CN108982703B - 一种多酚类物质的液质联用检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多酚类物质的液质联用检测方法。该方法包括：将待测样品进行超声提取，以便得到待测提取液；以及将所述待测提取液进行液质联用检测，以便确定所述待测样品的多酚类物质的含量。利用该方法可以简单、快速、准确地检测待测样品中的多酚类物质的含量。

Description

一种多酚类物质的液质联用检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及一种多酚类物质的液质联用检测方法。

背景技术

多酚类物质广泛存在于多种食物和药品中，例如，大蒜中含有多种多酚类化合物。近年来，对多酚类化合物含量的分析方法主要为高效液相色谱法，灵敏度低，精确度差。并且，大蒜等物品的成份复杂，常规方法对大蒜等样品的前处理过程十分繁琐，耗时较长，不利于大蒜多酚物质的快速检测和质量控制，或使用大量有机溶剂，不环保且不经济。

由此，对食品和药品等中现有的多酚类物质的检测方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种多酚类物质的液质联用检测方法，该方法对样品的前处理简单、快速，并且检测灵敏度和精确度高。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种多酚类物质的液质联用检测方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将待测样品进行超声提取，以便得到待测提取液；以及将所述待测提取液进行液质联用检测，以便确定所述待测样品的多酚类物质的含量。

根据本发明实施例的多酚类物质的液质联用检测方法，利用超声法提取样品中的多酚类物质，提取的操作简单，效率高，耗时短，并且，利用液质联用法进行分析，检测灵敏度和精确度高，且在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率。由此，利用该方法可以简单、快速、准确地检测待测样品中的多酚类物质的含量。在食品和药品，尤其是大蒜的质量控制等领域具有广阔的应用前景。

另外，根据本发明上述实施例的多酚类物质的液质联用检测方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述超声提取包括：将破碎后的待测样品与醇溶液混合后进行超声处理，以便得到超声后的混合物；将所述超声后的混合物进行过滤处理，以便得到所述待测提取液。

根据本发明的实施例，所述醇溶液为甲醇溶液，优选地，为60-80体积％的甲醇溶液。

根据本发明的实施例，所述破碎后的待测样品与所述醇溶液按1g：10-20ml的比例进行所述混合。

根据本发明的实施例，所述超声处理的时间为25-35分钟，超声频率为15-25KHz，超声功率为400-500W，温度为35-45℃。

根据本发明的实施例，所述超声处理的时间为30分钟，超声频率为20KHz，超声功率为450W，温度为40℃。

根据本发明的实施例，所述液质联用检测的液相色谱条件为：色谱柱：SB-C18液相色谱柱；流速：0.6-1.0mL/min，优选为0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。

根据本发明的实施例，所述液质联用检测的流动相包括：A相：甲酸水溶液；B相：乙腈。

根据本发明的实施例，所述液质联用检测的梯度洗脱程序为：0-2min，10体积％B；2-7min，10-60体积％B；7-15min，60-80体积％B；15-16min，80-10体积％B；16-17min，10体积％B。

根据本发明的实施例，所述液质联用检测的质谱条件为：负离子电喷雾扫描，多反应监测模式；气帘气(Curtain gas)：40psi；离子喷雾电压：4500V；辅助加热气温度(TEM)：550℃；雾化气(Gas1)：55psi；辅助加热气(Gas 2)：55psi。

根据本发明的实施例，所述多酚类物质为选自原儿茶酸、(+)-儿茶素、p-香豆酸、邻苯二甲酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、香草酸、槲皮苷、阿魏酸、芥子酸、杨梅素、白藜芦醇、槲皮素、芹菜素、山奈酚和异鼠李素中的至少一种。

根据本发明的实施例，所述待测样品为食品和药品。根据本发明的优选实施例，所述食品为大蒜。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1和图2显示了根据本发明一个实施例的混合标准品的检测结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明而不是要求本发明必须以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种多酚类物质的液质联用检测方法。

根据本发明实施例的多酚类物质的液质联用检测方法，利用超声法提取样品中的多酚类物质，提取的操作简单，效率高，耗时短，并且，利用液质联用法进行分析，检测灵敏度和精确度高，且在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率。由此，利用该方法可以简单、快速、准确地检测待测样品中的多酚类物质的含量。

根据本发明实施例的多酚类物质的液质联用检测方法，以仪器操作为主，节省人力，并且操作简单，分析时间短，仅需17分钟，大幅度降低整个分析流程，为多酚类物质的定性定量检测分析提供了一种简单、快速、准确的方法。

为了便于理解该多酚类物质的液质联用检测方法，在此，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：

S100超声提取

根据本发明的实施例，该待测样品为食品和药品。根据本发明的优选实施例，该食品为大蒜。大蒜多酚因其很强的抗氧化性能和明显的抑菌、抗老化以及抑制胆固醇上升等独特的功能活性，已经被大量应用于医学、食品等相关领域。常规方法对大蒜等样品的前处理过程十分繁琐，耗时较长，不利于大蒜多酚物质的快速检测和质量控制。本发明实施例的检测方法，尤其适于对大蒜的多酚类物质进行检测。

根据本发明的实施例，将待测样品进行超声提取，得到待测提取液。超声提取是基于超声波的特殊物理性质并通过产生快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力，从而实现固液萃取分离。超声波主要产生三种效应，一是加速介质质点运动；二是超声波在液体介质中传播产生特殊的空化效应，空化效应不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断***产生微观上的强大冲击波作用在样品上，使目标成分被轰击逸出，加速浸出提取；三是超声波的振动匀化使样品介质内各点受到作用一致，使整个样品萃取更均匀。由此，通过超声处理提取样品中的多酚类物质，提取的操作简单，无需高温，萃取效率高，耗时短。

根据本发明的具体实施例，该超声提取包括：将破碎后的待测样品与醇溶液混合后进行超声处理，得到超声后的混合物；将超声后的混合物进行过滤处理，具体地，可以将超声后的混合物先离心再进行过滤处理，得到所述待测提取液。由此，以醇溶液为提取液提取多酚类物质，提取的效率高、效果好，溶剂用量小，能快速提取样品中的多酚类物质。其中，离心转速为8000-10000rps，优选为10000rps；离心时间6-15min，优选为10min。由此，有效去除混匀物中的固体杂质，防止该杂质影响后续的分析检测。

进一步地，根据本发明的实施例，该过滤处理采用微孔滤膜进行的，该滤膜的材质为尼龙，滤膜孔径为0.22μm。由此，进一步去除提取液中的杂质，防止干扰后续的高精度检测。

具体地，根据本发明的实施例，该醇溶液为甲醇溶液。多酚类物质易溶于甲醇，由于植物多酚易与植物组织中的蛋白质、生物碱、多糖、花色苷等物质复合，难以分离。发明人发现，有机溶剂与水的混合液可打断多酚类物质与蛋白质、多糖等物质的结合键，有利于多酚的提取。但研究发现，如果甲醇体积分数太高又会使细胞因失水而造成纤维紧缩，影响多酚的渗出，并且在浸提过程中，甲醇对细胞的破坏作用比水强，进而，发明人对超声提取的溶剂中的醇的比例进行了优化。根据本发明的优选实施例，该醇溶液为60-80体积％的甲醇溶液，优选地，该醇溶液为60体积％的甲醇溶液。由此，提取效率和效果更佳，有利于更充分地提取多酚类物质，又有效降低溶剂对细胞等的损伤。

根据本发明的实施例，破碎后的待测样品与醇溶液按1g：10-20ml的比例进行混合，优选地，破碎后的待测样品与醇溶液按1g：15ml的比例进行混合。由此，待测样品与醇溶液的比例适宜，有利于充分提取样品中的多酚类物质。

根据本发明的实施例，该超声处理的时间为25-35分钟，超声频率为15-25KHz，超声功率为400-500W，温度为35-45℃。根据本发明的优选实施例，该超声处理的时间为30分钟，超声频率为20KHz，超声功率为450W，温度为40℃。由此，超声提取的效果好，有利于充分提取样品中的多酚类物质，使检测结果更准确。

S200液质联用检测

根据本发明的实施例，将待测提取液进行液质联用检测，确定所述待测样品的多酚类物质的含量。利用液质联用法进行分析，检测灵敏度和精确度高，且在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率。

根据本发明的实施例，在进行液质联用检测时，液相色谱条件为：色谱柱：SB-C18液相色谱柱；流速：0.6-1.0mL/min，优选为0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；质谱条件为：负离子电喷雾扫描，多反应监测模式；气帘气(Curtain gas)：40psi；离子喷雾电压：4500V；辅助加热气温度(TEM)：550℃；雾化气(Gas1)：55psi；辅助加热气(Gas2)：55psi。由此，在该色谱和质谱条件下，检测得到的峰形更好，检测的灵敏度和稳定性更高，在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率。

其中，发明人对多种色谱柱进行分析比较，研究发现，反相色谱柱SB-C18，用于检测多酚类物质，稳定性和重现性，使用寿命长，尤其是使用甲酸水溶液-乙腈为流动相，SB-C18色谱柱为固定相时，大部分多酚化合物能实现较好的分离。其中，SB-C18色谱柱可以采用安捷伦ZORBAX SB-C18液相色谱柱，无需价格昂贵的多酚专用色谱柱，不仅多酚类物质检测分析的费用低，而且检测的灵敏度和精确度高。

其中，ESI电喷雾离子源包括正离子和负离子两种扫描模式。由于多酚类化合物的结构均有羟基官能团，容易失去一个质子，所以选择负离子扫描模式。

进一步地，该液相色谱仪可以为荷兰Spark公司Symbiosis液相色谱仪。由此，便于与质谱串联，实现液质联用。

进一步地，该质谱为三重四极杆质谱仪，例如，可以美国AB SCIEX

6500质谱***，检测模式为电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，负离子模式(ESI-)扫描。由此，根据检测目标化合物的母离子，子离子以及保留时间进行定性和定量，准确度高，方法可靠，且在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率，达到准确检测和分析大蒜多酚含量的目的。

根据本发明的实施例，该液质联用检测的流动相包括：A相：甲酸水溶液；B相：乙腈。由此，在流动相中加入少量挥发性酸使检测得到的峰形好，无拖尾，使检测结果更准确，尤其是添加了0.1％甲酸，色谱峰的峰形明显改善。

根据本发明的实施例，该液质联用检测的梯度洗脱程序为0-2min，10体积％B；2-7min，10-60体积％B；7-15min，60-80体积％B；15-16min，80-10体积％B；16-17min，10体积％B。由此，各多酚类物质的保留时间适宜，各组分峰形尖锐，分离度好。

根据本发明的实施例，该多酚类物质为选自原儿茶酸、(+)-儿茶素、p-香豆酸、邻苯二甲酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、香草酸、槲皮苷、阿魏酸、芥子酸、杨梅素、白藜芦醇、槲皮素、芹菜素、山奈酚和异鼠李素中的至少一种。本发明实施例的方法，对于前述这些多酚类物质的检测效果好，灵敏度高。

利用本发明实施例的方法对各种多酚类化合物进行检测，得到多酚类化合物的质谱多反应监测的分析条件，具体如下：

原儿茶酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为153±0.5m/z，定量离子为109.1±0.5m/z，定性离子为90.9±0.5m/z；

(+)-儿茶素的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为289±0.5m/z，定量离子为122.9±0.5m/z，定性离子为245±0.5m/z；

p-香豆酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为163±0.5m/z，定量离子为64.8±0.5m/z，定性离子为118.9±0.5m/z；

邻苯二甲酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为165±0.5m/z，定量离子为120.9±0.5m/z，定性离子为76.8±0.5m/z；

咖啡酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为179±0.5m/z，定量离子为134.9±0.5m/z，定性离子为117±0.5m/z；

对羟基苯甲酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为137±0.5m/z，定量离子为92.9±0.5m/z，定性离子为65±0.5m/z；

香草酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为167.1±0.5m/z，定量离子为107.9±0.5m/z，定性离子为123.1±0.5m/z；

槲皮苷的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为447.1±0.5m/z，定量离子为254.8±0.5m/z，定性离子为300.6±0.5m/z；

阿魏酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为193.1±0.5m/z，定量离子为134±0.5m/z，定性离子为149±0.5m/z；

芥子酸的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为222.9±0.5m/z，定量离子为163.9±0.5m/z，定性离子为148.9±0.5m/z；

杨梅素的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为317.1±0.5m/z，定量离子为178.9±0.5m/z，定性离子为150.9±0.5m/z；

白藜芦醇的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为227±0.5m/z，定量离子为143±0.5m/z，定性离子为184.9±0.5m/z；

槲皮素的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为301.2±0.5m/z，定量离子为150.9±0.5m/z，定性离子为178.8±0.5m/z；

芹菜素的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为269±0.5m/z，定量离子为117±0.5m/z，定性离子为151±0.5m/z；

山奈酚的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为285.2±0.5m/z，定量离子为187±0.5m/z，定性离子为158.5±0.5m/z；

异鼠李素的质谱多反应监测的分析条件为：母离子为315±0.5m/z，定量离子为300±0.5m/z，定性离子为150.8±0.5m/z。

其中，需要说明的是，在定性检测多酚类化合物的过程中，根据待测样品中多酚化合物与其标准品的母离子质荷比相同，定量离子与定性离子相同，且保留时间相同，可以确定为目标多酚化合物；在定量检测多酚类化合物的过程中，还需要根据多酚化合物标准品的浓度与峰面积做标准曲线，代入所测样品中目标多酚化合物的峰面积，可计算相应浓度。

其中，标准品的配制方法如下：称取标准品为10mg，加入10mL甲醇溶解，配置成质量浓度为1000mg/L标准溶液，混合标准溶液质量浓度为10mg/L，以上配制溶液均为母液，可以根据需要，稀释为所需浓度的标准品溶液。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例中，对大蒜中的多酚类物质进行HPLC-MS/MS检测，其方法如下：

一、供试品溶液制备：

准确称取100mg大蒜样品于2mL离心管中，加入1.5mL60％甲醇水溶液，超声提取时间为30min，超声频率20KHz，超声功率450W，超声温度40℃；超声提取液于10000rps离心10min，过0.22μm微孔滤膜，制得供试品溶液；

二、标准品溶液制备：

称取标准品为10mg，加入10mL甲醇溶解，配置成质量浓度为1000mg/L标准溶液，混合标准溶液质量浓度为10mg/L；

三、采用HPLC-MS/MS检测条件

1、色谱条件如下：

HPLC-MS/MS液相色谱***为荷兰Spark公司Symbiosis液相色谱仪，色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18液相色谱柱(150mm×4.6mm,i.d.5μm)，柱温30℃，进样量为10μL，流速为0.8mL/min，流动相A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈，A相B相按体积分数计的梯度洗脱程序见下表1：

表1流动相自动洗脱程序

2、质谱条件

ESI电喷雾离子源包括正离子和负离子两种扫描模式，由于多酚类化合物的结构均有羟基官能团，容易失去一个质子，所以选择负离子扫描模式。在多反应监测模式(MRM)下，对各多酚的母离子和子离子进行各种参数的优化。多酚化合物质谱分析的条件参数见表2

表2多酚化合物质谱分析的条件

*定量离子

质谱***为美国AB SCIEX

6500***，电喷雾离子源(ESI)，多反应监测模式(MRM)，负离子模式(ESI-)扫描；气帘气(Curtain gas)：40psi；离子喷雾电压：4500V；辅助加热气温度(TEM)：550℃；雾化气(Gas1)：55psi；辅助加热气(Gas 2)：55psi。

四、采用HPLC-MS/MS进行定性和定量分析：

按上述色谱和质谱条件对供试品溶液中各多酚成分进行测定，通过保留时间和母离子、子离子的质荷比双重定性，即如果样品中检测出的化合物与标准品的母离子质荷比相同，定性离子和定量离子也相同，同时总离子流图的出峰时间相一致，则可以认为该大蒜样品中存在相应的多酚化合物。

采用外标法对实际样品进行定量测定，即配制一系列不同梯度的标准品混合液，测定不同浓度下每种多酚化合物的峰面积并绘制浓度-峰面积标准曲线，通过标准曲线来对大蒜样品中的多酚化合物进行定量分析。

五、检测结果

采用HPLC-MS/MS，得到混合标准品的总离子流图(图1，图2)。

1、按上述色谱和质谱条件对供试品溶液中多酚类化合物检测结果如下。

表3.大蒜中多酚类化合物的含量(μg/g of sample weight，n＝3)

2、方法学考察

(1)线性关系及检出限、定量限。

分别稀释混合标准溶液质量浓度至0.001μg/L、0.005μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L，进样10μL，检测所得数据导入软件Analyst 1.6计算回归方程，以信噪比(S/N)等于3和10为准，测各组分的检出限和定量限，详见表4。

表4线性方程及检出限、定量限

从上述结果可以看出，各酚类化合物的响应值与浓度均呈现出良好的线性关系。

(2)精密度试验

使用同一浓度混合标准溶液进样10μL，按上述检测方法连续进样6次，根据Analyst 1.6计算色谱峰的峰面积，得出各多酚化合物的相对标准偏差(RSD)为0.43％-5.26％，表明该方法具有较好的精密度。

(3)加样回收试验

分别取已知各多酚化合物含量的大蒜样品，并加入1倍、2倍、4倍定量限浓度的混合标准溶液，按上述检测方法连续进样6次，进样分析，计算回收率，结果见下表5。

表5加样回收试验

从表5可以看出，该方法回收率较好，在可接受范围内，并能够准确测定大蒜样品中各多酚化合物的含量。

综上所述，本发明实施例以甲醇超声为前处理方法，提取多酚类物质，提取的效率较高，同时采用HPLC-MS/MS对目标多酚化合物进行分析检测，灵敏度高，结果准确，且16种多酚类化合物在线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.98，回收率在80％-120％，RSD为0.43％-5.26％。由此，本方法实施例的检测方法能够有效的检测样品，例如食品，尤其是大蒜中的多酚类化合物，为大蒜的质量评价提供一种新的手段。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种多酚类物质的液质联用检测方法，其特征在于，包括：

将待测样品进行超声提取，以便得到待测提取液；以及将所述待测提取液进行液质联用检测，以便确定所述待测样品的多酚类物质的含量，

其中，所述超声提取包括：

将破碎后的所述待测样品与醇溶液混合后进行超声处理，以便得到超声后的混合物；

将所述超声后的混合物进行过滤处理，以便得到所述待测提取液，

其中，所述醇溶液为甲醇溶液，且所述破碎后的待测样品与所述醇溶液按1g：10-15ml的比例进行所述混合，

其中，所述待测样品为大蒜，

其中，色谱柱：SB-C18液相色谱柱；

其中，所述液质联用检测的流动相包括：A相：甲酸水溶液；B相：乙腈，

其中，所述液质联用检测的梯度洗脱程序为：0-2min，10体积％B；2-7min，10-60体积％B；7-15min，60-80体积％B；15-16min，80-10体积％B；16-17min，10体积％B，

其中，所述多酚类物质为原儿茶酸、(+)-儿茶素、p-香豆酸、邻苯二甲酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、香草酸、槲皮苷、阿魏酸、芥子酸、杨梅素、白藜芦醇、槲皮素、芹菜素、山奈酚和异鼠李素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇溶液为60-80体积％的甲醇溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为25-35分钟，超声频率为15-25KHz，超声功率为400-500W，温度为35-45℃。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超声处理的时间为30分钟，超声频率为20KHz，超声功率为450W，温度为40℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱：SB-C18液相色谱柱；

流速：0.6-1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述流速：0.8mL/min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液质联用检测的质谱条件为：

负离子电喷雾扫描，多反应监测模式；

气帘气：40psi；

离子喷雾电压：4500V；

辅助加热气温度：550℃；

雾化气：55psi；

辅助加热气：55psi。

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