠血浆中咖啡酸的血药浓度-时间曲线。

图3为大鼠血浆中阿魏酸的血药浓度-时间曲线。

图4为大鼠血浆中芒柄花黄素的血药浓度-时间曲线。

图5为大鼠血浆中隐丹参酮的血药浓度-时间曲线。

图6为大鼠血浆中丹参酮ⅡA的血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的脑心通胶囊(批号为20121017)由陕西步长制药有限公司提供。下述实施例中所用的试剂：

乙腈(美国Fisher)，

超纯水(Millipore超纯水净化***制得)，

甲醇(色谱级别，天津市康科德科技有限公司)，

乙酸乙酯(分析纯级别，天津市康科德科技有限公司)，

甲酸(高纯，含量>99.99％，天津市光复精细化工研究所)。

下述实施例中所用的仪器：

液质联用仪：Agilent 1200高效液相色谱仪，API 3200串接四极杆质谱仪；

超纯水器：Millipore公司，Mill-QⅡ型；

高速离心机：美国Sigma公司，3K15；

超低温冰箱：美国Thermo Heto公司，-86℃；

超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，KQ-250E；

氮吹仪：美国Organomation公司，N-EAVPTM111；

十万分之一天平：瑞士Mettler Toledo公司，AX205；

万分之一天平：德国Sartorius公司，BP121S；

旋涡混合器：上海沪西分析仪器厂，XW-80A。

下述实施例中所用的试验动物：

健康雄性大鼠，品系SD，级别SPF级，体重200±20g，购自天津市山川红实验动物科技有限公司。

下述实施例中所用的五种待测物标准品：芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA(中国药品生物制品检定所，纯度＞98％)。

内标：栀子苷、番泻苷B、葛根素、绿原酸(中国药品生物制品检定所，纯度＞98％)。

本研究首先对乙酸乙酯液液萃取的方法进行了优化，但由于待测物极性相差较大，所以部分待测物回收率和基质效应不能满足生物样品分析的要求。

此外考察了乙腈沉淀蛋白的方法，实验在乙腈沉淀蛋白的基础上加入了甲酸，考察了甲酸加入的体积(0，5，10和20)对实验的影响，结果表明，乙腈沉淀蛋白的方法比乙酸乙酯萃取的方法对分析成分的回收率和基质效应更好，当加入10μL甲酸时，样品和乙腈在1:4的比例下沉淀效果较好，甲酸的加入明显改善了分析成分的回收率，方法的准确度较好。故采用乙腈沉淀蛋白对血浆样品进行处理，具有方法简单、成本低等优点。综上所述，本实验选择加入10μL甲酸，采用乙腈进行沉淀蛋白，100％甲醇复溶的方法对血浆样品进行前处理，实现了对测定成分的分离与纯化。

实施例1、血浆样品中脑心通胶囊主要成分分析方法的建立

1.1 LC-MS/MS条件：

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱(4.6mm×100mm,1.8μm)；保护柱为Agilent C18柱(2.1×12.5mm,5μm)；流动相为：A：乙腈，B：水(含体积分数0.1％甲酸)；流速为300μL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；时间为0-30min；

采用梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

质谱条件：采用API 3200^TMLC/MS/MS液质分析***；离子源，正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式；

其中正离子模式：气帘气(CUR)：10psi；碰撞气(CAD)：8psi；离子喷雾电压(IS)：5000V；温度(TEM)：500℃；气流1(GS1)：40psi；气流2(GS2)：30psi；加热(Ihe)：On；负离子模式：气帘气(CUR)：20psi；碰撞气(CAD)：8psi；离子喷雾电压(IS)：-4500V；温度(TEM)：500℃；气流1(GS1)：30psi；气流2(GS2)：30psi；加热(Ihe)：On。

所述MRM方法参数见表2。

表2 化合物质谱参数

1.2 溶液的制备

1.2.1 标准品储备液的制备：精密称取芍药苷1.00mg，β蜕皮甾酮1.00mg，苦杏仁苷1.00mg，桑皮苷A 1.00mg，咖啡酸1.00mg，阿魏酸1.00mg，丹酚酸B 1.00mg，黄芪甲苷1.00mg，芒柄花黄素1.00mg，隐丹参酮1.00mg，丹参酮ⅡA 1.00mg，于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容至刻度线，配成各标准品储备液；

1.2.2 标准品混合溶液的制备：精密移各标准品储备液适量，用甲醇稀释，配制浓度分别为芍药苷2.5-750ng/mL；β蜕皮甾酮5-1500ng/mL；苦杏仁苷10-3000ng/mL；桑皮苷A3-3000ng/mL；咖啡酸3-3000ng/mL；阿魏酸1.5-1500ng/mL；丹酚酸B 10-3000ng/mL；黄芪甲苷10-3000ng/mL；芒柄花黄素0.075-75ng/mL；隐丹参酮0.075-75ng/mL；丹参酮ⅡA0.3-300ng/mL；的系列标准品混合溶液；

1.2.3 内标溶液的配制：精密称取栀子苷1.00mg，番泻苷B 1.00mg，葛根素1.00mg，绿原酸1.00mg，于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容至刻度线，分别配成内标栀子苷、番泻苷B、葛根素、绿原酸的储备液。精密移取各内标储备液适量，用甲醇稀释，配制成含栀子苷1.00μg/mL-1、番泻苷B 1.00μg/mL、葛根素1.00μg/mL、绿原酸1.00μg/mL的混合内标溶液。

1.3 血浆样品预处理

取血浆样品100μL，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸10μL，涡旋1min，再加入乙腈400μL，涡旋1min，静置2min，14000rpm离心10min，取上清液，氮吹至干，取100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，14000rpm离心10min，取上清液5μL进样分析。

1.4 分析方法的确证

所述大鼠血浆中的方法学按照美国FDA生物样品分析方法的指导原则对分析方法的方法学进行考察，方法中的准确度、精密度、稳定性等分别测定了高、中、低三个不同浓度级别的三批次样品。方法准确度中回收率的考察，是在高、中、低三个浓度的3个平行样品完成的；在日内精密度、日间精密度和稳定性考察中，分别平行制备6份供试样品进行分析，实验结果的精密度和准确度以相对标准偏差RSD(％)和准确度(％)表示。其具体包括下述步骤：

1.4.1 方法的专属性验证

在已建立的实验检测条件下，分别制备6只不同批次大鼠的空白血样(不含待分析物和内标)进行分析，检测血浆中内源性物质和其他共洗脱物对目标分析物的干扰程度，结果显示11个目标测定化合物及4个内标成分的分离度高，峰形良好，血浆中无内源性物质干扰测定。结果如图1所示。

图1为测定的血浆样品的血浆色谱图，其中，(A)为空白血浆色谱图；(B)为空白血浆中加入各化合物及内标的色谱图；(C)为大鼠给1.5g/kg脑心通胶囊后30min的血浆色谱图。

1.4.2 血浆样品的标准曲线

取100μL空白血浆，加入混合内标溶液和系列浓度混合标准品溶液各10μL，甲酸10μL，涡旋1min,再加入乙腈400μL，涡旋1min，静置2min，14000rpm离心10min，取上清液，氮吹至干，取100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，18000×g离心10min，取上清液10μL进样测定。以待测物与内标峰面积比值(Y)为纵坐标，以待测物浓度(X)为横坐标，作线性回归方程，计算权重为1/X2。结果如表3所示。

表3 线性范围及最小检测限(n＝3)

由表3可知，r均大于0.9910，十一种化合物的最低定量限均从0.075-10ng/mL，表明所建立的分析方法具有较高灵敏度，可用于血浆中低浓度药物的检测。

1.4.3 方法的精密度与准确度

取100μL空白血浆，按上述血浆样品预处理的操作，配制成含标准品浓度为低、中、高的血浆样品各6份，测定，记录待测化合物峰面积和对应内标峰面积，计算其比值，代入随行标准曲线中计算浓度，得到测得浓度值。精密度为测得浓度的变异值，以RSD表示，准确度用测得的浓度与真实浓度比值的百分数表示，测得浓度为6次结果的mean±SD。连续3天内平行处理、测定3批血浆样品，分别计算批内、批间的精密度和准确度，结果如表4所示。

表4 日内与日间精密度(Intra-precision and Inter-precision,n＝6)

由表4可知，所建立的同时测定芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的LC-MS/MS分析方法具有较好准确度和精密度，符合生物样品测定精密度要求。

1.4.4 提取回收率与基质效应

取空白血浆，加入混合标准品溶液10μL，配制高中低三个浓度水平模拟血浆样品溶液各6份，按所述血浆样品预处理的操作，进样10μL测定；另取空白血浆100μL，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸10μL，涡旋1min，再加入乙腈400μL，涡旋1min，静置2min，18000g离心10min，取上清液，加入高中低三个水平混合标准品溶液10μL，氮吹至干，用100μL甲醇溶液复溶，制备含空白基质的复合标准品溶液，进样10μL测定，记录峰面积；通过前后两者的峰面积百分比计算回收率，结果见表5，三个浓度提取回收率平均值符合生物样品对于提取回收率的要求。

取100μL空白血浆，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸10μL，涡旋1min，再加入乙腈400μL，涡旋1min，静置2min，18000g离心10min，取上清液，加入高中低三个水平混合标准品溶液10μL，氮吹至干，用100μL甲醇复溶，进样10μL测定，记录峰面积；同时用甲醇配制高中低三个水平混合标准品溶液，进样10μL测定，记录峰面积；通过两种方法获得各种化合物峰面积的百分比计算基质效应。结果如表5所示。

表5 提取回收率与基质效应(n＝6)

由表5可知：所有回收率均大于60％，表明所优化的乙腈沉淀蛋白的方法适合于大鼠血浆样品的前处理；芍药苷基质效应虽然在127％-154％之间但很稳定，其他化合物基质效应均在75.3％-115％之间，表明所测的化合物基质效应较小，样品基质和共流出物对所测化合物无影响。

1.4.5 最低定量限(LLOQ)的确定

取空白血浆100μL，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸10μL，涡旋1min，再加入乙腈400μL，涡旋1min，静置2min，14000rpm离心10min，取上清液，氮吹至干，取100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，18000g离心10min，取上清液10μL进样分析。当S/N≥5时浓度确定为最低定量限(LLOQ)，然后制备6份样品，代入随行标准曲线中进行计算其准确度与精密度，测定结果见表3。

1.4.6 血浆样品稳定性考察

取空白血浆100μL，配制成低、中、高三个浓度的标准品血浆样品，分别考察其在室温24h，反复冻融3次和-20℃冻融两个星期的稳定性，结果见表6。

表6 稳定性测定

从表6可知，各个化合物结果RSD值均符合要求，提示本实验样品应在2个星期内完成样品测定，在实验过程中样品的储存、处理相对稳定，对分析无显著性影响。

1.5 讨论

1.5.1 流动相的优化

为达到最佳分离状态，本发明的发明人对流动相的组成进行了优化，采用乙腈-0.1％甲酸水进行梯度洗脱，待测化合物丰度较高，灵敏度增强，分析时间短等优点。

1.5.2 质谱条件的优化

为了提高每个化合物的响应强度及灵敏度，本实验对每个化合物的源参数，质谱参数和MRM分别进行了优化，采用正负同时扫描的方式，每个化合物的相应都达到较理想状态。

1.5.3 内标的选择

使用内标的目的一方面是为了减少样品处理的不平行、药物吸附等对分析结果的影响，另一方面是为了减少质谱检测时因离子化效率的差异产生的误差。应尽可能选择理化性质、色谱行为与待测物相似的物质作为内标，一般多选用分析物的同系物或结构相似物。根据以上原则，我们分别选择了栀子苷、番泻苷、葛根素、绿原酸作为内标。经试验，在本实验确定的条件下，所有内标和待测化合物都保留时间和仪器相应都相对稳定，无内源性物质干扰。因此，我们选用以上内标作为各类待测物的内标。

1.5.4 血浆样品处理方法的考察

为了最大程度的去除蛋白和萃取出待测物，我们对蛋白除去方法、样品和溶剂比例、甲酸的加入体积进行了考察。

实验中发现，采用乙腈蛋白沉淀法比液液萃取的方法对分析成分的回收率和基质效应的效果更好，在以往实验基础上，发现样品和乙腈在1:4的比例下沉淀效果较好，样品回收率较好，加入甲酸和不加入甲酸对样品回收率的有一定的影响。同时本实验考察了甲酸加入的体积(0，5，10和20)对实验的影响，结果表明，当加入10μL甲酸，实验结果较好。经查阅相关文献，考虑到处理效果好、成本低、处理方法简单等优点，故采用乙腈沉淀蛋白方法对血浆样品进行处理。

实施例2、灌胃给药大鼠后脑心通胶囊主要成分的药代动力学

2.1 血浆样品的采集

受试雄性SD大鼠预适应一周，于试验前天晚上禁食不禁水12h，第二天将实验动物随机分为2组，每组8只，分别按0.5g/kg和1.5g/kg剂量灌胃给药，于给药后0.083，0.167，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，8，12和24h眼底静脉丛取血，置于肝素化离心管中，8000g离心10min，取出上层血浆，于-20℃冰箱保存，待测。

2.2 血浆样品预处理

取血浆样品100μL，精密加入内标混合溶液10μL，甲酸10μL，涡旋1min，再加入乙腈400μL，涡旋1min，静置2min，18000g离心10min，取上清液，氮吹干，用100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，18000g离心10min，取上清液10μL进样。

2.3 大鼠血浆样品分析

将所述血浆样品的采集步骤中得到的血浆样品进行预处理，采用实施例1中所建立的LC-MS/MS条件进行测定。最终只在血浆样品中检测到咖啡酸、阿魏酸、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA五个成分。在测定血浆样品时对分析方法进行了质量控制，建立随行标准曲线，并随行高、中、低三个浓度的QC(质控)样品。

血浆样品进行LC-MS分析，以随行的标准曲线计算含量，以时间-血药浓度作图，绘制咖啡酸、阿魏酸、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的血药浓度-时间曲线图。

图2-图6为大鼠血浆中各成分的血药浓度-时间曲线，其中a为大鼠血浆中咖啡酸的血药浓度-时间曲线；b为大鼠血浆中阿魏酸的血药浓度-时间曲线；c为大鼠血浆中芒柄花黄素的血药浓度-时间曲线；d为大鼠血浆中隐丹参酮的血药浓度-时间曲线；e为大鼠血浆中丹参酮ⅡA的血药浓度-时间曲线。

从图2-图6可知，大鼠口服脑心通胶囊后，咖啡酸、阿魏酸、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA均能够吸收入血，咖啡酸、阿魏酸、芒柄花黄素有吸收快和消除快，隐丹参酮、丹参酮ⅡA有吸收快和消除较慢等特点；同时随着给药剂量的增加，五种化合物AUC也变大，表明其吸收增加。

2.4 大鼠给药脑心通胶囊后的药代动力学参数

用DAS 1.0软件处理给药后大鼠的血药浓度-时间数据，根据最小Akaike’sInformation criterion(AIC)信息判断，咖啡酸、阿魏酸、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA药动学模型符合一室开放模型。同时采用统计矩法，计算其主要药代动力学参数，所用药动学软件为DAS Statistics Version 1.0(Mathematical Pharmacology ProfessionalCommittee of China，Shanghai，China)，结果如表7所示。

表7 大鼠给药脑心通胶囊后的各主要成分的药代动力学参数

上述结果表明，本发明所建立的液相色谱串联质谱法检测血浆样本中脑心通胶囊主要成分芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的方法，符合体内生物样品测定要求，方法灵敏度好，专属性强，稳定、可靠，并能应用于脑心通胶囊口服给药后药代动力学。

Claims (4)

1.一种同时检测血浆中脑心通胶囊主要成分的方法，所述脑心通胶囊主要成分包括芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA，所述方法包括：步骤(1)样品的制备和步骤(2)采用液相色谱串联质谱法进行检测；

所述步骤(1)样品的制备采用包括以下步骤的方法：

a)向待测血浆样品中加入混合内标溶液、甲酸，并混匀；所述混合内标溶液中内标为栀子苷、番泻苷B、葛根素和绿原酸；

b)加入乙腈，混匀后静置；

c)离心，收集上清液，氮气吹干，收集干燥物；

d)将得到的干燥物用甲醇复溶，混匀、离心，取上清液；

所述步骤(2)检测所用液相色谱条件如下：

色谱柱为C₁₈柱；

流动相由乙腈和体积分数为0.1％甲酸水溶液组成；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如下：

0-10min：乙腈的体积分数维持在30％不变；

10-15min：乙腈的体积分数由30％增加至80％；

15-20min：乙腈的体积分数由80％增加至95％；

20-30min：乙腈的体积分数维持在95％不变；

所述液相色谱条件中，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈柱，规格为：4.6mm×100mm，填料直径为1.8μm；流动相流速为300μL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；

所述步骤(2)检测所用质谱条件如下：采用API 3200^TMLC/MS/MS液质分析***；离子源，正负离子快速切换分析模式，多反应监测扫描方式；

所述正负离子快速切换分析模式中，正离子模式参数设置为：气帘气(CUR)：10psi；碰撞气(CAD)：8psi；离子喷雾电压(IS)：5000V；温度(TEM)：500℃；气流1(GS1)：40psi；气流2(GS2)：30psi；加热(Ihe)：On；

负离子模式参数设置为：气帘气(CUR)：20psi；碰撞气(CAD)：8psi；离子喷雾电压(IS)：-4500V；温度(TEM)：500℃；气流1(GS1)：30psi；气流2(GS2)： 30psi；加热(Ihe)：On；

所述质谱条件中，所述多反应监测方法参数如下：

芍药苷：母离子质量数(Q1)：478.6；碎片离子质量数(Q3)：121.1；解簇电压(DP)：-45V；入口电压(EP)：-4V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-30V；碰撞池出口电压(CXP)：-1V；保留时间(Rt)：4.47min；

β蜕皮甾酮：母离子质量数(Q1)：478.9；碎片离子质量数(Q3)：159.0；解簇电压(DP)：-60V；入口电压(EP)：-10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-37V；碰撞池出口电压(CXP)：-1V；保留时间(Rt)：4.48min；

苦杏仁苷：母离子质量数(Q1)：455.8；碎片离子质量数(Q3)：322.8；解簇电压：-50V；入口电压(EP)：-4.5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-20V；碰撞池出口电压(CXP)：-22V；保留时间(Rt)：4.49min；

桑皮苷A：母离子质量数(Q1)：567.0；碎片离子质量数(Q3)：242.6；解簇电压：60V；入口电压(EP)：10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：38V；碰撞池出口电压(CXP)：16V；保留时间(Rt)：4.53min；

咖啡酸：母离子质量数(Q1)：178.9；碎片离子质量数(Q3)：134.9；解簇电压：35V；入口电压(EP)：3.5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：24V；碰撞池出口电压(CXP)：0.5V；保留时间(Rt)：5.28min；

阿魏酸：母离子质量数(Q1)：192.8；碎片离子质量数(Q3)：133.9；解簇电压：-31V；入口电压(EP)：-4V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-23V；碰撞池出口电压(CXP)：-1V；保留时间(Rt)：7.32min；

丹酚酸B：母离子质量数(Q1)：716.5；碎片离子质量数(Q3)：518.5；解簇电压：-55V；入口电压(EP)：-4.5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-25V；碰撞池出口电压(CXP)：-40V；保留时间(Rt)：8.92min；

黄芪甲苷：母离子质量数(Q1)：807.0；碎片离子质量数(Q3)：807.0；解簇电压：140V；入口电压(EP)：10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：50V；碰撞池出口电压(CXP)：55V；保留时间(Rt)：18.79min；

芒柄花黄素：母离子质量数(Q1)：267.0；碎片离子质量数(Q3)：251.8；解簇电压：-16V；入口电压(EP)：-2V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-27V；碰撞池出口电压(CXP)：-5V；保留时间(Rt)：20.43min；

隐丹参酮：母离子质量数(Q1)：297.0；碎片离子质量数(Q3)：254.2；解簇电压：50V；入口电压(EP)：9V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：35V；碰撞池出口电压(CXP)：15V；保留时间(Rt)：25.64min；

丹参酮ⅡA：母离子质量数(Q1)：295.2；碎片离子质量数(Q3)：277.1；解簇电压：58V；入口电压(EP)：10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：27V；碰撞池出口电压(CXP)：21V；保留时间(Rt)：27.53min；

栀子苷(IS)：母离子质量数(Q1)：387.0；碎片离子质量数(Q3)：224.7；解簇电压：-40V；入口电压(EP)：-9V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-15V；碰撞池出口电压(CXP)：-15V；保留时间(Rt)：4.47min；

番泻苷B(IS)：母离子质量数(Q1)：860.6；碎片离子质量数(Q3)：385.9；解簇电压：-87V；入口电压(EP)：-10V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-60V；碰撞池出口电压(CXP)：-2V；保留时间(Rt)：4.43min；

葛根素(IS)：母离子质量数(Q1)：414.8；碎片离子质量数(Q3)：266.9；解簇电压：-50V；入口电压(EP)：-9V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-46V；碰撞池出口电压(CXP)：-2V；保留时间(Rt)：4.44min；

绿原酸(IS)：母离子质量数(Q1)：352.8；碎片离子质量数(Q3)：190.9；解簇电压：-33V；入口电压(EP)：-4V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-32V；碰撞池出口电压(CXP)：-2V；保留时间(Rt)：4.45min。

2.一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量的方法，包括下述步骤：

⑴、标准曲线的制备：

取一系列浓度的芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照权利要求1所述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对应的峰面积；

以芍药苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芍药苷浓度X为横坐标，制备 芍药苷的线性回归方程；

以β蜕皮甾酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以β蜕皮甾酮浓度X为横坐标，制备β蜕皮甾酮的线性回归方程；

以苦杏仁苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以苦杏仁苷浓度X为横坐标，制备苦杏仁苷的线性回归方程；

以桑皮苷A与内标峰面积比值Y为纵坐标，以桑皮苷A浓度X为横坐标，制备桑皮苷A的线性回归方程；

以咖啡酸与内标峰面积比值Y为纵坐标，以咖啡酸浓度X为横坐标，制备咖啡酸的线性回归方程；

以阿魏酸与内标峰面积比值Y为纵坐标，以阿魏酸浓度X为横坐标，制备阿魏酸的线性回归方程；

以丹酚酸B与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹酚酸B浓度X为横坐标，制备丹酚酸B的线性回归方程；

以黄芪甲苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以黄芪甲苷浓度X为横坐标，制备黄芪甲苷的线性回归方程；

以芒柄花黄素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芒柄花黄素浓度X为横坐标，制备芒柄花黄素的线性回归方程；

以丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹参酮ⅡA浓度X为横坐标，制备丹参酮ⅡA的线性回归方程；

以隐丹参酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以隐丹参酮浓度X为横坐标，制备隐丹参酮的线性回归方程；

⑵、待测血浆样品中芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量测定：

将待测血浆样品按照权利要求1所述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对应的峰面积；

以芍药苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芍药苷浓度X为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程；

以β蜕皮甾酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以β蜕皮甾酮浓度X为横坐标，制备β蜕皮甾酮的线性回归方程；

以苦杏仁苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以苦杏仁苷浓度X为横坐标，制备苦杏仁苷的线性回归方程；

以桑皮苷A与内标峰面积比值Y为纵坐标，以桑皮苷A浓度X为横坐标，制备桑皮苷A的线性回归方程；

以咖啡酸与内标峰面积比值Y为纵坐标，以咖啡酸浓度X为横坐标，制备咖啡酸的线性回归方程；

以阿魏酸与内标峰面积比值Y为纵坐标，以阿魏酸浓度X为横坐标，制备阿魏酸的线性回归方程；

以丹酚酸B与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹酚酸B浓度X为横坐标，制备丹酚酸B的线性回归方程；

以黄芪甲苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以黄芪甲苷浓度X为横坐标，制备黄芪甲苷的线性回归方程；

以芒柄花黄素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芒柄花黄素浓度X为横坐标，制备芒柄花黄素的线性回归方程；

以丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹参酮ⅡA浓度X为横坐标，制备丹参酮ⅡA的线性回归方程；

以隐丹参酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以隐丹参酮浓度X为横坐标，制备隐丹参酮的线性回归方程。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述待测血浆样品与甲酸的体积比为100:10；

步骤b)中，所述静置的时间为2-5min；所述待测血浆样品与乙腈的体积比为1：4；

步骤a)、b)、c)和d)中，所述混匀均采用涡旋的方式，涡旋的时间均为1-2min；

步骤c)和d)中，所述离心的条件均为18000×g-19000×g离心10-15min。

4.权利要求1或2所述的方法在测定脑心通胶囊中芍药苷、β蜕皮甾酮、苦杏仁苷、桑皮苷A、咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸B、黄芪甲苷、芒柄花黄素、隐 丹参酮、丹参酮ⅡA的药代动力学中的应用。