CN109239224B - 酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属中成药体内代谢研究技术领域，为解决目前酸枣仁入血成分定量分析中HPLC‑UV灵敏度低时间过长，不适合分析血浆中微量成分；LC‑MS/MS仅用于测定单一成分的药动学，不利于中药药动学的研究的问题，提供一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法。用UHPLC‑Q Exactive Orbitrap HR/MS同时定量测定酸枣仁水提物中9种入血成分；提高检测灵敏度，缩短分析时间；实现了对黄酮、皂苷和生物碱类三种极性化合物的同时定量分析；为酸枣仁在正常与PCPA失眠模型大鼠体内的药代动力学研究提供分析技术保障，为其他口服中药多组分同时定量分析提供参考。

Description

酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法
技术领域
本发明属于中成药体内代谢研究技术领域，具体涉及一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法。
背景技术
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Huex H. F. Chou的干燥成熟种子，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津之功效，是临床上治疗失眠的首选药物。现代药理研究表明，酸枣仁中总皂苷、总黄酮、总生物碱是其发挥镇静催眠的主要活性成分。
众所周知，中药有效成分吸收入血是其疗效发挥的前提，且多成分、多靶点、多作用途径是其临床显效的特点。已有的植物化学研究表明，酸枣仁中化学成分结构丰富多样，以皂苷类、黄酮类和生物碱类为其主要的特征成分。目前有关酸枣仁的药动学研究主要集中于通过口服或静脉注射给予大鼠酸枣仁中某一单体成分或酸枣仁黄酮提取物等的研究。然而，酸枣仁水提物口服给药方式更接近临床的用药形式。且酸枣仁富含黄酮类、皂苷类、生物碱类和三萜酸类等多种结构类型的化学成分，而不同类型成分的药代动力学特征大相径庭。以一种成分代表一味中药的药动学行为在中药研究中不可行。此外，现阶段有关酸枣仁入血成分的定量分析主要是通过HPLC-UV和LC-MS/MS方法测定斯皮诺素及其衍生物6'''-阿魏酰斯皮诺素及酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B等几个化合物的药动学。HPLC-UV的分析灵敏度低，不适合分析血浆中的微量成分，且分析时间过长；LC-MS/MS虽然测定灵敏度高，但仅应用于测定了单一成分的药动学。
发明内容
本发明为了解决现阶段有关酸枣仁入血成分定量分析中HPLC-UV的分析灵敏度低，不适合分析血浆中的微量成分，且分析时间过长；LC-MS/MS虽然测定灵敏度高，但仅应用于测定了单一成分的药动学，不利于中药药动学的研究的问题，提供了一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，以及在酸枣仁水提物口服给予正常和PCPA失眠模型大鼠的药动学中的应用。
本发明由如下技术方案实现：一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，采用UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS方法，同是定量测定酸枣仁水提物中9种活性成分：乌药碱、木兰花碱、维采宁、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B；具体步骤如下：
（1）单一对照品储备液的制备：分别精密称定对照品，加入UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS分析的色谱初始流动相，制备成乌药碱2.032 mg/mL、木兰花碱1.130 mg/mL的单一对照品储备液，加入甲醇制备成维采宁2.184 mg/mL、斯皮诺素2.016 mg/mL、当药黄素1.972 mg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷2.058 mg/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素2.012 mg/mL、酸枣仁皂苷A 2.040 mg/mL、酸枣仁皂苷B 2.064 mg/mL的单一对照品储备液；
工作溶液的制备：分别精密量取上述单一对照品储备液加入甲醇制成混合对照品溶液，其中：乌药碱325.12 ng/mL、木兰花碱18080 ng/mL、维采宁、斯皮诺素2419.2 ng/mL、当药黄素94.66 ng/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷246.96 ng/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素128.77ng/mL、酸枣仁皂苷A 652.8 ng/mL、酸枣仁皂苷B 412.8 ng/mL；然后精密量取上述混合对照品溶液，分别加甲醇逐级稀释为混合对照品溶液浓度的4/5、1/2、1/4、1/8、1/40、1/80倍，摇匀，即得质量浓度梯度的工作溶液；
（2）内标溶液的制备：选用盐酸巴马汀、大豆苷、黄芪甲苷分别作为生物碱类、黄酮类、皂苷类化合物含量测定的内标物，分别精密称定内标物，加甲醇制备成盐酸巴马汀0.984 mg/mL、大豆苷1.080 mg/mL、黄芪甲苷1.392 mg/mL的单一内标溶液；精密吸取单一内标溶液，用甲醇稀释制成含盐酸巴马汀78.72 ng/mL、大豆苷216.00 ng/mL、黄芪甲苷556.80 ng/mL的混合内标溶液；
（3）标准曲线的建立：精密吸取空白血浆100 µL，加入10 µL内标，涡旋30 s，再分别加入10 µL混合工作溶液涡旋30 s，然后加入溶剂涡旋5 min，13000 rpm、4℃离心10min，取上清液350 µL加入到干净的EP管中，1400 rpm真空离心、40℃空气吹干，残渣加100µL初始流动相涡旋2 min，13000 rpm、4℃离心5 min，取上清液进行UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS分析；以待测成分峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标（y），血浆中加入的待测成分对照品的浓度作为横坐标（x），采用1/c2加权最小二乘法进行线性回归，建立曲线；
（4）样品的检测：
（a）酸枣仁水提物的制备：酸枣仁饮片500 g，粉碎至60%过1号药典筛，加10倍量水，浸泡30 min，加热至沸，回流提取2 h，滤过，滤渣再加8倍量水，加热回流提取2 h，滤过，合并滤液；减压浓缩至以生药量计浓度为0.5 g/mL，冷冻干燥，用时用水溶解；
（b）血浆样品的采集：大鼠口服酸枣仁水提物以生药量计浓度为40 g/Kg，给药后于0.083-24 h期间对大鼠采血300 µL，置于含0.1%的肝素钠抗凝剂的离心管中，静置30min，4℃、3500 rpm离心10 min，分离血浆，置-20℃保存，待用；
（c）样品的检测：精密吸取大鼠血浆100 µL，采用空白血浆样品的处理方法进行处理，血浆样品处理中采用的溶剂为乙腈，用量为血浆样品的3倍；将处理好的含药血浆样品进行UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析，根据标准曲线计算血浆样本中9种成分的浓度。
所述UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析的色谱条件：色谱柱为ACQUITYUPLC® HSS T3柱，150 mm×2.1 mm，1.8 µm，流动相A：B为乙腈：0.1%甲酸水或A：B为0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水，梯度洗脱程序为0～1.5 min，17% A；1.5～3 min，17→19% A；3～7min，19→33% A；7～12 min，33→98% A；12～14 min，98→17% A；14～19 min，17% A；流速为0.3 mL/min；柱温为40℃；进样量为3 µL；
质谱条件：离子源：HESI源；正、负离子切换同时扫描；工作模式：Full-MS；质谱参数：鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；喷雾电压：3.2 KV（+）、2.5 KV（-）；毛细管温度：320℃；离子源温度：300 ℃；分辨率70 000；扫描范围 m/z 150-1500 Da。
步骤（1）中所述UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析的色谱初始流动相为17%的0.1%甲酸乙腈-83%的0.1%甲酸水。
所述步骤（b）中分别在大鼠给药后0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、4、6、10、12、24 h对大鼠进行采血。
本发明选用内标法进行9种成分同时定量，由于待测成分分属3个不同种类，故分别选取了3种不同类型的内标，盐酸巴马汀、大豆苷、黄芪甲苷分别作为生物碱类、黄酮类、皂苷类化合物含量测定的内标。
所述空白血浆样品处理中采用的溶剂为甲醇、乙腈或乙酸乙酯中的任意一种，用量为空白血浆样品的3-5倍。优选地，所述空白血浆样品处理中采用的溶剂为乙腈，用量为空白血浆样品的3倍。
流动相考察时，色谱条件中流动相A：B优选为0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水。
本发明对色谱条件、内标物质的选择及样品前处理条件进行了合理的设置，提高了检测灵敏度，缩短了分析时间；实现了对黄酮类、皂苷类和生物碱类三种不同极性化合物的同时定量分析；可用于酸枣仁水提物口服给药后正常与PCPA失眠模型大鼠血浆中9种成分的药动学研究；为其他口服中药多组分同时定量分析提供技术参考。
综上，以酸枣仁水提物中9种（乌药碱、木兰花碱、维采宁、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B）活性成分为研究对象，采用UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS技术建立一种全新的酸枣仁水提物体内9种活性成分的同时定量的分析方法。本发明所选的9种成分涵盖酸枣仁中3类极性不同的活性成分，使得酸枣仁的药代动力学研究更为全面。Full-MS扫描模式将高性能母离子的一级精确质量数作为定量离子，实现酸枣仁水提物口服给药大鼠后9种入血成分在单次分析中同时进行准确定量分析。
附图说明
图1为9种成分的提取离子流图，图中：A为空白血浆，B为空白血浆+对照品，C为含药血浆；图2为正常组（C）和模型组（M）大鼠口服酸枣仁水提物后中9种成分的平均药物浓度-时间曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。各实施例中使用到的试剂和器材如下：
1.仪器：Thermo fisher U3000超高效液相色谱仪，配置在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、紫外检测器、自动进样器（美国Thermo Fisher Scientific公司），ThermoScientificTM Q ExactiveTM Orbitrap质谱仪（Germany）；CPA225D型十万分之一分析天平，德国Sartorius北京仪器***有限公司；真空离心浓缩仪，德国Eppendorf公司。
2.药品与试剂：对照品：乌药碱（批号HC225036198）、木兰花碱（批号HA061308198）、维采宁（批号HV187847198）、斯皮诺素（批号20160314）、当药黄素（批号HA062908198）、山奈酚-3-O-芸香糖苷（批号HK201623198）、6'''-阿魏酰斯皮诺素（批号20160313）、酸枣仁皂苷A（批号20160315 A）、大豆苷（批号HD031189198）、黄芪甲苷（批号HA012079198）均购于宝鸡市辰光生物科技有限公司，酸枣仁皂苷B（批号20170210）购于南京春秋生物工程有限公司，盐酸巴马汀（批号 130427）购于四川省维克奇生物科技有限公司，经HPLC归一化法测定对照品的质量分数均大于98%。对氯苯丙氨酸（PCPA）（批号GK01-JBQH），购自梯希爱（化成）工业发展有限公司，纯度大于98%。乙腈、甲酸为质谱纯，均购于Fisher公司，甲醇为质谱纯，购于默克公司。其它试剂均为分析纯。
实施例1：一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，采用UHPLC-QExactive Orbitrap HR/MS方法，同是定量测定酸枣仁水提物中9种活性成分：乌药碱、木兰花碱、维采宁、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B；具体步骤如下：
（1）单一对照品储备液的制备：分别精密称定对照品，加入UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS分析的色谱初始流动相，制备成乌药碱2.032 mg/mL、木兰花碱1.130 mg/mL的单一对照品储备液，加入甲醇制备成维采宁2.184 mg/mL、斯皮诺素2.016 mg/mL、当药黄素1.972 mg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷2.058 mg/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素2.012 mg/mL、酸枣仁皂苷A 2.040 mg/mL、酸枣仁皂苷B 2.064 mg/mL的单一对照品储备液；
工作溶液的制备：分别精密量取上述单一对照品储备液加入甲醇制成混合对照品溶液，其中：乌药碱325.12 ng/mL、木兰花碱18080 ng/mL、维采宁、斯皮诺素2419.2 ng/mL、当药黄素94.66 ng/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷246.96 ng/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素128.77ng/mL、酸枣仁皂苷A 652.8 ng/mL、酸枣仁皂苷B 412.8 ng/mL；然后精密量取上述混合对照品溶液，分别加甲醇逐级稀释为混合对照品溶液浓度的4/5、1/2、1/4、1/8、1/40、1/80倍，摇匀，即得质量浓度梯度的工作溶液；
（2）内标溶液的制备：选用盐酸巴马汀、大豆苷、黄芪甲苷分别作为生物碱类、黄酮类、皂苷类化合物含量测定的内标物，分别精密称定内标物，加甲醇制备成盐酸巴马汀0.984 mg/mL、大豆苷1.080 mg/mL、黄芪甲苷1.392 mg/mL的单一内标溶液；精密吸取单一内标溶液，用甲醇稀释制成含盐酸巴马汀78.72 ng/mL、大豆苷216.00 ng/mL、黄芪甲苷556.80 ng/mL的混合内标溶液；
（3）色谱及质谱条件：
色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® HSS T3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 µm），流动相A：B为乙腈：0.1%甲酸水或A：B为0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水，优选为0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水，梯度洗脱程序为0～1.5 min，17% A；1.5～3 min，17→19% A；3～7 min，19→33%A；7～12 min，33→98% A；12～14 min，98→17% A；14～19 min，17% A。流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为3 µL。
质谱条件：离子源：HESI源；正、负离子切换同时扫描；工作模式：Full-MS；质谱参数：鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；喷雾电压：3.2 KV（+）、2.5 KV（-）；毛细管温度：320 ℃；离子源温度：300 ℃；分辨率70 000；扫描范围 m/z 150-1500 Da，12种成分的质谱参数见表1。
表1 12种成分的质谱参数
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（4）血浆样品的处理：在血浆样品处理过程中首先考察蛋白质沉淀法（甲醇和乙腈）和液-液萃取法（乙酸乙酯）对9种成分的回收率和基质效应的影响。结果显示采用甲醇沉淀蛋白时山奈酚-3-O-芸香糖苷的回收率较低，使用乙酸乙酯萃取导致木兰花碱、维采宁、斯皮诺素、当药黄素和6'''-阿魏酰斯皮诺素的回收率极低，最后选择对待测成分有较高回收率和低基质效应的乙腈作为蛋白质沉淀的可靠溶剂。其次比较了不同比例乙腈（3倍、4倍、5倍）的沉淀效果，结果显示，采用3倍体积的乙腈沉淀蛋白维采宁的提取回收率最高，其他成分的回收率相当，故选择3倍体积的乙腈沉淀血浆蛋白。
精密吸取空白血浆100 µL，加入10 µL内标，涡旋30 s，再分别加入10 µL工作溶液涡旋30 s，然后加入300 µL乙腈涡旋5 min，离心（13000 rpm，10 min，4℃），取上清液350 µL加入到干净的EP管中，1400 rpm真空离心、40℃空气吹干，残渣加100 µL初始流动相涡旋2min，离心（13000 rpm，5 min，4℃），取上清液进行UHPLC-MS分析。
实施例2：方法学考察
1.专属性试验：取来源不同的6只大鼠的空白血浆、空白血浆加工作溶液、含药血浆均按照实施例1的条件处理及分析。比较三者的色谱图，观察在待测成分和内标的出峰位置空白血浆是否存在干扰。结果如图1所示，待测成分和内标的保留时间分别为：乌药碱3.23 min，木兰花碱4.12 min，维采宁2.85 min，斯皮诺素6.13 min，当药黄素6.87 min，山奈酚-3-O-芸香糖苷7.37 min，6'''-阿魏酰斯皮诺素8.14 min，酸枣仁皂苷A 10.76 min，酸枣仁皂苷B 11.14 min，盐酸巴马汀10.22 min，大豆苷4.60 min，黄芪甲苷11.10 min。在待测成分和内标的出峰位置对应的空白血浆没有干扰，表明方法专属性良好。
2.线性范围与定量下限：以待测成分峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标（y），血浆中加入的待测成分对照品的浓度作为横坐标（x），采用1/c2加权最小二乘法进行线性回归，求出回归曲线方程。日内完成3条标准曲线的测定。定量下限是指信噪比（S/N）大于或等于10。9种待测成分的标准曲线、相关系数、线性范围和LLOQ的结果见表2，结果显示待测成分在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数r 2在0.980～0.999。
表2 9种成分的线性与范围、r 2 及LLOQ
Figure 193798DEST_PATH_IMAGE002
3.精密度与准确度试验：精密度和准确度使用4个浓度的QC样本进行测定。日内精密度采用同一分析批的样本连续进样5次，日间精密度采用3个分析批的样本连续进样3日，每个分析日连续进样5次，计算精密度RSD%和准确度RE%。9种待测成分的日内、日间精密度和准确度的结果见表3，日内精密度RSD%<19.96%，准确度%在-15.27%～17.31%；日间精密度RSD%<19.62%，准确度%在-14.33%～17.92%。数据显示精密度和准确度均在标准范围内，结果表明该方法具有良好的精密度和准确度，可用于生物样品的分析。
表3 9种成分的日内、日间精密度与准确度
Figure DEST_PATH_IMAGE003
4.基质效应与提取回收率试验：基质效应与提取回收率使用4个浓度的QC样本进行测定。基质效应：按照实施例1“血浆样品的处理”方法处理血浆样品（n=5），分别计算待测成分与内标峰面积的值为A。另取100 µL空白溶剂（乙腈）代替空白血浆，其他操作与实施例1“血浆样品的处理”处理方法一致（n=5），分别计算待测成分与内标峰面积的值为B。基质效应=A/B*100%，并计算RSD值。提取回收率：空白血浆用乙腈沉淀蛋白后加工作溶液按实施例1“血浆样品的处理”方法处理（n=5），计算待测成分与内标峰面积的值为C。提取回收率＝A/C*100%，并计算RSD值。QC样品中9种待测成分的提取回收率范围为80.75%～113.75%，基质效应范围为77.67%～114.10%，RSD%<15%，内标盐酸巴马汀、大豆苷、黄芪甲苷的提取回收率分别为91.92%、97.98%、96.76%，基质效应分别为108.93%、101.38%、98.49%，上述结果表明本实验的备样方法的提取回收率良好，并且没有显著的基质效应影响，结果见表4。
表4 9种成分的基质效应与提取回收率
Figure 110939DEST_PATH_IMAGE004
5.稳定性试验：对4个浓度的QC样本进行稳定性考察，包括分析样品室温25℃放置4 h的短期稳定性、-20℃放置30天的长期稳定性和3次冻融循环后的稳定性（-20℃～20℃），以及样品处理后置于自动进样器中12 h的稳定性。计算精密度RSD%和准确度RE%。在不同条件（样品室温25℃放置4 h、-20℃放置30天、3次冻融循环、自动进样器中放置12 h）下使用4个浓度QC样品研究9种待测成分的稳定性，结果见表5。结果表明所有分析物在整个分析过程中均稳定，RE%在-15.13%～19.78%，RSD%在0.38%～16.23%。
表5 9种成分的稳定性
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例3：正常和PCPA失眠模型大鼠口服酸枣仁水提物后大鼠血浆中9种成分的药动学测定
（1）酸枣仁水提物的制备：取酸枣仁饮片约500 g，粉碎（60%过1号药典筛），精密称定，加10倍量水，浸泡30 min，加热至沸，回流提取2 h，滤过，滤渣再加8倍量水，加热回流提取2 h，滤过，合并滤液；减压浓缩至0.5 g/mL（生药量计），冷冻干燥，用时用水溶解。
（2）动物实验及血浆样品的采集：健康雄性SD大鼠，体重280±20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将大鼠随机分为2组，正常组和模型组，每组6只。以PCPA制备失眠模型。模型组大鼠腹腔注射PCPA溶液400 mg/kg，连续三天，末次给药后，观察大鼠昼夜节律是否消失，若消失则造模成功。正常组和模型组大鼠给药前禁食12 h，自由饮水，口服酸枣仁水提物40 g/Kg（生药量计）。给药后于0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、4、6、10、12、24 h眼眶后静脉丛取血300 µL，置于含0.1%的肝素钠抗凝剂的离心管中，静置30min，离心（3500 rpm，10 min，4℃），分离血浆，置-20℃保存，待用。
（3）样品前处理方法：精密吸取大鼠血浆100 µL，同实施例1所述的血浆样品处理方法进行处理。
（4）正常和PCPA失眠模型大鼠口服给予酸枣仁水提物后血浆中9种分的含量测定：
将处理好的含药血浆样品进行UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析，条件同实施例1，根据标准曲线计算血浆样本浓度。正常组和模型组大鼠口服酸枣仁水提物后，血浆中9种成分的平均药物浓度-时间曲线见图2；采用DAS 3.2.8数据处理软件，以非房式模型法进行药代动力学参数计算，结果见表6。
表6 正常组（C）和模型组（M）大鼠口服酸枣仁水提物后9种成分的药动学参数
Figure 766042DEST_PATH_IMAGE006
注：ND：血药浓度低于LLOQ。
如图2所示，正常大鼠口服酸枣仁水提物6 h后血浆中乌药碱、木兰花碱和维采宁的血药浓度低于LLOQ，24 h时当药黄素的血药浓度低于LLOQ，山奈酚-3-O-芸香糖苷在给药24 h内血药浓度均低于LLOQ；模型大鼠口服酸枣仁水提物6 h后血浆中木兰花碱和维采宁的血药浓度低于LLOQ。
酸枣仁水提物中9种待测成分的含量比例与血浆中的Cmax和AUC0-t不完全一致，说明不同成分进入体内的程度不同。有研究表明，6'''-阿魏酰斯皮诺素、斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和B的达峰时间相对较长，但本发明9种待测成分均在半小时达峰，表明酸枣仁水提物中的其他成可能促进了它们的吸收。
如表6所示，正常大鼠口服酸枣仁水提物后，乌药碱和木兰花碱的Tmax分别为0.2 h和0.46 h，Cmax分别为4.66 ng/mL和140.29 ng/mL，T1/2分别为2.87 h和1.15 h，可见两种生物碱的吸收均较快，但是木兰花碱的消除速度快于乌药碱。斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素的Tmax分别为0.28 h和0.36 h，Cmax分别为106.54 ng/mL和48.45 ng/mL，T1/2分别为4.74h和2.21 h。与斯皮诺素相比，6'''-阿魏酰斯皮诺素吸收慢，体内暴露量低，消除快。我们推测这一结果是由于6'''-阿魏酰斯皮诺素结构中存在阿魏酰基，使其脂溶性增加，更易分布于组织。值得注意的是，当药黄素出现了双峰现象，这可能是由两个原因引起的：1、6'''-阿魏酰斯皮诺素和斯皮诺素在肠道中不断地水解转化成当药黄素；2、当药黄素可能发生了肝肠循环。此外，维采宁在正常大鼠体内的吸收快（Tmax为0.5 h），消除慢（T1/2为3.17 h）。在此检测条件下，山奈酚-3-O-芸香糖苷的血药浓度低于LLOQ。酸枣仁皂苷A和B的Tmax分别为3.46 h和0.96 h，Cmax分别为57.81 ng/mL和14.02 ng/mL，T1/2分别为2.44 h和8.28 h。可见，酸枣仁皂苷B的吸收快于酸枣仁皂苷A，而消除极慢。
对于生物碱类成分，与正常大鼠相比，模型大鼠口服酸枣仁水提物后乌药碱的Cmax、AUC0-t和T1/2增大，Tmax减小，说明模型大鼠对乌药碱的吸收加快，消除减慢（P<0.05），体内暴露量显著提高；木兰花碱的Cmax和AUC0-t减小，Tmax降低，CL/F明显增加，说明模型大鼠对木兰花碱的吸收和消除速度加快，但其体内暴露量减小。
对于黄酮碳糖类成分而言，与正常大鼠相比，模型大鼠口服酸枣仁水提物后6'''-阿魏酰斯皮诺素的Tmax显著减小（P<0.05），说明模型大鼠对其吸收加快；T1/2显著提高（P<0.05），说明消除速度减慢；AUC0-t降低，说明其体内暴露量减少。对于酸枣仁中含量较高的斯皮诺素，模型大鼠的Cmax和AUC0-t升高，Tmax减小，表明其吸收加快，体内暴露量增加；CL/F减小，说明其消除速率减慢。模型大鼠当药黄素的Cmax、AUC0-¥和T1/2显著增加（P<0.05），CL/F明显减小，说明模型大鼠对其吸收增强，体内暴露量显著增加，消除速度减慢。模型大鼠维采宁的Cmax增加，Tmax和T1/2均减小，表明模型大鼠对维采宁的吸收和消除均加快。由此可见，以芹菜素为母核的6'''-阿魏酰斯皮诺素、斯皮诺素和当药黄素在模型大鼠体内吸收均加快，且消除速度减慢。其中斯皮诺素和当药黄素的体内暴露量增加。而同为碳糖的维采宁在模型大鼠体内同样表现出吸收加快的趋势。但其T1/2缩短，消除加快。与正常大鼠相比，黄酮氧糖山奈酚-3-O-芸香糖苷在模型大鼠体内暴露量明显增加。
对于酸枣仁中含量较高的皂苷类成分酸枣仁皂苷A和B而言，与正常大鼠相比，酸枣仁皂苷A在模型大鼠体内的T1/2增加，Tmax和CL/F显著降低，说明模型大鼠酸枣仁皂苷A吸收加快（P<0.05），消除减慢（P<0.05），而体内暴露量有减少的趋势。酸枣仁皂苷B在模型大鼠体内的AUC0-t和CL/F与正常大鼠基本保持一致。然而，Tmax显示出减小趋势，说明达峰更快。由此可见，酸枣仁皂苷A和B在模型大鼠体内吸收均加快；而酸枣仁皂苷A消除速度显著降低，酸枣仁皂苷B的消除速度基本不变。
本发明建立的酸枣仁水提物体内9种活性成分的同时定量方法可应用于正常和PCPA失眠大鼠口服酸枣仁水提物后的药动学研究。

Claims (2)

1.一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，采用UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS方法，同时定量测定酸枣仁水提物中9种活性成分：乌药碱、木兰花碱、维采宁、斯皮诺素、当药黄素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B；其特征在于：具体步骤如下：
（1）单一对照品储备液的制备：分别精密称定对照品，加入UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS分析的色谱初始流动相，制备成乌药碱2.032 mg/mL、木兰花碱1.130 mg/mL的单一对照品储备液，加入甲醇制备成维采宁2.184 mg/mL、斯皮诺素2.016 mg/mL、当药黄素1.972 mg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷2.058 mg/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素2.012 mg/mL、酸枣仁皂苷A 2.040 mg/mL、酸枣仁皂苷B 2.064 mg/mL的单一对照品储备液；
工作溶液的制备：分别精密量取上述单一对照品储备液加入甲醇制成混合对照品溶液，其中：乌药碱325.12 ng/mL、木兰花碱18080 ng/mL、维采宁、斯皮诺素2419.2 ng/mL、当药黄素94.66 ng/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷246.96 ng/mL、6'''-阿魏酰斯皮诺素128.77ng/mL、酸枣仁皂苷A 652.8 ng/mL、酸枣仁皂苷B 412.8 ng/mL；然后精密量取上述混合对照品溶液，分别加甲醇逐级稀释为混合对照品溶液浓度的4/5、1/2、1/4、1/8、1/40、1/80倍，摇匀，即得质量浓度梯度的工作溶液；
（2）内标溶液的制备：选用盐酸巴马汀、大豆苷、黄芪甲苷分别作为生物碱类、黄酮类、皂苷类化合物含量测定的内标物，分别精密称定内标物，加甲醇制备成盐酸巴马汀0.984mg/mL、大豆苷1.080 mg/mL、黄芪甲苷1.392 mg/mL的单一内标溶液；精密吸取单一内标溶液，用甲醇稀释制成含盐酸巴马汀78.72 ng/mL、大豆苷216.00 ng/mL、黄芪甲苷556.80ng/mL的混合内标溶液；
（3）标准曲线的建立：精密吸取空白血浆100 µL，加入10 µL内标，涡旋30 s，再分别加入10 µL混合工作溶液涡旋30 s，然后加入300 µL乙腈涡旋5 min，13000 rpm、4℃离心10min，取上清液350 µL加入到干净的EP管中，1400 rpm真空离心、40℃空气吹干，残渣加100µL初始流动相涡旋2 min，13000 rpm、4℃离心5 min，取上清液进行UHPLC-Q ExactiveOrbitrap HR/MS分析；以待测成分峰面积与内标峰面积的比值作为纵坐标（y），血浆中加入的待测成分对照品的浓度作为横坐标（x），采用1/c2加权最小二乘法进行线性回归，建立曲线；9种待测成分的标准曲线、相关系数、线性范围和LLOQ的结果见下表，结果显示待测成分在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数r 2在0.980～0.999；
Figure 983334DEST_PATH_IMAGE001
；
（4）样品的检测：
（a）酸枣仁水提物的制备：酸枣仁饮片500 g，粉碎至60%过1号药典筛，加10倍量水，浸泡30 min，加热至沸，回流提取2 h，滤过，滤渣再加8倍量水，加热回流提取2 h，滤过，合并滤液；减压浓缩至以生药量计浓度为0.5 g/mL，冷冻干燥，用时用水溶解；
（b）血浆样品的采集：大鼠口服酸枣仁水提物以生药量计浓度为40 g/Kg，给药后于0.083－24 h期间对大鼠采血300 µL，置于含0.1%的肝素钠抗凝剂的离心管中，静置30min，4℃、3500 rpm离心10 min，分离血浆，置-20℃保存，待用；
（c）样品的检测：精密吸取大鼠血浆100 µL，采用空白血浆样品的处理方法进行处理，血浆样品处理中采用的溶剂为乙腈，用量为血浆样品的3倍；将处理好的含药血浆样品进行UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析，根据标准曲线计算血浆样本中9种成分的浓度；
所述UHPLC-Q Exactive Orbitrap HR/MS分析的色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC®HSS T3柱，150 mm×2.1 mm，1.8 µm，流动相A：B为乙腈：0.1%甲酸水或A：B为0.1%甲酸乙腈：0.1%甲酸水，梯度洗脱程序为0～1.5 min，17% A；1.5～3 min，17→19% A；3～7 min，19→33% A；7～12 min，33→98% A；12～14 min，98→17% A；14～19 min，17% A；流速为0.3 mL/min；柱温为40℃；进样量为3 µL；
质谱条件：离子源：HESI源；正、负离子切换同时扫描；工作模式：Full-MS；质谱参数：鞘气流速：35 arb；辅助气流速：10 arb；喷雾电压：+ 3.2 KV、- 2.5 KV；毛细管温度：320℃；离子源温度：300 ℃；分辨率70 000；扫描范围 m/z 150-1500 Da。
2.根据权利要求1所述的一种酸枣仁水提物中9种入血成分的同时定量测定方法，其特征在于：所述步骤（b）中分别在大鼠给药后0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、4、6、10、12、24 h对大鼠进行采血。
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