CN104897831B

CN104897831B - 脑心通指纹图谱的构建方法

Info

Publication number: CN104897831B
Application number: CN201510242769.9A
Authority: CN
Inventors: 常艳旭; 姜艳; 李晋; 王虹; 高秀梅; 陈璐; 何俊; 刘二伟
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2035-05-13
Also published as: CN104897831A

Abstract

本发明实施例公开了一种脑心通指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)、制备供试品溶液；(2)、超高效液相色谱检测；(3)、构建脑心通指纹图谱。本发明获得的脑心通指纹图谱的构建方法精密度高、稳定性和重现性好、方法简便，能快速、准确地评定脑心通的质量品质。

Description

脑心通指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及中药制剂的质量控制领域，特别涉及脑心通指纹图谱的构建方法。

背景技术

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱质量控制技术，以色谱分析为手段，通过对指纹特征的分析比较，获取中药材以及中药制剂半成品成分的相关信息，来评价其质量的真实性、优良性和稳定性，是现阶段综合评价中药质量的最优技术。国家食品药品监督管理局已要求中药制剂实施指纹图谱质量控制。

2002年国家药品监督管理局汇编的《国家中成药标准汇编-中成药地方标准上升国家标准部分》的《内科-脑系》分册，公开了脑心通的质量标准，(标准号：WS-10001(ZD-0001)-2002)主要含有16味药材，各药材之间的重量份数比为：黄芪66份，赤芍27份，丹参27份，当归27份，川芎27份，桃仁27份，红花13份，乳香(制)13份，没药(制)13份，鸡血藤20份，牛膝27份，桂枝20份，桑枝27份，地龙27份，全蝎13份，水蛭27份。具有痰消瘀化、血脉和畅、痹宜痛止功效，用于治疗冠心病、心绞痛。目前对于该药的的质量控制方法为：采用超高效液相色谱(UPLC)技术同时测定脑心通胶囊中羟基红花黄色素A，芍药苷，阿魏酸，丹酚酸B，藁本内酯5种主要化学成分。但是，脑心通中还存在大量的其他有效成分，而这些有效成分对于脑心通的质量控制也是有重要意义的。因此，需要重新构建脑心通指纹图谱，以全面地反映脑心通所含有的化学有效成分，更好的控制脑心通的药品品质。

发明内容

为解决上述问题，本发明实施例公开了一种脑心通指纹图谱的构建方法。技术方案如下：

1、一种脑心通指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

(1)、制备供试品溶液

取脑心通粉末，用体积分数10-90％甲醇溶液提取，定容，即得供试品溶液；

(2)、超高效液相色谱检测

将供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，进行检测，即得脑心通供试品的色谱图；其中色谱检测条件包括：以十八烷基键合硅胶柱为固定相，以100％乙腈：100％甲醇体积比为1∶1的乙腈甲醇混合溶液为A相，体积分数0.1％磷酸水溶液为B相，组成流动相；采用梯度洗脱；检测波长：210-400nm；流速：0.1-0.5mL/min；柱温：25-40℃；进样量：1-5μL；

(3)、构建脑心通指纹图谱

将脑心通供试品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***》进行分析，即得脑心通指纹图谱。

在本发明的一种优选实施方式中，所述制备供试品溶液的步骤为：称定质量为M的脑心通粉末，加入V体积的体积分数10-90％甲醇溶液，得到二者混合液，称定混合液的重量M₁，提取，再称重，用相应浓度甲醇补足失重至M₁，离心，取上清液，即得供试品溶液。

在本发明的一种优选实施方式中，所述的甲醇溶液的体积分数为75％。

在本发明的一种优选实施方式中，所述提取为超声提取，超声提取35min。

在本发明的一种优选实施方式中，所述脑心通粉末质量与所述体积分数75％甲醇溶液的体积比为1∶40。

在本发明的一种更优选实施方式中，将所述的供试品溶液与超纯水以体积比为5∶2稀释，再进行超高效液相色谱检测。

在本发明的一种优选实施方式中，所述的洗脱程序：0-2min，A相∶B相＝87∶13；2-7min，A相∶B相＝(87-78)∶(13-22)；7-25min，A相∶B相＝(78-60)∶(22-40)；25-27min，A相∶B相＝(60-45)∶(40-55)；27-30min，A相∶B相＝45∶55；30-39min，A相∶B相＝(45-10)∶(55-90)；39-40min，A相∶B相＝(10-87)∶(90-13)；所述柱温为40℃；所述流速：0.2mL/min；所述进样量：2μL。

在本发明的一种更优选实施方式中，所述检测波长为324nm。

在本发明的一种优选实施方式中，所述脑心通指纹图谱共有24个指纹峰，相对保留时间分别为：1号峰：0.098-0.100；2号峰：0.202-0.202；3号峰：0.238-0.257；4号峰：相对保留时间0.330-0.347；5号峰：0.481-0.497；6号峰：0.523-0.538；7号峰：0.619-0.639；8号峰：0.648-0.669；9号峰：0.710-0.731；10号峰：0.724-0.745；11号峰：0.752-0.773；12号峰：0.784-0.807；13号峰：0.804-0.828；14号峰：0.857-0.880；15号峰：0.895-0.919；16号峰为参照峰：1；17号峰：1.087-1.110；18号峰：1.620-1.632；19号峰：1.726-1.737；20号峰：1.744-1.755；21号峰：1.897-1.904.；22号峰：1.909-1.916.；23号峰：1.941-1.948；24号峰：1.990-1.997。

本发明获得的脑心通指纹图谱的构建方法精密度高、稳定性和重现性好、方法简便，能快速、准确地评定脑心通的质量品质。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为28个批次的脑心通的指纹图谱；

图2为28个批次的脑心通图谱拟合的脑心通对照指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的技术方案，对于制备供试品溶液，选择用体积分数10-90％甲醇溶液提取脑心通粉末中的化学成分，实现充分提取的方式和时间，本领域的技术人员可根据实践经验选择和确定。提取后定容是本领域的常规手段。优选地，将脑心通粉末与体积分数10-90％甲醇混合后，称重，提取完毕后，再称重，用相同体积分数的甲醇补足失重，再取上清，可达到两个目的：充分提取和定容。此定容方法相对于取尽上清再用提取溶剂定容的方法，可以消除实验操作过程中的人为不能将上清悉数取尽所产生的误差，获得的结果更接近理论真实值。此定容方法是对传统的定容方法的改良。用此方法定容后，取部分上清液，能够满足后续实验的需求即可。简化了定容的实验步骤。当然，上述制备脑心通供试品溶液的方法并不是唯一制备供试品溶液的方法，本领域技术人员完全可以根据实践操作，采用其他制备脑心通供试品溶液的方法。对于提取脑心通粉末的试剂，本领域技术人员可根据实践经验选择乙醇、甲醇、正丁醇等溶剂中的一种或多种。

在本发明的技术方案中，在制备供试品溶液步骤优选提取试剂为体积分数75％甲醇，超声提取，超声提取时间35min，脑心通质量与体积分数75％甲醇溶液的体积比为1∶40(mg/mL)，优化甲醇溶液提取脑心通的工艺，实现高效、快速、充分提取脑心通中化学成分的目的。

本发明优选将供试品溶液与超纯水以体积比为5∶2稀释，再进行超高效液相色谱检测，目的在于：改变溶剂的极性，减少溶剂与流动相极性差异，从而改善峰形，获得高质量的色谱图。

在本发明的技术方案中，超高效液相色谱检测条件包括：以十八烷基键合硅胶柱为固定相，以100％乙腈∶100％甲醇体积比为1∶1的乙腈甲醇混合溶液为A相，体积分数0.1％磷酸水溶液为B相，组成流动相；采用梯度洗脱；检测波长：210-400nm；流速：0.1-0.5mL/min；柱温：25-40℃；进样量：1-5μl。其中洗脱程序：0-2min，A相∶B相＝87∶13；2-7min，A相∶B相＝(87-78)∶(13-22)；7-25min，A相∶B相＝(78-60)∶(22-40)；25-27min，A相∶B相＝(60-45)∶(40-55)；27-30min，A相∶B相＝45∶55；30-39min，A相∶B相＝(45-10)∶(55-90)；39-40min，A相∶B相＝(10-87)∶(90-13)。选用上述流动相的好处在于：供试品溶液中各成分均获得良好的峰形及分离度；采用上述洗脱程序的好处在于：供试品溶液中各成分分离度好，检测时间短、灵敏度高。

本发明的技术方案中色谱检测的波长范围在210-400nm，该波长范围涵盖了脑心通药品中所有的化学成分的吸收波长，优选在324nm波长下检测，好处在于：在该波长下，供试品溶液中的各成分均有良好的响应。

本发明所提及的术语“精密称定”：精密称定系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密量取”：指量取体积的准确度应符合国家标准中对该计量器具的精确度要求。

本发明所提及的10-90％甲醇溶液、75％甲醇、0.1％磷酸水溶液皆为体积分数。

在本领域中，含量测定的实验数据的相对标准偏差(RSD)在5％以内，说明实验结果真实可靠。

仪器和试药

美国WATERS超高效液相色谱(UPLC)ACCURICY***，包括四元超高压溶剂***，自动进样恒温样本管理器，二极管阵列(PDA)检测器，Empower 3色谱工作站；Millipore公司Mill-Q II型超纯水器；美国Sigma公司3K15高速离心机；瑞士Mettler Toledo公司AX205十万分之一天平；宁波新芝生物科技有限公司SB-1000YDTD超声波清洗器。

甲醇、乙腈(美国Fisher公司)，超纯水(Millipore超纯水净化***制得)，磷酸(色谱级)。

对照品绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、五没食子酰基葡萄糖、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮均购自于四川成都曼斯特生物技术有限公司。

脑心通胶囊(共28批，批号120756、120757、120759、120760、120761、120763、120764、120767、120770、120771、120773、120774、120775、120777、120778、120779、120781、120783、120784、120785、120787、120788、120801、120803、120804、120805、120819、120820)由陕西步长制药有限公司提供(0.4g/粒)。

实施例1

(1)、供试品溶液的制备

分别精密称定28个批次的脑心通粉末0.25g，加入75％甲醇，分别定容至10mL，分别称量脑心通粉末与75％甲醇混合液的重量，超声提取35min，放至室温，再称量混合液的重量，用75％甲醇补足失重，摇匀，离心14000rpm离心10min，离心2次，取上清液，即得28个批次的脑心通供试品溶液。

(2)、超高效液相色谱检测

将28个批次的脑心通供试品溶液分别用超纯水以体积比为5∶2稀释，再进行UPLC检测，色谱条件包括：以十八烷基键合硅胶柱为固定相，以100％乙腈∶100％甲醇体积比为1∶1的乙腈甲醇混合溶液为A相，0.1％磷酸水溶液为B相，组成流动相，0-2min，A相∶B相＝87∶13；2-7min，A相∶B相＝(87-78)∶(13-22)；7-25min，A相∶B相＝(78-60)∶(22-40)；25-27min，A相∶B相＝(60-45)∶(40-55)；27-30min，A相∶B相＝45∶55；30-39min，A相∶B相＝(45-10)∶(55-90)；39-40min，A相∶B相＝(10-87)∶(90-13)；检测波长为324nm；流速0.2mL/min；柱温40℃；进样量2μL。理论塔板数丹酚酸B(324nm)＝5.54(tR/W_h/2)²＝324850.3。获得28个批次的脑心通色谱图。28个批次脑心通保留时间及峰面积见表1。

表1 28个批次脑心通保留时间及峰面积范围结果

以16号丹酚酸B特征峰的相对保留时间和相对保留面积为1，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2。

表2 特征指纹峰的相对保留时间和相对峰面积

(3)、脑心通指纹图谱的构建

将28个批次的脑心通色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***》(2004A)版进行分析，即得28个批次的脑心通指纹图谱(如图1所示)和28个批次的脑心通色谱拟合的脑心通对照指纹图谱(如图2所示)，脑心通特征指纹峰共有24个，其峰面积占总峰面积的80％以上。以120756批次的脑心通色谱图为参照，其他批次的脑心通与之比较，相似度均大于0.971；以拟合的对照指纹图谱为参照，28个批次的脑心通与之比较，相似度均大于0.976(如表3所示)，说明本发明脑心通指纹图谱的构建方法准确可靠。

表3 相似度结果

以下选取批次为120805的脑心通胶囊，通过精密度、重复性和稳定性试验，对本发明的技术方案进行方法学验证。

(4)、混合对照品溶液的制备

分别精密称定羟基红花黄色素A(HSYA)、五没食子酰基葡萄糖、山奈酚-3-O-芸香糖苷、紫草酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮、藁本内酯、丁烯基苯酞对照品2mg，加100％甲醇溶解定容至1mL，配制成浓度为2mg/mL的各种对照品母液；分别精密称定绿原酸、阿魏酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、隐丹参酮对照品1mg，加100％甲醇溶解定容至1mL，配制成浓度为1mg/mL的各种对照品母液。

分别精密量取绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、五没食子酰基葡萄糖、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮、藁本内酯、丁烯基苯酞和隐丹参酮对照品母液60μL、60μL、30μL、60μL、30μL、45μL、45μL、60μL、120μL、90μL、50μL、60μL、45μL和60μL，100％甲醇定容至1mL。即得混合对照品母液。其中绿原酸浓度为60μg/mL、羟基红花黄色素A浓度为120μg/mL、阿魏酸浓度为30μg/mL、五没食子酰基葡萄糖浓度为120μg/mL、3，5-二咖啡酰奎宁酸浓度为30μg/mL、1，5-二咖啡酰奎宁酸浓度为45μg/mL、山奈酚-3-O-芸香糖苷浓度为90μg/mL、迷迭香酸浓度为60μg/mL、紫草酸浓度为240μg/mL、丹酚酸B浓度为180μg/mL、毛蕊异黄酮浓度为100μg/mL、藁本内酯浓度为120μg/mL、丁烯基苯酞浓度为90μg/mL、隐丹参酮浓度为60μg/mL，将母液按照1/2，1/5，1/10，1/25，1/50，1/125，1/250、1/300倍，用100％甲醇逐级稀释，得到相应浓度的混合对照品溶液(见表4)，分别注入液相色谱仪，进样2μL进行测定，绘制得到标准曲线，结果见表5。

表4 混合对照品溶液的浓度(μg/mL)

表5 各对照品标准曲线

(5)、精密度试验

精密称定批次为120805的脑心通胶囊0.25g，提取按实施例1步骤(1)进行，色谱检测按实施例1步骤(2)进行。进样2μL进行测定。计算绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、五没食子酰基葡萄糖、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮的含量，RSD均小于5％，符合精密度要求，结果见表6。

(6)、稳定性试验

精密称定批次为120805的脑心通胶囊0.25g，提取按实施例1步骤(1)进行，色谱检测按实施例1步骤(2)进行。分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h，分别注入液相色谱仪，进样2μL进行测定，考察供试品溶液的稳定性。计算绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、五没食子酰基葡萄糖、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮的含量，RSD均小于5％。结果表明供试品溶液室温放置24h基本稳定，结果见表7。

(7)、重复性试验

精密称定批次为120805的脑心通胶囊0.25g，提取按实施例1步骤(1)进行，平行处理6份样品，色谱检测按实施例1步骤(2)进行。分别注入液相色谱仪，进样2μL进行测定，考察实验的重复性。计算绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、五没食子酰基葡萄糖、3，5-二咖啡酰奎宁酸、1，5-二咖啡酰奎宁酸、山奈酚-3-O-芸香糖苷、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、毛蕊异黄酮、藁本内酯、丁烯基苯酞、隐丹参酮的含量，RSD均小于5％。结果表明本发明的构建方法重复性好，结果见表8。

上述精密度、重复性和稳定性试验结果表明，脑心通指纹图谱的构建方法具有精密度高、稳定性和重现性好、方法简便的特点，能快速、准确地鉴别脑心通的质量品质。

在本领域中，中药色谱图与对照指纹图谱相比，相似度大于0.9，即可确定该指纹图谱的构建方法准确可靠。据此，对于脑心通的质量检测，可以以28个批次的脑心通色谱拟合的对照指纹图谱为标准，来评定脑心通的质量品质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、制备供试品溶液

(2)、超高效液相色谱检测

将供试品溶液注入超高效液相色谱仪中，进行检测，即得脑心通供试品的色谱图；其中色谱检测条件包括：以十八烷基键合硅胶柱为固定相，以100％乙腈:100％甲醇体积比为1:1的乙腈甲醇混合溶液为A相，体积分数0.1％磷酸水溶液为B相，组成流动相；采用梯度洗脱；检测波长：210-400nm；流速：0.1-0.5mL/min；柱温：25-40℃；进样量：1-5μL；其中洗脱程序：0-2min，A相:B相＝87:13；2-7min，A相:B相＝(87-78):(13-22)；7-25min，A相:B相＝(78-60):(22-40)；25-27min，A相:B相＝(60-45):(40-55)；27-30min，A相:B相＝45:55；30-39min，A相:B相＝(45-10):(55-90)；39-40min，A相:B相＝(10-87):(90-13)；

(3)、构建脑心通指纹图谱

2.如权利要求1所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述制备供试品溶液的步骤为：称定质量为M的脑心通粉末，加入V体积的体积分数10-90％甲醇溶液，得到二者混合液，称定混合液的重量M₁，提取，再称重，用相应浓度甲醇补足失重至M₁，离心，取上清液，即得供试品溶液。

3.如权利要求2所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述的甲醇溶液的体积分数为75％。

4.如权利要求2所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述提取为超声提取，超声提取35min。

5.如权利要求3所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述脑心通粉末质量与体积分数75％甲醇溶液的体积比为1mg:40mL。

6.如权利要求5所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，将所述的供试品溶液与超纯水以体积比为5:2稀释，再进行超高效液相色谱检测。

7.如权利要求1所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述柱温为40℃；所述流速：0.2mL/min；所述进样量：2μL。

8.如权利要求5所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述检测波长为324nm。

9.如权利要求1所述的一种脑心通指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述脑心通指纹图谱共有24个指纹峰，相对保留时间分别为：1号峰：0.098-0.100；2号峰：0.202-0.202；3号峰：0.238-0.257；4号峰：相对保留时间0.330-0.347；5号峰：0.481-0.497；6号峰：0.523-0.538；7号峰：0.619-0.639；8号峰：0.648-0.669；9号峰：0.710-0.731；10号峰：0.724-0.745；11号峰：0.752-0.773；12号峰：0.784-0.807；13号峰：0.804-0.828；14号峰：0.857-0.880；15号峰：0.895-0.919；16号峰为参照峰：1；17号峰：1.087-1.110；18号峰：1.620-1.632；19号峰：1.726-1.737；20号峰：1.744-1.755；21号峰：1.897-1.904.；22号峰：1.909-1.916.；23号峰：1.941-1.948；24号峰：1.990-1.997。