CN108508107A - 一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法，所述有效成分包括迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A。其步骤包括向待测血浆样品中加入抗氧化剂、有机酸和内标溶液，混匀，所述有机酸为甲酸或乙酸中的一种，内标溶液为氯霉素溶液，氯霉素溶液浓度为1～5μg·mL‑1；加入极性有机溶剂，混匀，离心，去除蛋白；吸取有机溶液层，挥干；加入30～50％甲醇水溶液复溶，混匀，离心，取上清液；采用液相色谱串联质谱法，多反应监测扫描。该方法专属性好、灵敏度高，精密度、准确度、提取回收率、基质效应和稳定性均达到了体内药物分析的要求。

Description

一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体而言，是一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法。
背景技术
血必净注射液是由古方血府逐瘀汤精炼而成的现代复方中药，由红花、赤芍、丹参、当归、川芎五味中药组成，具有活血化瘀、清热凉血、溃散毒邪等功效。临床主要用于治疗全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症(Sepsis)、多器官功能障碍综合症(MODS)等。血必净注射液可通过抗炎、抗血小板聚集、促血管新生等作用对脓毒症疾病的发生、发展过程进行干预和阻断，降低脓毒症发生率和死亡率，体现中药多成分、多途径、多靶点的特点。
目前血必净注射液的研究主要集中在药理作用机制探讨和临床疗效观察与评价等方面。但药物成分入血后存在基质干扰严重，血药浓度低达不到检测限等问题，采用现有文献报道的针对血必净注射液制剂的质量控制的测定方法无法满足生物样品的测定。因此，建立一种能够测定血液中血必净多个有效成分的分析方法，尤其是同时测定体内暴露程度较高的羟基红花黄色素A、芍药苷、芍药内酯苷，对提高临床合理用药，后期对扩大药品适应症范围的研究具有积极意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法，同时测定血浆中血必净注射液有效成分迷迭香酸(RA)、芍药苷(PE)、氧化芍药苷(Oxy-PE)、苯甲酰芍药苷(Ben-PE)、芍药内酯苷(AF)和羟基红花黄色素A(HSYA)，该方法具有检测结果准确、灵敏度高、方法稳定的特点。
为解决以上技术问题，本发明所述的一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法，所述有效成分包括迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A，包括步骤：
(1)样品的制备和(2)采用液相色谱串联质谱法，多反应监测扫描；
所述步骤(1)包括：
a)向待测血浆样品中加入抗氧化剂、有机酸和内标溶液，混匀，所述有机酸为甲酸或乙酸中的一种，内标溶液为氯霉素溶液，氯霉素溶液浓度为1～5μg·mL-1；
b)加入极性有机溶剂，混匀，离心，去除蛋白；
c)吸取有机溶液层，挥干；
d)加入30～50％甲醇水溶液复溶，混匀，离心，取上清液；
所述步骤(2)液相色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为水或含有0.05～0.3vt.％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇或含0.05-0.1vt.％甲酸的乙腈，流速为0.2～0.5mL·min-1，梯度线性洗脱，柱温设定为15～40℃。
所述步骤(2)质谱检测条件为：采用电喷雾负离子检测模式；毛细管电压(Capillary)：0.5～4kV；锥孔电压(Cone Voltage)：1～90V；喷雾气压力(Nebuliser)：5～10Bar；脱溶剂气温度(Desolvation Temp)：350～550℃；脱溶剂气流量(Desolvation GasFlow)：500～1000L·h-1；锥孔气流量(Cone Gas Flow)：100～200L·h-1；碰撞气氩气流量(Collision Gas Flow)：0.1～0.3mL·min-1；入口电压(Enter Potential)：8～40V；去簇电压(Declustering Potential)：5～200V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～20V。
进一步地，所述多反应监测扫描方法的参数如下，
氯霉素(CAP)：母离子质量数(Q1)：321.03/320.9；子离子质量数(Q3)：160.89/160.9；锥孔电压(Cone Voltage)：30～60V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～30V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：50～80V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：10～20V。
芍药苷(PE)：母离子质量数(Q1)：525.17/525.2；子离子质量数(Q3)：449.10/120.8；锥孔电压(Cone Voltage)：20～40V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：60～80V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V。
氧化芍药苷(Oxy-PE)：母离子质量数(Q1)：494.97/495.1；子离子质量数(Q3)：136.97/136.8；锥孔电压(Cone Voltage)：1～10V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：110～130V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V。
苯甲酰芍药苷(Ben-PE)：母离子质量数(Q1)：583.2/583.1；子离子质量数(Q3)：120.7/120.98；锥孔电压(Cone Voltage)：60～90V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～40V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：110～130V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V。
芍药内酯苷(AF)：母离子质量数(Q1)：525.10/525.2；子离子质量数(Q3)：478.93/120.8；锥孔电压(Cone Voltage)：30～60V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：70～100V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～8V。
羟基红花黄色素A(HSYA)：母离子质量数(Q1)：611.12/611.2；子离子质量数(Q3)：402.96/491.0；锥孔电压(Cone Voltage)：60～90V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～40V；入口电压(Enter Potential)：10～40V；去簇电压(Declustering Potential)：140～160V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：8～13V。
迷迭香酸(RA)：母离子质量数(Q1)：359.03/359.18/359.03/358.9；子离子质量数(Q3)：160.89/197.14/79.20/160.9；锥孔电压(Cone Voltage)：20～50V；驻留时间(DewllTime)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～30V；入口电压(Enter Potential)：8～15V；去簇电压(Declustering Potential)：40～70V；碰撞室出口电压(Cell ExitPotential)：13～17V。
进一步地，步骤a)中所述待测血浆样品与抗氧化剂的体积比为10:1；所述的抗氧化剂为抗坏血酸或维生素E，浓度为4mg·mL-1；所述氯霉素溶液浓度为1μg·mL-1。
进一步地，步骤b)中，所述极性有机溶剂为甲醇、乙腈或甲醇-乙腈混合液，所述待测血浆样品与极性有机溶剂的体积比为1:(3～5)。
进一步地，甲醇-乙腈混合液体积比为1:1。
进一步地，步骤a)，b)，d)中，所述混匀方式采用涡旋混匀，时间为30秒～3分钟。
进一步地，步骤b)，d)中，所述离心转数为14000rpm，时间为5～10分钟。
进一步地，步骤b)，d)中，所述离心步骤前还可包括超声步骤，超声时间为30～60秒。
进一步地，步骤2)中，色谱柱选自Waters ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱或AgilentEclipse plus C18。
进一步地，梯度线性洗脱***程序为：0～0.60min(95％A、5％B)；0.60～0.61min(85％A、15％B)；0.61～2.30min(35％A、65％B)；2.30～2.50min(5％A、95％B)；2.50～3.00min(5％A、95％B)；3.00～3.01min(95％A、5％B)；3.01～4.00min(95％A、5％B)。
上述发明所具有的有益效果如下：
1.采用本方法所建立的UPLC-MS/MS检测血浆样品中血必净注射液的主要入血有效成分，选择氯霉素作为内标，测定了迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的血药浓度-时间曲线，确定了各成分的药代动力学参数。实验结果证实了中药复方多组分协同治疗疾病的物质基础，以迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A为目标成分，进一步明确了这些成分在机体中的暴露程度和体内过程，为阐明血必净注射液通过多组分、多靶点、多途径发挥作用提供实验依据。
2.考察了血浆样品中血必净注射液主要成分的专属性验证、精密度、准确度、提取回收率、基质效应、最低定量限及稳定性。方法学结果表明，迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A及内标各成分的分离度和色谱峰形良好，血浆中无内源性物质干扰测定，上述目标化合物的最低定量限0.1～1ng·mL-1，说明建立的分析方法具有较高的灵敏度，可用于血浆中低浓度药物的检测。
3.本发明所建立的UPLC-MS/MS检测方法可以同时检测血必净注射液中多种有效成分的血药浓度数据，该方法专属性好、灵敏度高，精密度、准确度、提取回收率、基质效应和稳定性均达到了体内药物分析的要求。
4.采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站中的分子特征提取(Molacular Feature Extrction,MFE)功能，通过设定合适的阈值参数，对血必净注射液正负离子模式下采集到的总离子流图进行提取，获得化合物的准分子离子峰和加合离子峰(如[M-H]-、[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+HCOO]-等)信息，根据准分子离子峰所提供的化合物精确分子质量，结合二级质谱碎片、UV谱图及文献报道，共鉴定出血必净注射液中含有核苷类，黄酮类，单萜类，酚酸类，苯丙酸类，苯酞类等96个化学成分。对于后续开展血必净注射液吸收入血成分的研究奠定了基础。
附图说明
图1为实施例1不同化合物专属性考察色谱图：
其中，图1-a为内标氯霉素IS(CAP)、图1-b为芍药苷(PE)、图1-c为氧化芍药苷(Oxy-PE)、图1-d为苯甲酰芍药苷(Ben-PE)、图1-e为芍药内酯苷(AF)、图1-f为羟基红花黄色素A(HSYA)、图1-g为迷迭香酸(RA)；图中A为空白血浆色谱图、B为空白血浆加入标准品后的色谱图、C为小鼠用药后5min的血浆样品色谱图。
图2为实施例1血浆中芍药苷(PE)、氧化芍药苷(Oxy-PE)、苯甲酰芍药苷(Ben-PE)、芍药内酯苷(AF)、羟基红花黄色素A(HSYA)、迷迭香酸(RA)的血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
本发明一种典型的实施方式提供的一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法，所述有效成分包括迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A，包括步骤：
(1)样品的制备和(2)采用液相色谱串联质谱法，多反应检测扫描；
所述步骤(1)包括：
a)向待测血浆样品中加入抗氧化剂、有机酸和内标溶液，混匀，所述有机酸为甲酸或乙酸中的一种，内标溶液为氯霉素溶液，氯霉素溶液浓度为1～5μg·mL-1；
优选地，步骤a)中所述待测血浆样品与有机酸的体积比为10:1，有机酸可以较好的优化峰形，提高检测灵敏度；所述的抗氧化剂为抗坏血酸或维生素E，浓度为4mg·mL-1，抗氧化剂可以有效防止在样品处理过程中，待测物发生部分氧化，影响结果测定；所述氯霉素溶液浓度为1μg·mL-1。
b)加入极性有机溶剂，混匀，离心，去除蛋白；
优选地，步骤b)中，所述极性有机溶剂为甲醇、乙腈或甲醇-乙腈混合液，所述待测血浆样品与极性有机溶剂的体积比为1:(3～5)。甲醇-乙腈混合液体积比为1:1。
c)吸取有机溶液层，挥干；
d)加入30～50％甲醇水溶液复溶，混匀，离心，取上清液。
优选地，步骤a)，b)，d)中，所述混匀方式采用涡旋混匀，时间为30秒～3分钟。步骤b)，d)中，所述离心转数为14000rpm，时间为5～10分钟。步骤b)，d)中，所述离心步骤前还可包括超声步骤，超声时间为30～60秒。
步骤(2)液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，优选自WatersACQUITYUPLC BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)或Agilent Eclipse plus C18(100mm×4.6mm,3.5μm)。流动相A为水或含有0.05～0.3vt.％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇或含0.05-0.1vt.％甲酸的乙腈，流速为0.2～0.5mL·min-1，梯度线性洗脱，柱温设定为15～40℃；
优选的，当流动相B为甲醇时，加入0.05～0.1vt.％甲酸，可以改善色谱峰拖尾的现象，使色谱峰形更好。
步骤(2)质谱检测条件为：采用电喷雾负离子检测模式；毛细管电压(Capillary)：0.5～4kV；锥孔电压(Cone Voltage)：1～90V；喷雾气压力(Nebuliser)：5～10Bar；脱溶剂气温度(Desolvation Temp)：350～550℃；脱溶剂气流量(Desolvation Gas Flow)：500～1000L·h-1；锥孔气流量(Cone Gas Flow)：100～200L·h-1；碰撞气氩气流量(CollisionGas Flow)：0.1～0.3mL·min-1；入口电压(Enter Potential)：8～40V；去簇电压(Declustering Potential)：5～200V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～20V。
在一种优选的实施方式中，步骤(2)中，多反应监测扫描方法的参数如下：
氯霉素(CAP)：母离子质量数(Q1)：321.03/320.9；子离子质量数(Q3)：160.89/160.9；锥孔电压(Cone Voltage)：30～60V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～30V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：50～80V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：10～20V。
芍药苷(PE)：母离子质量数(Q1)：525.17/525.2；子离子质量数(Q3)：449.10/120.8；锥孔电压(Cone Voltage)：20～40V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：60～80V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V。
氧化芍药苷(Oxy-PE)：母离子质量数(Q1)：494.97/495.1；子离子质量数(Q3)：136.97/136.8；锥孔电压(Cone Voltage)：1～10V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：110～130V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V。
苯甲酰芍药苷(Ben-PE)：母离子质量数(Q1)：583.2/583.1；子离子质量数(Q3)：120.7/120.98；锥孔电压(Cone Voltage)：60～90V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～40V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：110～130V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V。
芍药内酯苷(AF)：母离子质量数(Q1)：525.10/525.2；子离子质量数(Q3)：478.93/120.8；锥孔电压(Cone Voltage)：30～60V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：70～100V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～8V。
羟基红花黄色素A(HSYA)：母离子质量数(Q1)：611.12/611.2；子离子质量数(Q3)：402.96/491.0；锥孔电压(Cone Voltage)：60～90V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～40V；入口电压(Enter Potential)：10～40V；去簇电压(Declustering Potential)：140～160V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：8～13V。
迷迭香酸(RA)：母离子质量数(Q1)：359.03/359.18/359.03/358.9；子离子质量数(Q3)：160.89/197.14/79.20/160.9；锥孔电压(Cone Voltage)：20～50V；驻留时间(DewllTime)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～30V；入口电压(Enter Potential)：8～15V；去簇电压(Declustering Potential)：40～70V；碰撞室出口电压(Cell ExitPotential)：13～17V。
在另一种优选的实施方式中，步骤(2)中，梯度线性洗脱***程序为：0～0.60min(95％A、5％B)；0.60～0.61min(85％A、15％B)；0.61～2.30min(35％A、65％B)；2.30～2.50min(5％A、95％B)；2.50～3.00min(5％A、95％B)；3.00～3.01min(95％A、5％B)；3.01～4.00min(95％A、5％B)。
本发明一种实施方式提供一种液相色谱串联质谱法同时测定血浆样本中迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的含量的方法，具体包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：
取一系列浓度的迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照上述a)中样品的制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述液相色谱串联质谱法进行检测，分别记录每个浓度的迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A对应的峰面积；分别以迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A峰面积与内标峰面积比值Y作为纵坐标，以迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A浓度X为横坐标，计算迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的回归方程。
(2)待测血浆样品中迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的含量测定：
将待测血浆样品按照上述a)中样品的制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，分别记录迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A对应的峰面积；通过随行标准曲线分别计算待测血浆样品中迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的浓度。
本发明所述方法可成功用于血必净注射液主要成分迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的药代动力学研究。
所述血必净注射液由红花、赤芍、川芎、丹参、当归等5味中药组成的复方中药制剂。本发明建立了去除血浆中蛋白的血浆样品处理方法，采用液质联用(UPLC-MS/MS)分析方法，同时测定注射血必净注射液后，血浆中迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A的血药浓度浓度变化情况，并对之进行方法学考察，结果表明：所建立的方法符合体内生物样品测定要求，灵敏度高，专属性强，稳定、可靠，适宜含量较低物质的检测。
此外，本发明还提供一种采用UPLC-Q-TOF/MS法对血必净注射液的化学成分进行定性分析，即首先通过一级质谱全扫描获得众多化合物的精确质量数，利用工作站中的分子特征提取(MFE)到的化合物精确质量数信息与自定义构建的血必净注射液化合物数据库检索结果相结合，得到与血必净注射液可能含有的候选化学成分；然后，采集二级质谱图，对所得到的特征碎片离子进行解析，同时利用相关文献报道化合物的裂解规律，进一步鉴定和确证各化合物，实现血必净注射液主要成分的快速定性分析的方法。
以下结合一些实施例对本发明技术方案和技术效果作进一步说明。
实施例1
1)样品处理：
采集小鼠腹腔注射血必净后的血浆样品(去除眼球取全血抗凝，8000rpm离心10min，上清液即为血浆)，精密吸取待测血浆100μL，加入10μL抗坏血酸溶液(4mg·mL-1，纯水配制)，10μL内标溶液(1μg·mL-1氯霉素溶液)，涡旋1min，加入300μL甲醇-乙腈(1:1)沉淀蛋白，涡旋3min后，14000rpm离心10min，之后取上清液30℃真空浓缩挥干，100μL 30％甲醇水(含0.1vt.％甲酸)复溶，涡旋混匀1min，超声1min，涡旋混匀1min，14000rpm离心5min，取上清液进样测定。
2)采用液质联用仪(UPLC-MS/MS)进行测定：
液相部分色谱条件：分析柱采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，保护柱采用Waters ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相A：水(含0.1vt.％甲酸)，流动相B：甲醇；采用梯度线性洗脱，其程序为：0～0.60min(95％A、5％B)；0.60～0.61min(85％A、15％B)；0.61～2.30min(35％A、65％B)；2.30～2.50min(5％A、95％B)；2.50～3.00min(5％A、95％B)；3.00～3.01min(95％A、5％B)；3.01～4.00min(95％A、5％B)。；流速：0.4mL·min-1；柱温：25℃。
质谱检测条件：电喷雾负离子检测模式；毛细管电压(Capillary)：2.3kV；锥孔电压(Cone Voltage)：30V；喷雾气压力(Nebuliser)：7Bar；脱溶剂气温度(DesolvationTemp)：350℃；脱溶剂气流量(Desolvation Gas Flow)：600L·h-1；锥孔气流量(Cone GasFlow)：150L h-1；碰撞气流量(Collision Gas Flow)：0.14mL·min-1。
表1.采用多反应监测模式(MRM)扫描
3)供试品溶液的制备
对照品储备液的制备：精密称取迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、羟基红花黄色素A、芍药内酯苷的标准品适量，分别置于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为迷迭香酸1.00mg·mL-1、芍药苷5.00mg·mL-1、氧化芍药苷0.20mg·mL-1、苯甲酰芍药苷0.05mg·mL-1、羟基红花黄色素A 1.00mg·mL-1、芍药内酯苷0.05mg·mL-1的对照品储备液。
混合对照品溶液的制备：精密吸取上述各对照品储备液适量，用50％甲醇水配制成混合对照品母液，含各对照品浓度分别为迷迭香酸100μg·mL-1、芍药苷250μg·mL-1、氧化芍药苷20μg·mL-1、苯甲酰芍药苷5μg·mL-1、羟基红花黄色素A 100μg·mL-1、芍药内酯苷5μg·mL-1。将混合对照品母液用50％甲醇水依次倍比稀释，得8个标准曲线系列工作液。
内标溶液的配制：精密称取氯霉素标准品适量，置于棕色容量瓶中，用甲醇配制成浓度为2.00mg·mL-1的储备液，然后用50％甲醇水适量配制成1.00μg·mL-1的内标对照品工作液。
4)方法学验证
4.1专属性
在已建立的检测条件下，分别制备6只不同批次大鼠的空白血样(不含待分析物和内标)进行分析，检测血浆中内源性物质和其他物质对目标成分的干扰程度，结果显示血浆中无内源性物质干扰测定，目标成分和内标成分分离度高，峰形良好。
4.2血浆样品的标准曲线
取空白血浆100μL，加入抗坏血酸溶液(4mg·mL-1，纯水配制)10μL，分别加入8个标准曲线系列工作液10μL，内标溶液10μL，加入300μL甲醇-乙腈(1:1)沉淀蛋白，涡旋3min后，14000rpm离心10min，之后取上清液30℃真空浓缩挥干，加入100μL 30％甲醇水(含0.1vt.％甲酸)复溶，涡旋混匀1min，超声1min，涡旋混匀1min，14000rpm离心5min，进样10μL测定。记录色谱图，以目标化合物与内标峰面积比y与血药浓度x进行线性回归，权重1/X2，得回归方程。
表2.线性范围及最低定量限
由表可知，r均大于0.9950，6种化合物的最低定量限介于0.1～1ng·mL-1之间，表明所建立的分析方法具有较高的灵敏度，可用于血浆中低浓度药物的检测。
4.3精密度与准确度
取空白血浆100μL，按样品处理方法操作，配制成含标准品浓度为低、中、高3个浓度的血浆样品各6份，记录目标化合物峰面积和内标峰面积，计算其比值，代入随行标准曲线中计算浓度，计算日内准确度与精密度，连续同法操作处理、测定3天，计算日间精密度与准确度。精密度为测得浓度的变异值，以RSD表示，准确度(Accuracy)用测得的浓度与真实浓度比值的百分数表示。所有化合物的测定准确度均大于85％，RSD均小于10％，结果见表2，符合生物样品测定关于精密度与准确度的要求。
表3. 6个化合物批内(Intar-day)、批间(Inter-day)精密度与准确度的测定
4.4提取回收率和基质效应的考察
取空白血浆100μL，分别加入混合对照品溶液，配制成低、中、高3个浓度的质控样品各6份，各个化合物的浓度同“4.3精密度与准确度”项下，按样品处理方法操作，为溶液A，进样10μL测定，记录目标化合物峰面积As。
取空白血浆100μL，按样品处理方法操作，得含空白基质的残渣，分别加入100μL用流动相B配制的与溶液A同等浓度的低、中、高对照工作液及内标溶液复溶，制备含空白基质的复合溶液，每个浓度平行6份，为溶液B，进样10μL测定，记录峰面积Am。
另取上述流动相B配制的与溶液A同等浓度的低、中、高对照工作液及内标溶液，每个浓度平行6份，为溶液C，进样10μL测定，记录峰面积为Asd。
根据提取回收率计算公式RE(％)＝As/Am×100％和基质效应计算公式ME(％)＝Am/Asd×100％，分别计算6个化合物低、中、高浓度的提取回收率和基质效应，平均提取回收率和基质效应均大于85％，结果见表4，符合生物样品测定关于提取回收率和基质效应的要求。
表4 6个化合物的提取回收率和基质效应
4.5稳定性考察
取空白血浆100μL，分别加入混合对照品溶液，配制成低、中、高3个浓度的质控样品，各个化合物的浓度同“4.3精密度与准确度”项下，分别考察其在室温4h，反复冻融1次、3次后，按样品的处理方法操作，以及按样品的处理方法处理后4℃放置24h的稳定性，每个浓度均平行3份，进样10μL测定，根据校正曲线计算标准品浓度，其RSD值均小于12％，结果见表5，符合生物样品测定关于稳定性的要求。
表5 6个化合物的稳定性考察
4.6大鼠单次给药后的血药浓度测定结果
取10只大鼠，根据取血时间点按时取血，按样品处理方法操作后进样测定，根据随行的标准曲线计算血药浓度。对于血药浓度太高而超出线性范围的样品，用空白血浆按合适倍数稀释，重新按样品处理方法操作后进样测定，测得浓度乘以稀释因子得实际血药浓度。绘制各时间点平均血药浓度(C)-时间(T)曲线，结果见表6和图2。
表6.大鼠单次给药后各化合物的血药浓度(μg·L-1)
N.D：浓度低于定量限
结果表明：在该样品处理及检测条件下，该检测方法专属性良好、灵敏度高，提取回收率、基质效应和稳定性均达到了体内药物分析的要求。
实施例2
本发明的检测方法，步骤如下：
1)样品处理：
采集大鼠尾静脉注射血必净后的血浆样品，(眼底静脉丛取全血抗凝，8000rpm离心10min，上清液即为血浆)，精密吸取待测血浆100μL，加入10μL维生素E溶液(4mg·mL-1，甲醇配制)，10μL内标(1μg·mL-1氯霉素溶液)，涡旋1min，加入300μL甲醇沉淀蛋白，涡旋3min后，14000rpm离心10min，取上清液30℃氮气流挥干液体，加入100μL 50％甲醇水复溶，涡旋混匀，进样测定。
2)采用液质联用仪(UPLC-MS/MS)进行测定：
液相部分色谱条件：分析柱采用Agilent Eclipse plus C18(100mm×4.6mm,3.5μm)，保护柱采用Phenomenex Gemini C18(4mm×3.0mm,10μm)；流动相A相为水(含0.1vt.％甲酸)，B相为乙腈(含0.1vt.％甲酸)；采用梯度线性洗脱，其程序为：0mim，(85％A、15％B)；0～7.00min(35％A、65％B)；7.00～8.00min(2％A、98％B)；8.00～8.01min(85％A、15％B)；8.01～11.00min(85％A、15％B)；流速：0.5mL/min；柱温：25℃。
质谱检测条件：负离子检测模式；毛细管电压(Capillary)：4kV；锥孔电压(ConeVoltage)：30V；喷雾气压力(Nebuliser)：6Bar；脱溶剂气温度(Desolvation Temp)：350℃；脱溶剂气流量(Desolvation Gas Flow)：600Lh-1；锥孔气流量(Cone Gas Flow)：150Lh-1；碰撞气流量(Collision Gas Flow)：0.14mLmin-1。
表7 采用多反应监测模式(MRM)扫描
结果表明：在该样品处理及检测条件下，该检测方法专属性良好、灵敏度高，提取回收率、基质效应和稳定性均达到了体内药物分析的要求。

Claims (10)

1.一种同时测定血浆中血必净注射液有效成分的方法，所述有效成分包括迷迭香酸、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A，其特征在于，包括步骤：
(1)样品的制备和(2)采用液相色谱串联质谱法，多反应监测扫描；
所述步骤(1)包括：
a)向待测血浆样品中加入抗氧化剂、有机酸和内标溶液，混匀，所述有机酸为甲酸或乙酸中的一种，内标溶液为氯霉素溶液，氯霉素溶液浓度为1～5μg·mL-1；
b)加入极性有机溶剂，混匀，离心，去除蛋白；
c)吸取有机溶液层，挥干；
d)加入30～50％甲醇水溶液复溶，混匀，离心，取上清液；
所述步骤(2)液相色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为水或含有0.05～0.3vt.％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇或含0.05～0.1vt.％甲酸的乙腈，流速为0.2～0.5mL/min，梯度线性洗脱，柱温设定为15～40℃；
所述步骤(2)质谱检测条件为：采用电喷雾负离子检测模式；毛细管电压(Capillary)：0.5～4kV；锥孔电压(Cone Voltage)：1～90V；喷雾气压力(Nebuliser)：5～10Bar；脱溶剂气温度(Desolvation Temp)：350～550℃；脱溶剂气流量(Desolvation Gas Flow)：500～1000L·h-1；锥孔气流量(Cone Gas Flow)：100～200L·h-1；碰撞气氩气流量(CollisionGas Flow)：0.1～0.3mL·min-1；入口电压(Enter Potential)：8～40V；去簇电压(Declustering Potential)：5～200V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～20V。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多反应检测扫描方法的参数如下，
氯霉素(CAP)：母离子质量数(Q1)：321.03/320.9；子离子质量数(Q3)：160.89/160.9；锥孔电压(Cone Voltage)：30～60V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～30V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：50～80V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：10～20V；
芍药苷(PE)：母离子质量数(Q1)：525.17/525.2；子离子质量数(Q3)：449.10/120.8；锥孔电压(Cone Voltage)：20～40V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(CollisionEnergy)：10～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(DeclusteringPotential)：60～80V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V；
氧化芍药苷(Oxy-PE)：母离子质量数(Q1)：494.97/495.1；子离子质量数(Q3)：136.97/136.8；锥孔电压(Cone Voltage)：1～10V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：110～130V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V；
苯甲酰芍药苷(Ben-PE)：母离子质量数(Q1)：583.2/583.1；子离子质量数(Q3)：120.7/120.98；锥孔电压(Cone Voltage)：60～90V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～40V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：110～130V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～10V；
芍药内酯苷(AF)：母离子质量数(Q1)：525.10/525.2；子离子质量数(Q3)：478.93/120.8；锥孔电压(Cone Voltage)：30～60V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～50V；入口电压(Enter Potential)：10～20V；去簇电压(Declustering Potential)：70～100V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：5～8V；
羟基红花黄色素A(HSYA)：母离子质量数(Q1)：611.12/611.2；子离子质量数(Q3)：402.96/491.0；锥孔电压(Cone Voltage)：60～90V；驻留时间(Dewll Time)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：20～40V；入口电压(Enter Potential)：10～40V；去簇电压(Declustering Potential)：140～160V；碰撞室出口电压(Cell Exit Potential)：8～13V；
迷迭香酸(RA)：母离子质量数(Q1)：359.03/359.18/359.03/358.9；子离子质量数(Q3)：160.89/197.14/79.20/160.9；锥孔电压(Cone Voltage)：20～50V；驻留时间(DewllTime)：23～25ms；碰撞能量(Collision Energy)：10～30V；入口电压(Enter Potential)：8～15V；去簇电压(Declustering Potential)：40～70V；碰撞室出口电压(Cell ExitPotential)：13～17V。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述待测血浆样品与抗氧化剂的体积比为10:1；所述的抗氧化剂为抗坏血酸或维生素E，浓度为4mg·mL-1；所述氯霉素溶液浓度为1μg·mL-1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤b)中，所述极性有机溶剂为甲醇、乙腈或甲醇-乙腈混合液，所述待测血浆样品与极性有机溶剂的体积比为1:(3～5)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：甲醇-乙腈混合液体积比为1:1。
6.根据权利要求1或4或5所述的方法，其特征在于：步骤a)，b)，d)中，所述混匀方式采用涡旋混匀，时间为30秒～3分钟。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b)，d)中，所述离心转数为14000rpm，时间为5～10分钟。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：步骤b)，d)中，所述离心步骤前还包括超声步骤，超声时间为30～60秒。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，色谱柱选自WatersACQUITYUPLC BEH C18色谱柱或Agilent Eclipse plus C18。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，梯度线性洗脱***程序为：0～0.60min(95％A、5％B)；0.60～0.61min(85％A、15％B)；0.61～2.30min(35％A、65％B)；2.30～2.50min(5％A、95％B)；2.50～3.00min(5％A、95％B)；3.00～3.01min(95％A、5％B)；3.01～4.00min(95％A、5％B)。
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