CN109307721B

CN109307721B - 一种hplc-qqq/ms法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法

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Publication number: CN109307721B
Application number: CN201811257744.6A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 肖红斌; 赵步长; 魏紫奕; 赵涛; 徐文娟; 王益民
Original assignee: Shaanxi Buchang Pharma Co ltd
Current assignee: Shaanxi Buchang Pharma Co ltd
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: CN109307721A

Abstract

本发明提供一种HPLC‑QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以0.1％甲酸‑水为流动相A，以0.1％甲酸‑乙腈为流动相B，其体积配比为流动相A相：流动相B相为：80～0％：20～100％，进行梯度洗脱；该方法可以测定龙生蛭胶囊中黄芪甲苷、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡糖苷、毛蕊异黄酮、阿魏酸、紫丁香苷、正丁基苯酞、藁本内酯、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、川芎嗪、异秦皮啶、去氢木香内酯、苦杏仁苷、刺五加苷E、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等中药有效物质成分。该含量检测方法具有操作方法简单，灵敏度高，含量准确的优点。

Description

一种HPLC-QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法

技术领域

本发明涉及属于中成药化学分析检测领域，尤其涉及一种HPLC-QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法。

背景技术

龙生蛭胶囊是由陕西步长制药有限公司独家生产，该药物是由黄芪、水蛭、川芎、当归、桃仁、红花、赤芍、木香、石菖蒲、地龙、桑寄生和刺五加12味中药组成的复方制剂，具有补气活血、逐瘀通络的功效。上市前临床研究表明，龙生蛭胶囊对脑梗塞总有效率可达91.7％，并且对中风后遗症常见的中医证候改善率均在80％以上。上市后广泛应用于脑梗死恢复期的治疗，在西药治疗基础上应用龙生蛭胶囊或者联合其他中药应用均取得卓越效果，如联合应用龙生蛭和阿司匹林治疗短暂性脑缺血发作疗效确切，可减少其病情的复发率和病情发展为脑卒中的风险；在西医治疗基础上加用龙生蛭胶囊治疗急性脑梗死具有明显的改善作用。

目前对龙生蛭胶囊的临床研究相对较多，临床效果显著，但是其化学成分研究尚未报道，其物质基础尚不明确，因此对龙生蛭胶囊化学成分进行含量测定能够有效对复方制剂进行质量控制，无论是保证用药的安全性和有效性，还是准确全面评价药材质量都是非常必要且有意义的。目前文献报道仅以黄芪甲苷作为龙生蛭胶囊的质控指标，而中药的药理药效是多种有效成分协同作用的结果，制剂的质量评定应是多种成分的考察，仅通过测定单一或几个指标不能较为全面的反映中药质量，多组分活性成分定量分析是中药质量控制最直接和必要的方法。此外高效液相色谱-三重串联四级杆质谱法具有快速、灵敏度高的特点，质谱多反应监测扫描模式依据化合物母离子和子离子的质荷比信息进行定量，能够提高检测灵敏度和定量准确性，是解决多组分化学成分定量的有力工具。因此，迫切需要一种简便、高效、准确、成本低的质量检测方法能同时定性和定量测定龙生蛭胶囊中多个有效组分。

发明内容

本发明的目的是提供一种HPLC-QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法，该检测方法对龙生蛭胶囊中黄芪、川芎等药材的19种有效成分，采用多反应监测模式对 3批市售龙生蛭胶囊进行成分含量测定，对龙生蛭中的有效物质成分含量进行检测分析，以期为龙生蛭胶囊的质量控制和评价其内在品质提供科学依据。

本发明所述的龙生蛭胶囊，均是指由陕西步长制药有限公司生产，其该药物由黄芪225 份、水蛭100份、川芎90份、当归90份、红花90份、桃仁113份、赤芍90份、木香90 份、石菖蒲90份、地龙60份、桑寄生90份、刺五加浸膏35份制备而成。

本发明提供的一种HPLC-QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法，所述含量检测方法包括如下步骤：

⑴、供试品溶液的制备：取龙生蛭胶囊内容物，研细混匀，加入60～80％甲醇，超声处理20～40min，放冷后用甲醇补充损失的重量，摇匀取上清液，滤过，用时稀释测定，并精密称取吲哚美辛和异鼠李素对照品，加40～60％甲醇溶液，溶解并摇匀，配置成质量浓度为1～8μg/mL的内标溶液，即得；

⑵、对照品标准液的制备：分别精密称取，芍药苷、芒柄花苷、刺五加苷E、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、藁本内酯、洋川芎内酯I、异嗪皮啶、苦杏仁苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、黄芪甲苷、阿魏酸、紫丁香苷、洋川芎内酯H、去氢木香内酯，毛蕊异黄酮、正丁基苯肽、洋川芎内酯A，川芎嗪对照品适量，加入40～60％甲醇进行溶解，配制混合对照品溶液；

⑶、色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以0.1％甲酸-水为流动相A，以 0.1％甲酸-乙腈为流动相B，其体积配比为流动相A相：流动相B相为：80～0％：20～100％，进行梯度洗脱；每次进样预平衡2～10min，流速为0.1～0.8mL/min，进样量2～6μL；

⑷、质谱条件：电喷雾离子源(AJS-ESI)，采用多反应监测模式，干燥气温度340～360 ℃，干燥气流速8～10L/min，喷嘴电压42～48psi，鞘气温度230～270℃，鞘气流速9～13L/min，正、负离子分别扫描模式，正离子模式下内标为吲哚美辛，负离子模式下内标为异鼠李素为内标；

⑸、色谱峰测定：将上述步骤⑴和⑴所制得的供试品和混合对照品溶液，按照上述步骤 ⑶的色谱条件和步骤⑷的质谱条件，测定供试液溶液，得到龙生蛭胶囊有效成分的离子流色谱图，即得。

优选的，所述步骤⑴供试品溶液制备方法中，所述甲醇浓度为75％，超声处理30min。

作为进一步的优选，所述步骤⑵对照品标准液的制备中，分别精密称取各待测对照品，所述芍药苷稀释浓度为0.004～3μg/mL，芒柄花苷稀释浓度为0.1～2μg/mL，刺五加苷E、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、藁本内酯、洋川芎内酯I、异嗪皮啶、苦杏仁苷稀释浓度为 1μg/mL，氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、黄芪甲苷、阿魏酸、紫丁香苷、洋川芎内酯H、去氢木香内酯稀释浓度为0.1～0.5μg/mL，毛蕊异黄酮、正丁基苯肽、洋川芎内酯A稀释浓度为0.01～0.5μg/mL，川芎嗪稀释浓度为0.01～0.05μg/mL，并制备成对照品混合溶液。

优选的，所述⑶色谱条件中，色谱柱的型号为Agilent Rapid Resolution HD。

优选的，所述⑶色谱条件为：所采用的柱温45℃，流动相为A(0.1％甲酸-水)-B(0.1％甲酸-乙腈)，正离子模式梯度洗脱0-1.5min，20％B；1.5-3min，20％-80％B；3-4min，80％B； 4-6min，80％-100％B，负离子模式梯度洗脱0-0.5min，20％B；0.5-1min，20％-100％B；1-3 min，100％B，每次进样预平衡5min，流速为0.5mL/min，进样量2μL。

优选的，所述⑷质谱条件为：电喷雾离子源，采用多反应监测模式，干燥气温度350℃，干燥气流速9L/min，喷嘴电压45psi，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，正、负离子分别扫描模式，进行测定。

本发明色谱和质谱条件优化

⑴、流动相选择：

①、色谱柱优化：选择合适色谱柱能使复方中药龙生蛭胶囊中有效物质成分中目标物产品更好的分离，并达到快速出峰，实现对样品化合物的快速分析。考察C18色谱柱(3mm×100 mm，3μm)和C18色谱柱(50mm×2.1mm，1.8μm)两根不同色谱柱，选择C18色谱柱(50mm×2.1 mm，1.8μm)，能够实现对样品的快速检测；

②、调整色谱条件中的流动相梯度比例，一方面使分析速度最短，另一方面使同分异构体正丁基苯酞、藁本内酯和洋川芎内酯I、H达到基线分离。为了将更多的龙生蛭胶囊中所检测的有效物质成分得到完全分离，我们在实验摸索中，经过大量的预实验研究，终于找到合适的最佳的流动相配比为流动相为A(0.1％甲酸-水)-B(0.1％甲酸-乙腈)，我们筛选一些优选的色谱条件参数，以佐证本发明方案的创造性。比如：色谱条件1：0-5min，5％B；5-7min， 100％B(参见附图3)；色谱条件2：0-1.5min，20％B；1.5-1.6min，20％-80％B；1.6-5.3min， 80％-100％B；5.3-7min，100％B(图4)；色谱条件3：0-1.5min，20％B；1.5-3min，20％-80％ B；3-4min，80％B；4-6min，80％-100％B(图5)；经过多次试验摸索，最后确定色谱条件3 能够实现洋川芎内酯I和H的基线分离，同时分析时间较短，因此确定最佳流动相梯度比例为色谱条件3。

⑵、内标物质选择：

本实验采用内标法进一步提高测定的准确度，根据保留时间相近、在质谱中能够被电离和碎裂、样品中不存在等原则进行内标的选择，考察了吲哚美辛、卡马西平、络腮维、异鼠李素等化合物，最终确定了正离子模式下内标物异鼠李素为吲哚美辛，负离子模式下内标物为异鼠李素。

⑶、质谱条件优化(MRM模式)：

需要确定各个化合物母离子、子离子、fragmentor值、CE值，具体分析步骤如下：

①、对各个化合物进行质谱Scan全扫描，选择在全扫描模式下质谱响应较强的加合离子 ([M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M-H]^-、[M+COOH]^-)作为相应化合物定量的母离子，同时确定化合物最佳离子模式(正、负)。

②、对各个化合物采用质谱SIM模式，已知母离子情况下设置不同fragmentor值(60-225V)，选择在SIM模式下质谱响应较强的作为相应化合物最佳fragmentor值。

③、对各个化合物采用质谱product模式，已知母离子和fragmentor值，通过设置不同 CE值(0-40V)，选择在product模式下质谱响应较强的碎裂离子作为该化合物的子离子，同时比较不同CE值中子离子的质谱响应较强的作为相应化合物最佳CE值。

④、对各个化合物采用MRM模式，已知各个化合物母离子、子离子、最佳fragmentor值和CE值，获得最优该化合物的质谱峰。

如：以毛蕊异黄酮为例：

1)、质谱Scan全扫描，确定毛蕊异黄酮在正离子模式下[M+H]⁺响应较强，选择[M+H]⁺ 285作为该化合物的母离子(参见图6)，

2)、采用质谱SIM模式，已知母离子285情况下设置不同的fragmentor值，结果毛蕊异黄酮fragmentor值为165时质谱响应较强，确定最佳fragmentor值为165(图7)；

3)、采用质谱product模式，已知母离子285.1、fragmentor值165情况下，设置不同CE 值，结果碎片离子213.2质谱响应较强作为该化合物的子离子，40V下子离子质谱响应较强，确定最佳CE值为40V(图8)；

4)、采用MRM模式，最终确定毛蕊异黄酮离子对为285.1-213.2，fragmentor值为165V， CE值为40V(图9)；

其余化合物质谱优化步骤同上，最终确定龙生蛭胶囊中黄芪甲苷、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡糖糖苷、毛蕊异黄酮、阿魏酸、紫丁香苷、正丁基苯酞、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、川芎嗪、去氢木香内酯、苦杏仁苷、吲哚美辛、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、异鼠李素、刺五加苷、异秦皮啶、藁本内酯化合物质谱参数具体附图详见图 10-图30。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

⑴、针对目前龙生蛭胶囊中仅以黄芪甲苷作为龙生蛭胶囊的质控指标，难以有效表征其有效物质成分及内在质量。而中药制剂药理药效是多种有效成分协同作用的结果。因此对于龙生蛭胶囊制剂的质量评定应是多种成分的考察，本发明建立HPLC-QQQ/MS龙生蛭胶囊多指标质量评价控制方法，具有快速、灵敏度高的特点。该方法可以同时检测龙生蛭胶囊中黄芪甲苷、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮葡糖苷、毛蕊异黄酮、阿魏酸、紫丁香苷、正丁基苯酞、藁本内酯、、洋川芎内酯A、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、川芎嗪、异秦皮啶、去氢木香内酯、苦杏仁苷、刺五加苷E、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等中药有效物质成分。经试验结果表明，本发明建立的检测方法精密度(日内精密度RSD范围在0.43％-4.91％，日间精密度19种待测物RSD范围在3.12％-9.39％)，稳定性(RSD范围均在1.52％-4.40％)、重复性(RSD范围均在0.28％-4.94％)、回收率(回收率85％-114％，RSD值0.61％-4.46％)，由此可见，该方法具有操作方法简单，灵敏度高，含量准确的优点。

⑵、多成分定量分析是控制复方制剂质量的主要方法，本实验采用质谱多反应监测模式，首先考察了各个化合物在质谱正、负离子模式中的电离响应，确定了黄芪甲苷等15种化合物在正离子模式下响应值高，芍药苷等4种化合物负离子模式响应值高，因此本实验采用正、负离子分别测定的方法；通过质谱Scan模式选择母离子，SIM模式优化毛细管出口电压， Product模式选择子离子同时优化碰撞能量，获得各个化合物最高质谱响应，从而确定各个化合物定量离子对；在所有化合物中，洋川芎内酯I和洋川芎内酯H互为同分异构体(定量离子对共为225-119.2)，正丁基苯酞和藁本内酯互为同分异构体(离子对共为191.3-145.1)，为了准确定量需要优化色谱条件使这四个化合物达到基线分离，本实验进而调整色谱分离，结果表明选择Agilent Rapid Resolution HD C18(50mm×2.1mm,1.8μm)色谱柱和调整初始有机相比例到20％能够保证这四个化合物实现基线分离，最终建立了在9min内对龙生蛭胶囊制剂19 种成分的快速定量分析方法。

⑶、本发明采用HPLC-QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分，可以实现对龙生蛭胶囊中19个指标成分的含量同步测定。本发明所选择的指标成分，阿魏酸，羟基红花黄色素A，正丁基苯酞，川芎嗪等有效成分，现代药理实验表明其具有扩张血管和溶血栓作用与龙生蛭的功效，活血化瘀，通络作用相吻合，能够客观表征其内在质量，使得中成药物质药效基础更加明确。综上所述，本发明所建立的龙生蛭HPLC-QQQ/MS含量检测方法，具有简便、准确、高效、重现性、稳定性良好的特点。该含量检测方法可以全面有效控制龙生蛭胶囊内在质量提供参考。

附图说明

图1-龙生蛭胶囊待测19种有效物质成分和内标物多反应监测离子流图(正离子模式)；

图2-龙生蛭胶囊待测19种有效物质成分和内标物多反应监测离子流图(负离子模式)；其中，色谱峰1-黄芪甲苷；色谱峰2-羟基红花黄色素A；色谱峰3-毛蕊异黄酮葡糖苷；色谱峰4-毛蕊异黄酮；色谱峰5-阿魏酸；色谱峰6-紫丁香苷；色谱峰7-正丁基苯酞；色谱峰8- 藁本内酯；色谱峰9-洋川芎内酯A；色谱峰10-洋川芎内酯I；色谱峰11-洋川芎内酯H；色谱峰12-川芎嗪；色谱峰13-异秦皮啶；色谱峰14-去氢木香内酯；色谱峰15-苦杏仁苷；色谱峰16-刺五加苷E；色谱峰17-芍药苷；色谱峰18-氧化芍药苷；色谱峰19-苯甲酰芍药苷；色谱峰IS₁-吲哚美辛；色谱峰IS2-异鼠李素；

图3-洋川芎内酯I和洋川芎内酯H的MRM质谱图；

图4-洋川芎内酯I和洋川芎内酯H的MRM质谱图；

图5-洋川芎内酯I和洋川芎内酯H的MRM质谱图；

图6-毛蕊异黄酮Scan模式质谱图；

图7-毛蕊异黄酮SIM模式质谱图；

图8-毛蕊异黄酮Product模式质谱图；

图9-毛蕊异黄酮MRM质谱图；

图10-黄芪甲苷质谱图；

图11-羟基红花黄色素A质谱图；

图12-毛蕊异黄酮葡糖糖苷质谱图；

图13-毛蕊异黄酮质谱图；

图14-阿魏酸质谱图；

图15-紫丁香苷质谱图；

图16-正丁基苯酞质谱图；

图17-洋川芎内酯A质谱图；

图18-洋川芎内酯I质谱图；

图19-洋川芎内酯H质谱图；

图20-川芎嗪质谱图；

图21-去氢木香内酯质谱图；

图22-苦杏仁苷质谱图；

图23-吲哚美辛质谱图；

图24-芍药苷质谱图；

图25-氧化芍药苷质谱图；

图26-苯甲酰芍药苷质谱图；

图27-异鼠李素质谱图；

图28-刺五加苷E质谱图；

图29-异秦皮啶质谱图；

图30-藁本内酯质谱图；

图31-龙生蛭胶囊3个批次中19种化学成分含量分布。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1：本发明所建立HPLC-QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法 1仪器与试药

1.1仪器

Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent6470三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent)；分析天平(瑞士梅特勒公司)；3-18KS离心机(德国Sigma)；KQ-500E型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药

对照品黄芪甲苷(H-013-170614)、羟基红花黄色素A(Q-008-170303)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(M-020-170929)、毛蕊异黄酮(M-021-170517)、苦杏仁苷(K-001-161216)、阿魏酸 (A-002-161216)、去氢木香内酯(Q-016-170816)、紫丁香苷(C-009-161217)、刺五加苷E(C-008-171229)、苦杏仁苷(K-001-161216)、芍药苷(S-010-170214)、氧化芍药苷 (Q-019-180315)、苯甲酰芍药苷(B-024-171216)、川芎嗪(C-045-171216)、藁本内酯 (G-010-171216)、正丁基苯肽(D-057-180321)、洋川芎内酯A(Y-083-170411)、洋川芎内酯 I(Y-085-161010)、洋川芎内酯H(Y-084-161013)、异秦皮啶(Y-027-170328)、异鼠李素(内标，Y-039-180420)均购于中国成都瑞芬思生物科技有限公司，吲哚美辛(内标，Y18J7C18042)购于源叶生物，纯度均大于98％；甲酸、乙腈和甲醇均为色谱纯(美国Fisher Chemical)；超纯水(美国Millipore公司)；龙生蛭胶囊由陕西步长制药有限公司提供(批号：171250、171251、171252)。

1.3方法与结果

1.3.1对照品溶液的制备

称取各待测对照品，分别加50％甲醇溶解配制成1mg/mL对照品储备溶液。继续加50％甲醇将储备液芍药苷稀释浓度为3μg/mL，芒柄花苷稀释浓度为2μg/mL，刺五加苷E、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、藁本内酯、洋川芎内酯I、异嗪皮啶、苦杏仁苷稀释浓度为1μg/mL，氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、黄芪甲苷、阿魏酸、紫丁香苷、洋川芎内酯H、去氢木香内酯稀释浓度为0.5μg/mL，毛蕊异黄酮、正丁基苯肽、洋川芎内酯A稀释浓度为0.1 μg/mL，川芎嗪稀释浓度为0.05μg/mL，制备对照品混合溶液。

1.3.2样品溶液的制备

取龙生蛭胶囊内容物研细混匀，取粉末300mg，加入30mL 75％甲醇，超声处理30min，放冷后用75％甲醇补充损失的重量，摇匀取上清液，用0.22μm微孔滤膜滤过，用时稀释10 倍测定。精密称取吲哚美辛和异鼠李素对照品适量，加50％甲醇溶液，溶解并摇匀，配置成质量浓度为4μg/mL的内标溶液。

1.3.3色谱条件

采用Agilent Rapid Resolution HD C18色谱柱(50mm×2.1mm，1.8μm)，柱温45℃，流动相为A(0.1％甲酸-水)-B(0.1％甲酸-乙腈)，正离子模式梯度洗脱0-1.5min，20％B；1.5-3min， 20％-80％B；3-4min，80％B；4-6min，80％-100％B，负离子模式梯度洗脱0-0.5min，20％ B；0.5-1min，20％-100％B；1-3min，100％B，每次进样预平衡5min，流速为0.5mL/min，进样量2μL。

1.3.4质谱条件

电喷雾离子源(AJS-ESI)，采用多反应监测模式，干燥气温度350℃，干燥气流速9L/min，喷嘴电压45psi，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，正、负离子分别扫描模式，正离子模式下内标为吲哚美辛，负离子模式下内标为异鼠李素，待测化合物质谱检测参数见表1，待测化合物离子流色谱图见图1。

表1龙生蛭胶囊待测化合物及内标物质谱检测参数

1.4方法学考察

1.4.1线性关系及定量限

按照“1.3.1”项下的对照品储备液操作方法，用50％甲醇按照1：2：2：2：5：2：5： 2：5比例稀释，配制成系列梯度浓度对照品混合溶液，测定前加入内标溶液。按照“1.3.3” 项下色谱条件和“1.3.4”项下质谱条件进行测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，对照品与内标峰面积比值为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程、相关系数及线性范围，同时计算各待测物的定量限(S/N＝10)(表2)。

表2龙生蛭胶囊待测化合物线性关系考察

1.4.2精密度

取混合对照品溶液，1天内连续进样6次和连续3天测定，按上述检测条件进行分析，记录待测物与内标峰面积，根据回归方程计算浓度及RSD值，结果表明日内精密度RSD范围在0.43％-4.91％，日间精密度19种待测物RSD范围在3.12％-9.39％，表明仪器精密度良好。

1.4.3稳定性

取龙生蛭胶囊样品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h按上述检测条件进行分析，记录待测物与内标峰面积，根据回归方程计算浓度及RSD值，结果表明19种待测物RSD范围均在1.52％-4.40％，表明样品在24h内稳定。

1.4.4重复性

取同一批次龙生蛭胶囊粉末，平行制备6份，按上述检测条件进行分析，记录待测物与内标峰面积，根据回归方程计算浓度及RSD值，结果表明19种待测物RSD范围均在0.28％-4.94％，表明本方法的重复性良好。

1.4.5回收率

取已知含量的龙生蛭胶囊粉末平行6份，分别加入等量对照品，按上述检测条件进行分析，记录待测物与内标峰面积，根据回归方程计算浓度及RSD值，结果表明19种待测物回收率85％-114％，RSD值0.61％-4.46％，表明方法的回收率良好。

1.4.6龙生蛭胶囊样品含量测定

取系列梯度浓度对照品混合溶液和龙生蛭胶囊样品溶液，测定前加入内标溶液，按上述检测条件同时进行含量测定，将采集的数据导入安捷伦定量分析软件计算得到龙生蛭胶囊中 19个化合物的含量(表3)，明确化合物在制剂中的含量分布(参见附图31)，同时计算三批制剂中化合物总含量的RSD值及各化合物含量的RSD值，明确化合物在不同批次制剂存在的稳定性，进而对制剂质量进行评价。

表3龙生蛭胶囊中19个化学成分含量

本实验测定的龙生蛭胶囊19种化合物含量范围为0.2-4125μg/g，其中以芍药苷和毛蕊异黄酮葡糖糖苷含量最高，其次为苦杏仁苷、羟基红花黄色素A和紫丁香苷，这5种成分的总含量达0.6％以上，涵盖了君药黄芪，臣药赤芍、桃仁、红花和佐药刺五加的主要成分；测定的各个化合物总含量在3个批次制剂RSD值为5.19％，同时各个化合物的含量RSD值小于 15％，表明不同批次制剂之间化合物的含量较为接近，由此可见龙生蛭胶囊制剂质量较为稳定、工艺较为成熟；另外，在所有化合物中，苦杏仁苷、芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷和紫丁香苷RSD值相对较小(RSD值依次为3.37％、5.84％、5.59％、7.58％、7.62％)，表明这几个化合物在不同批次龙生蛭胶囊中较为稳定存在，制剂中化合物能够稳定存是制定中药质控指标的重要原则。

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种HPLC-QQQ/MS法测定龙生蛭胶囊中有效成分的含量检测方法，其特征在于，所述含量检测方法包括如下步骤：

⑴、供试品溶液的制备：取龙生蛭胶囊内容物，研细混匀，加入60～80%甲醇，超声处理20～40min，放冷后用甲醇补充损失的重量，摇匀取上清液，滤过，用时稀释测定，并精密称取吲哚美辛和异鼠李素对照品，加40～60%甲醇溶液，溶解并摇匀，配制成质量浓度为1～8μg/mL的内标溶液，即得；

⑵、对照品标准液的制备：分别精密称取，芍药苷、刺五加苷E、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、藁本内酯、洋川芎内酯I、异嗪皮啶、苦杏仁苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、黄芪甲苷、阿魏酸、紫丁香苷、洋川芎内酯H、去氢木香内酯，毛蕊异黄酮、正丁基苯肽、洋川芎内酯A，川芎嗪对照品适量，加入40～60%甲醇进行溶解，配制混合对照品溶液；

⑶、色谱条件：色谱柱以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，流动相为A-0.1%甲酸-水，B-0.1%甲酸-乙腈，正离子模式梯度洗脱0-1.5 min，20% B；1.5-3 min，20%-80% B；3-4 min，80% B；4-6min，80%-100% B，负离子模式梯度洗脱0-0.5 min，20% B；0.5-1 min，20%-100%B；1-3 min，100% B，进行梯度洗脱；每次进样预平衡2～10min，流速为0.1～0.8mL/min，进样量2～6

；

⑷、质谱条件：电喷雾离子源AJS-ESI，采用多反应监测模式，干燥气温度340～360℃，干燥气流速8～10L/min，喷嘴电压42～48psi，鞘气温度230～270 ℃，鞘气流速9～13L/min，正、负离子分别扫描模式，正离子模式下内标为吲哚美辛，负离子模式下内标为异鼠李素为内标；

⑸、色谱峰测定：将上述步骤⑴和⑵所制得的供试品溶液和混合对照品溶液，按照上述步骤⑶的色谱条件和步骤⑷的质谱条件，测定供试品溶液，得到龙生蛭胶囊有效成分的离子流色谱图，即得。

2.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述步骤⑴供试品溶液制备方法中，取龙生蛭胶囊内容物，研细混匀，加入70%甲醇，超声处理20～40min，放冷后用70%甲醇补充损失的重量，摇匀取上清液，滤过，用时稀释测定。

3.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述步骤⑵对照品标准液的制备中，分别精密称取各待测对照品，所述芍药苷稀释浓度为0.004～3μg/mL，刺五加苷E、羟基红花黄色素A、毛蕊异黄酮苷、藁本内酯、洋川芎内酯I、异嗪皮啶、苦杏仁苷稀释浓度为1μg/mL，氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、黄芪甲苷、阿魏酸、紫丁香苷、洋川芎内酯H、去氢木香内酯稀释浓度为0.1～0.5μg/mL，毛蕊异黄酮、正丁基苯肽、洋川芎内酯A稀释浓度为0.01～0.5μg/mL，川芎嗪稀释浓度为0.01～0.05 μg/mL，并制备成混合对照品溶液。

4.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述⑶色谱条件中，色谱柱的型号为Agilent Rapid Resolution HD。

5.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述⑶色谱条件为：所采用的柱温45℃，每次进样预平衡5min，流速为0.5mL/min，进样量2μL。

6.根据权利要求1所述含量检测方法，其特征在于，所述⑷质谱条件为：电喷雾离子源，采用多反应监测模式，干燥气温度350℃，干燥气流速9 L/min，喷嘴电压45psi，鞘气温度250℃，鞘气流速11L/min，正、负离子分别扫描模式，进行测定。