CN104007220A - 一种同时检测血浆中复方丹蒌片主要成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时检测血浆样本中复方丹蒌片主要成分葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的方法。所述液相色谱中，流动相由乙腈和体积分数为0.1％的甲酸水溶液组成，采用梯度洗脱。所述质谱采用正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式。同时测定给药丹蒌片后，大鼠血浆中这几种主要成分的血药浓度变化情况。方法学考察结果表明所建立的方法符合体内生物样品测定要求，方法灵敏度好，专属性强，稳定、可靠，适宜含量较低物质的检测。

Description

一种同时检测血浆中复方丹蒌片主要成分的方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种同时检测血浆中复方丹蒌片主要成分的分析方法及其在药代动力学中的应用。

背景技术

复方丹蒌片是由瓜蒌皮、薤白、葛根、川芎、丹参、赤芍、泽泻、黄芪、骨碎补、郁金，十味中药组成的上市中成药。临床主要用于宽胸通阳、化痰散结、活血化瘀，用于痰瘀互结所致的胸痹心痛，症见胸闷胸痛、憋气、舌质紫暗、苔白腻；冠心病心绞痛见上述证候者。文献报道其主要成分为黄酮类、酚酸类、丹参酮类、三萜烷类、内酯类和芍药苷等，并且葛根素、芍药苷、丹参酮类成分在片剂中的含量较高。葛根素、芍药苷、芒柄花黄素、丹参酮ⅡA、隐丹参酮分别是葛根、赤芍、葛根和黄芪、丹参中的主要成分，大量文献对其药理活性进行了报道。但还没有文献同时对这几种成分的药代动力学进行报道，对复方丹蒌片药效物质基础研究的文章也未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)同时检测血浆样本中复方丹蒌片主要成分葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的方法。并采用该方法对复方丹蒌片中这几种成分的药代动力学特点进行研究，进一步了解复方丹蒌片的吸收入血成分及其血药浓度变化情况，为阐明复方丹蒌片的药物作用机制提供指导。

本发明所提供的方法包括：步骤(1)样品的制备和步骤(2)采用液相色谱串联质谱法进行检测；

步骤(1)样品的制备采用包括以下步骤的方法：

a)向待测血浆样品中加入混合内标溶液、甲酸，并混匀；

b)加入乙酸乙酯提取剂，混匀后静置；

c)离心，收集上清液，氮气吹干，收集干燥物；

d)将得到的干燥物用甲醇复溶，混匀、离心，取上清液。

步骤a)中，所述混合内标溶液中所述内标为大黄素和栀子苷；其中，大黄素作为丹参酮和黄酮类化合物(即葛根素、芒柄花黄素、丹参酮ⅡA和隐丹参酮)的内标，栀子苷作为芍药苷的内标。所述混合内标溶液具体通过包括下述步骤的方法配制：精密称取大黄素1.08mg，栀子苷1.00mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容至刻度线，分别配成内标大黄素、栀子苷的储备液；精密移取各内标储备液适量，用甲醇稀释，配制成含大黄素1.08μg/mL^-1、栀子苷5.00μg/mL^-1的混合内标溶液。

所述步骤a)中，所述待测血浆样品与甲酸的体积比为100:20。

所述步骤b)中，所述静置的时间为2-5min。所述待测血浆样品与乙酸乙酯的体积比为1:5-10。

所述步骤d)中，在离心步骤前还可包括对混匀后的产物进行超声的步骤。

所述超声的时间为30-60s。

步骤a)、b)、c)和d)中，所述混匀均采用涡旋的方式，涡旋的时间均为1-2min。

步骤c)和d)中，所述离心的条件均为18000×g-19000×g离心10-15min。

步骤(2)检测所用液相色谱条件如下：

色谱柱为C₁₈柱；

流动相由乙腈和体积分数为0.1％(v/v)的甲酸水溶液组成；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如下：

0-10min：乙腈的体积分数由10％增加至30％；

10-15min：乙腈的体积分数由30％增加至90％；

15-24min：乙腈的体积分数维持90％不变；

步骤(2)检测所用质谱条件如下：采用API3200^TMLC/MS/MS液质分析***；离子源，正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式。

所述液相色谱条件中，色谱柱具体为Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(4.6mm×100mm,1.8μm)；流动相流速为400μL/min；柱温为30℃；进样量为5μL。

所述质谱条件中，所述正负离子快速切换分析模式中，正离子模式参数设置为：气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：10psi；离子喷雾电压(IS)：5500V；温度(TEM)：450℃；气流1(GS1)：30psi；气流2(GS2)：60psi；加热(Ihe)：On；负离子模式参数设置为：气帘气(CUR)：15psi；碰撞气(CAD)：12psi；离子喷雾电压(IS)：-4500V；温度(TEM)：450℃；气流1(GS1)：30psi；气流2(GS2)：40psi；加热(Ihe)：On。

所述MRM方法的参数如下：

葛根素：母离子质量数(Q1)：415.3；碎片离子质量数(Q3)：295.1；解簇电压(DP)：-65V；入口电压(EP)：-6V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-32V；碰撞池出口电压(CXP)：-20V；保留时间(Rt)：9.00min；

芒柄花黄素：母离子质量数(Q1)：267.3；碎片离子质量数(Q3)：252；解簇电压(DP)：-48V；入口电压(EP)：-5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-30V；碰撞池出口电压(CXP)：-25V；保留时间(Rt)：17.05min；

芍药苷：母离子质量数(Q1)：449.1；碎片离子质量数(Q3)：327.1；解簇电压：-56V；入口电压(EP)：-7V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-15V；碰撞池出口电压(CXP)：-26V；保留时间(Rt)：11.11min；

隐丹参酮：母离子质量数(Q1)：297.3；碎片离子质量数(Q3)：251.3；解簇电压：70V；入口电压(EP)：6V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：30V；碰撞池出口电压(CXP)：21V；保留时间(Rt)：19.76min；

丹参酮ⅡA：母离子质量数(Q1)：295.3；碎片离子质量数(Q3)：249.2；解簇电压：80V；入口电压(EP)：4.5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：35V；碰撞池出口电压(CXP)：32V；保留时间(Rt)：20.96min；

大黄素(S1)：母离子质量数(Q1)：269.1；碎片离子质量数(Q3)：225.1；解簇电压：-65V；入口电压(EP)：-7V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-39V；碰撞池出口电压(CXP)：-15V；保留时间(Rt)：18.31min；

栀子苷(S2)：母离子质量数(Q1)：387.0；碎片离子质量数(Q3)：224.8；解簇电压：-40V；入口电压(EP)：-5V；采样时间(Dwell Time)：100；碰撞能：-16V；碰撞池出口电压(CXP)：-5V；保留时间(Rt)：9.63min。

本发明还包括一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量的方法，具体包括下述步骤：

1)标准曲线的制备：取一系列浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮对应的峰面积；以葛根素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以葛根素浓度X为横坐标，制备葛根素的线性回归方程；以芒柄花黄素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芒柄花黄素浓度X为横坐标，制备芒柄花黄素的线性回归方程；以芍药苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芍药苷浓度X为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程；以丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹参酮ⅡA浓度X为横坐标，制备丹参酮ⅡA的线性回归方程；以隐丹参酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以隐丹参酮浓度X为横坐标，制备隐丹参酮的线性回归方程；

2)待测血浆样品中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量测定：将待测血浆样品按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮对应的峰面积；计算葛根素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述葛根素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中葛根素的浓度；计算芒柄花黄素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芒柄花黄素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芒柄花黄素的浓度；计算芍药苷与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芍药苷的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芍药苷的浓度；计算丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述丹参酮ⅡA的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中丹参酮ⅡA的浓度；计算隐丹参酮与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述隐丹参酮的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中隐丹参酮的浓度。

本发明所述方法可成功用于复方丹蒌片主要成分(葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮)的药代动力学研究。

所述复方丹蒌片由下列质量份的原料制成：瓜蒌皮30-145重量份、薤白15-65重量份、葛根55-220重量份、川芎20-85重量份、丹参55-220重量份、赤芍20-85重量份、泽泻55-220重量份、黄芪50-180重量份、骨碎补10-40重量份、郁金20-85重量份。

制备方法如下：取原料药，川芎、郁金、泽泻粉碎成细粉，过筛，混匀；赤芍、瓜蒌皮、薤白加70％乙醇加热回流提取1-3次，每次1-2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30(65℃)；葛根和丹参，单包，加乙醇回流提取2-4次，每次0.5-2小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.25-1.30(65℃)；黄芪、骨碎补及丹参醇提后的药渣，加水煎煮1-3次，每次1-2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25-1.30(65℃)；将三种浓缩液与上述细粉混合，减压干燥，粉碎，加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂。

本发明建立了液液萃取的大鼠血浆样品处理方法、采用液质联用(LC-ESI-MS/MS)的分析法，同时测定给药丹蒌片后，大鼠血浆中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的血药浓度变化情况，并对其进行方法学考察。结果表明所建立的方法符合体内生物样品测定要求，方法灵敏度好，专属性强，稳定、可靠，适宜含量较低物质的检测。

附图说明

图1为测定的血浆样品的色谱图，其中，(a)为空白血浆色谱图；(b)为空白血浆中加入各化合物及内标的色谱图；(c)为大鼠给6g/kg丹蒌片后30min的血浆色谱图。

图2为大鼠血浆中各成分的血药浓度-时间曲线，其中，a为大鼠血浆中葛根素的血药浓度-时间曲线；b为大鼠血浆中芒柄花黄素的血药浓度-时间曲线；c为大鼠血浆中芍药苷的血药浓度-时间曲线；d为大鼠血浆中隐丹参酮的血药浓度-时间曲线；e为大鼠血浆中丹参酮ⅡA的血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的药材复方丹蒌片由吉林康乃尔药业提供。下述实施例中所用的试剂：

乙腈(美国Fisher)

超纯水(Millipore超纯水净化***制得)

甲醇(色谱级别，天津市康科德科技有限公司)

乙酸乙酯(分析纯级别，天津市康科德科技有限公司)

甲酸(高纯，含量>99.99％，天津市光复精细化工研究所)

下述实施例中所用的仪器：

液质联用仪：Agilent1200高效液相色谱仪，API3200串接四极杆质谱仪

超纯水器：Millipore公司，Mill-QⅡ型

高速离心机：美国Sigma公司，3K15

超低温冰箱：美国Thermo Heto公司，-86℃

超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，KQ-250E

氮吹仪：美国Organomation公司，N-EAVP^TM111

十万分之一天平：瑞士Mettler Toledo公司，AX205

万分之一天平：德国Sartorius公司，BP121S

旋涡混合器：上海沪西分析仪器厂，XW-80A

下述实施例中所用的试验动物：

健康雄性大鼠，品系SD，级别SPF级，体重200±20g，购自天津市山川红实验动物科技有限公司。

下述实施例中所用的五种待测物标准品：葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA，隐丹参酮(中国药品生物制品检定所，纯度＞98％)

内标：大黄素、栀子苷(中国药品生物制品检定所，纯度＞98％)。

本研究首先对沉淀蛋白的方法进行了优化，对沉淀试剂甲醇与样品的体积比进行了考察，结果见表1。

表1 甲醇比例对五种化合物的回收率和基质效应的影响

由表1可知，甲醇与样品的比例为3:1、6:1和9:1时，各成分的回收率和基质效应不能满足生物样品分析的要求。

此外考察了乙酸乙酯液液萃取的方法，依据强酸置换弱酸以使蛋白变性，增大分析成分以分子形式存在的量的原理，实验在乙酸乙酯萃取的基础上加入了甲酸，考察了甲酸加入的体积(0，10，20和30μL)对实验的影响，结果表明，乙酸乙酯液液萃取的方法比甲醇蛋白沉淀法对分析成分的回收率和基质效应更好，当加入20μL甲酸时，样品和乙酸乙酯在1:10的比例下萃取较完全，甲酸的加入明显改善了分析成分的回收率，方法的准确度较好。故采用乙酸乙酯为液液萃取溶剂对血浆样品进行处理，具有方法简单、安全无毒、成本低等优点。综上所述，本实验选择加入20μL甲酸，采用乙酸乙酯进行液液萃取，100％甲醇复溶的方法对血浆样品进行前处理，实现了对测定成分的分离与纯化。

实施例1、血浆样品中复方丹蒌片主要成分分析方法的建立

LC-MS/MS条件：

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈柱(4.6mm×100mm,1.8μm)；保护柱为AgilentC18柱(2.1×12.5mm,5μm)；流动相为：A：乙腈，B：水(含体积分数0.1％甲酸)；流速为400μL/min；柱温为50℃；进样量为5μL；时间为0-24min；

采用梯度洗脱，洗脱程序见表2。

表2 流动相梯度洗脱程序

质谱条件：采用API3200^TMLC/MS/MS液质分析***；离子源，正负离子快速切换分析模式，MRM扫描方式；

其中正离子模式：气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：10psi；离子喷雾电压(IS)：5500V；温度(TEM)：450℃；气流1(GS1)：30psi；气流2(GS2)：60psi；加热(Ihe)：On；负离子模式：气帘气(CUR)：15psi；碰撞气(CAD)：12psi；离子喷雾电压(IS)：-4500V；温度(TEM)：450℃；气流1(GS1)：30psi；气流2(GS2)：40psi；加热(Ihe)：On。

所述MRM方法参数见表3。

表3 化合物质谱参数

溶液的制备

(1)标准品储备液的制备：精密称取葛根素1.10mg，芒柄花黄素1.07mg，芍药苷1.05mg，隐丹参酮1.10mg，丹参酮ⅡA1.04mg，于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容至刻度线，配成各标准品储备液；

(2)标准品混合溶液的制备：精密移各标准品储备液适量，用甲醇稀释，配制浓度分别为葛根素5.5-550ng/mL^-1；芒柄花黄素0.535-53.5ng/mL^-1；芍药苷5.25-525ng/mL^-1；隐丹参酮2.5-250ng/mL^-1；丹参酮ⅡA2.575-257.5ng/mL^-1的系列标准品混合溶液；

(3)内标溶液的配制：精密称取大黄素1.08mg，栀子苷1.00mg于10mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并定容至刻度线，分别配成内标大黄素、栀子苷的储备液。精密移取各内标储备液适量，用甲醇稀释，配制成含大黄素1.08μg/mL^-1、栀子苷5.00μg/mL^-1的混合内标溶液。

血浆样品预处理

取血浆样品100μL，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸20μL，涡旋1min，再加入乙酸乙酯1000μL，涡旋1min，静置2min，14000rpm离心10min，取上清液，氮吹至干，取100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，14000rpm离心10min，取上清液5μL进样分析。

分析方法的确证

所述大鼠血浆中的方法学按照美国FDA生物样品分析方法的指导原则对分析方法的方法学进行考察，方法中的准确度、精密度、稳定性等分别测定了高、中、低三个不同浓度级别的三批次样品。方法准确度中回收率的考察，是在高、中、低三个浓度的3个平行样品完成的；在日内精密度、日间精密度和稳定性考察中，分别平行制备6份供试样品进行分析，实验结果的精密度和准确度以相对标准偏差RSD(％)和准确度(％)表示。其具体包括下述步骤：

(1)方法的专属性验证

在已建立的实验检测条件下，分别制备6只不同批次大鼠的空白血样(不含待分析物和内标)进行分析，检测血浆中内源性物质和其他共洗脱物对目标分析物的干扰程度，结果显示6个目标测定化合物及2个内标成分的分离度高，峰形良好，血浆中无内源性物质干扰测定。

结果如图1所示。

图1为测定的血浆样品的血浆色谱图，其中，(a)为空白血浆色谱图；(b)为空白血浆中加入各化合物及内标的色谱图；(c)为大鼠给6g/kg丹蒌片后30min的血浆色谱图。

(2)血浆样品的标准曲线

取100μL空白血浆，加入混合内标溶液和系列浓度混合标准品溶液各10μL，甲酸20μL，涡旋1min,再加入乙酸乙酯1000μL，涡旋1min，静置2min，14000rpm离心10min，取上清液，氮吹至干，取100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，18000×g离心10min，取上清液5μL进样测定。以待测物与内标峰面积比值(Y)为纵坐标，以待测物浓度(X)为横坐标，作线性回归方程，计算权重为1/X²。

结果如表4所示。

表4 线性范围及最小检测限(n＝3)

由表4可知，r均大于0.9935，五种化合物的最低定量限均低于1.5ng mL^-1，表明所建立的分析方法具有较高灵敏度，可用于血浆中低浓度药物的检测。

(3)方法的精密度与准确度

取100μL空白血浆，按上述血浆样品预处理的操作，配制成含标准品浓度为低、中、高的血浆样品各6份，测定，记录待测化合物峰面积和对应内标峰面积，计算其比值，代入随行标准曲线中计算浓度，得到测得浓度值。精密度为测得浓度的变异值，以RSD表示，准确度用测得的浓度与真实浓度比值的百分数表示，测得浓度为6次结果的mean±SD。连续3天内平行处理、测定3批血浆样品，分别计算批内、批间的精密度和准确度，结果如表5所示。

表5 日内与日间精密度(Intra-precision and Inter-precision,n＝6)

由表5可知，所建立的同时测定葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA、隐丹参酮的LC-MS/MS分析方法具有较好准确度和精密度，符合生物样品测定精密度要求。

(4)提取回收率与基质效应

取空白血浆，加入混合标准品溶液10μL，配制高中低三个浓度水平模拟血浆样品溶液各6份，按所述血浆样品预处理的操作，进样5μL测定；另取空白血浆100μL，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸20μL，涡旋1min，再加入乙酸乙酯1000μL，涡旋1min，静置2min，18000g离心10min，取上清液，加入高中低三个水平混合标准品溶液10μL，氮吹至干，用100μL甲醇溶液复溶，制备含空白基质的复合标准品溶液，进样5μL测定，记录峰面积；通过前后两者的峰面积百分比计算回收率，结果见表6，三个浓度提取回收率平均值符合生物样品对于提取回收率的要求。

取100μL空白血浆，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸20μL，涡旋1min，再加入乙酸乙酯1000μL，涡旋1min，静置2min，18000g离心10min，取上清液，加入高中低三个水平混合标准品溶液10μL，氮吹至干，用100μL甲醇复溶，进样5μL测定，记录峰面积；同时用甲醇配制高中低三个水平混合标准品溶液，进样5μL测定，记录峰面积；通过两种方法获得各种化合物峰面积的百分比计算基质效应。结果如表6所示。

表6 提取回收率与基质效应(n＝6)

由表6可知：葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA、隐丹参酮回收率均大于60％，表明所优化的乙酸乙酯液液萃取的方法适合于大鼠血浆样品的前处理；基质效应在80.7％-108％之间，表明所测的化合物基质效应较小，样品基质和共流出物对所测化合物无影响。

(5)最低定量限(LLOQ)的确定

取空白血浆100μL，精密加入所述混合内标溶液10μL，甲酸20μL，涡旋1min，再加入乙酸乙酯1000μL，涡旋1min，静置2min，14000rpm离心10min，取上清液，氮吹至干，取100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，18000g离心10min，取上清液5μL进样分析。当S/N≥5时浓度确定为最低定量限(LLOQ)，然后制备6份样品，代入随行标准曲线中进行计算其准确度与精密度，测定结果见表4。

(6)血浆样品稳定性考察

取空白血浆100μL，配制成低、中、高三个浓度的标准品血浆样品，分别考察其在室温24h，反复冻融3次和-20℃冻融两个星期的稳定性，结果见表7。

表7 稳定性测定

从表7可知，各个化合物结果RSD值均符合要求，提示本实验样品应在2个星期内完成样品测定，在实验过程中样品的储存、处理相对稳定，对分析无显著性影响。

讨论

1、流动相的优化

为达到最佳分离状态，本发明的发明人对流动相的组成进行了优化，采用乙腈-0.1％甲酸水进行梯度洗脱，待测化合物丰度较高，灵敏度增强，分析时间短等优点。

2、质谱条件的优化

为了提高每个化合物的响应强度及灵敏度，本实验对每个化合物的源参数，质谱参数和MRM分别进行了优化，采用正负同时扫描的方式，每个化合物的相应都达到较理想状态。

3、内标的选择

使用内标的目的一方面是为了减少样品处理的不平行、药物吸附等对分析结果的影响，另一方面是为了减少质谱检测时因离子化效率的差异产生的误差。应尽可能选择理化性质、色谱行为与待测物相似的物质作为内标，一般多选用分析物的同系物或结构相似物。根据以上原则，我们分别选择了大黄素作为丹参酮和黄酮类化合物的内标，选择栀子苷作为芍药苷的内标。经试验，在本实验确定的条件下，所有内标和待测化合物都保留时间和仪器相应都相对稳定，无内源性物质干扰。因此，我们选用以上内标作为各类待测物的内标。

4、血浆样品处理方法的考察

为了最大程度的去除蛋白和萃取出待测物，我们对蛋白除去方法、样品和溶剂比例，复溶溶剂、甲酸的加入体积进行了考察。

实验中发现，采用液液萃取的方法比甲醇蛋白沉淀法对分析成分的回收率和基质效应的效果更好，在以往实验基础上，发现样品和乙酸乙酯在1:10的比例下萃取较完全，样品回收率较好，加入甲酸和不加入甲酸对样品回收率的影响非常明显，因此，采用强酸置换弱酸及使蛋白变性，增大分析成分以分子形式存在的量。同时本实验考察了甲酸加入的体积(0，10，20和30μL)对实验的影响，结果表明，当加入20μL甲酸，实验结果较好。经查阅相关文献，考虑到安全无毒、成本低、处理方法简单等优点，故采用乙酸乙酯为液液萃取溶剂对血浆样品进行处理。分别选用不同的溶剂70％MeOH、100％MeOH对样品进行最后复溶检测，结果显示：用100％MeOH复溶，最终测得每个待测化合物的结果都比较好，可能是因为甲醇是万能溶剂，对有机化合物溶解效果都比较好。因此，选择甲醇为复溶溶剂对血浆样品进行处理。

实施例2、灌胃给药大鼠后复方丹蒌片主要成分的药代动力学

复方丹蒌片五种化合物含量

采用LC-MS/MS对复方丹篓片中葛根素、芍药苷、芒柄花黄素、隐丹参酮和丹参酮ⅡA含量进行了测定，结果表明葛根素、芍药苷、芒柄花黄素、隐丹参酮和丹参酮ⅡA含量分别为70.95mg/g、21.07mg/g、、0.28mg/g、1.33mg/g和1.26mg/g。

血浆样品的采集

受试雄性SD大鼠预适应一周，于试验前天晚上禁食不禁水12h，第二天将实验动物随机分为2组，每组8只，分别按1g·kg^-1和6g·kg^-1剂量灌胃给药，于给药后0.083，0.167，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，12和24h眼底静脉丛取血，置于肝素化离心管中，8000g离心10min，取出上层血浆，于-20℃冰箱保存，待测。

血浆样品预处理

取血浆样品100μL，精密加入内标混合溶液10μL，甲酸20μL，涡旋1min，再加入乙酸乙酯1mL，涡旋1min，静置2min，18000g离心10min，取上清液，氮吹干，用100μL甲醇复溶，涡旋60s，超声60s，18000g离心10min，取上清液5μL进样。

大鼠血浆样品分析

将所述血浆样品的采集步骤中得到的血浆样品进行预处理，采用实施例1中所建立的LC-MS/MS条件进行测定。在测定血浆样品时对分析方法进行了质量控制，建立随行标准曲线，并随行高、中、低三个浓度的QC(质控)样品。

血浆样品进行LC-MS分析，以随行的标准曲线计算含量，以时间-血药浓度作图，绘制葛根素，芒柄花黄素，芍药苷，隐丹参酮和丹参酮ⅡA的血药浓度-时间曲线图。

图2为大鼠血浆中各成分的血药浓度-时间曲线，其中a为大鼠血浆中葛根素的血药浓度-时间曲线；b为大鼠血浆中芒柄花黄素的血药浓度-时间曲线；c为大鼠血浆中芍药苷的血药浓度-时间曲线；d为大鼠血浆中隐丹参酮的血药浓度-时间曲线；e为大鼠血浆中丹参酮ⅡA的血药浓度-时间曲线。

由图2可知，大鼠口服复方丹篓片后，葛根素，芒柄花黄素，芍药苷，隐丹参酮和丹参酮ⅡA均能够吸收入血，具有吸收快和消除快等特点；同时随着给药剂量的增加，五种化合物AUC也变大，表明其吸收增加。

大鼠给药复方丹蒌后的药代动力学参数

用DAS1.0软件处理给药后大鼠的血药浓度-时间数据，根据最小Akaike’sInformation criterion(AIC)信息判断，葛根素，芒柄花黄素，芍药苷，隐丹参酮和丹参酮ⅡA药动学模型符合一室开放模型。同时采用统计矩法，计算其主要药代动力学参数，所用药动学软件为DAS Statistics Version1.0(Mathematical PharmacologyProfessional Committee of China，Shanghai，China)，结果如表8所示。

表8 大鼠给药复方丹蒌后的各主要成分的药代动力学参数

Claims (8)

1.一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的方法，包括：步骤(1)样品的制备和步骤(2)采用液相色谱串联质谱法进行检测；

所述步骤(1)样品的制备采用包括以下步骤的方法：

a)向待测血浆样品中加入混合内标溶液、甲酸，并混匀；所述混合内标溶液中内标为大黄素和栀子苷；其中，大黄素作为葛根素、芒柄花黄素、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的内标，栀子苷作为芍药苷的内标；

b)加入乙酸乙酯提取剂，混匀后静置；

c)离心，收集上清液，氮气吹干，收集干燥物；

d)将得到的干燥物用甲醇复溶，混匀、离心，取上清液；

所述步骤(2)检测所用液相色谱条件如下：

色谱柱为C₁₈柱；

流动相由乙腈和体积分数为0.1％甲酸水溶液组成；

洗脱方式为梯度洗脱；

所述梯度洗脱的程序如下：

0-10min：乙腈的体积分数由10％增加至30％；

10-15min：乙腈的体积分数由30％增加至90％；

15-24min：乙腈的体积分数维持90％不变。

2.一种液相色谱串联质谱法同时检测血浆样本中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量的方法，包括下述步骤：

1、标准曲线的制备：

取一系列浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照权利要求1所述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录每个浓度的葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮对应的峰面积；

以葛根素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以葛根素浓度X为横坐标，制备葛根素的线性回归方程；

以芒柄花黄素与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芒柄花黄素浓度X为横坐标，制备芒柄花黄素的线性回归方程；

以芍药苷与内标峰面积比值Y为纵坐标，以芍药苷浓度X为横坐标，制备芍药苷的线性回归方程；

以丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y为纵坐标，以丹参酮ⅡA浓度X为横坐标，制备丹参酮ⅡA的线性回归方程；

以隐丹参酮与内标峰面积比值Y为纵坐标，以隐丹参酮浓度X为横坐标，制备隐丹参酮的线性回归方程；

2、待测血浆样品中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量测定：

将待测血浆样品按照权利要求1所述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的液相色谱串联质谱法进行检测，并分别记录葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮对应的峰面积；

计算葛根素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述葛根素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中葛根素的浓度；

计算芒柄花黄素与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芒柄花黄素的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芒柄花黄素的浓度；

计算芍药苷与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述芍药苷的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中芍药苷的浓度；

计算丹参酮ⅡA与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述丹参酮ⅡA的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中丹参酮ⅡA的浓度；

计算隐丹参酮与内标峰面积比值Y，将Y值代入所述隐丹参酮的线性回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中隐丹参酮的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤a)中，所述待测血浆样品与甲酸的体积比为100:20；

步骤b)中，所述静置的时间为2-5min；所述待测血浆样品与乙酸乙酯的体积比为1:5-10；

步骤a)、b)、c)和d)中，所述混匀均采用涡旋的方式，涡旋的时间均为1-2min；

步骤c)和d)中，所述离心的条件均为18000×g-19000×g离心10-15min。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述液相色谱条件中，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈柱，规格为：4.6mm×100mm，填料直径为1.8μm；流动相流速为400μL/min；柱温为50℃；进样量为5μL。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：

步骤(2)检测所用质谱条件如下：采用API3200^TMLC/MS/MS液质分析***；离子源，正负离子快速切换分析模式，多反应监测扫描方式。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述质谱条件中，所述正负离子快速切换分析模式中，正离子模式参数设置为：气帘气：30psi；碰撞气：10psi；离子喷雾电压：5500V；温度：450℃；气流1：30psi；气流2：60psi；加热；

负离子模式参数设置为：气帘气：15psi；碰撞气：12psi；离子喷雾电压：-4500V；温度：450℃；气流1：30psi；气流2：40psi；加热。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述质谱条件中，所述多反应监测方法参数如下：

葛根素：母离子质量数：415.3；碎片离子质量数：295.1；解簇电压：-65V；入口电压：-6V；采样时间：100；碰撞能：-32V；碰撞池出口电压：-20V；保留时间：9.00min；

芒柄花黄素：母离子质量数：267.3；碎片离子质量数：252；解簇电压：-48V；入口电压：-5V；采样时间：100；碰撞能：-30V；碰撞池出口电压：-25V；保留时间：17.05min；

芍药苷：母离子质量数：449.1；碎片离子质量数：327.1；解簇电压：-56V；入口电压：-7V；采样时间：100；碰撞能：-15V；碰撞池出口电压：-26V；保留时间：11.11min；

隐丹参酮：母离子质量数：297.3；碎片离子质量数：251.3；解簇电压：70V；入口电压：6V；采样时间：100；碰撞能：30V；碰撞池出口电压：21V；保留时间：19.76min；

丹参酮ⅡA：母离子质量数：295.3；碎片离子质量数：249.2；解簇电压：80V；入口电压：4.5V；采样时间：100；碰撞能：35V；碰撞池出口电压：32V；保留时间：20.96min；

大黄素：母离子质量数：269.1；碎片离子质量数：225.1；解簇电压：-65V；入口电压：-7V；采样时间：100；碰撞能：-39V；碰撞池出口电压：-15V；保留时间：18.31min；

栀子苷：母离子质量数：387.0；碎片离子质量数：224.8；解簇电压：-40V；入口电压：-5V；采样时间：100；碰撞能：-16V；碰撞池出口电压：-5V；保留时间：9.63min。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法在测定复方丹蒌片中葛根素、芒柄花黄素、芍药苷、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的药代动力学中的应用。