CN104610214A - 一种快速制备瑞香狼毒中6种化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速制备瑞香狼毒中6种高纯化合物(异西瑞香素、雁皮素B、雁皮素C、(+)-狼毒宁B、异狼毒宁B和异狼毒宁A)的新工艺。以瑞香狼毒药材95%乙醇提取物为原料,经正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析初步分离富集,以制备型高效液相色谱为最终分离手段,通过一步高效液相制备,收集相应流份直接减压浓缩至干即可获得纯度大于98%的化合物。本发明工艺步骤简单,产品纯度高、色泽好,非常适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速制备瑞香狼毒中6种化合物的新工艺。主要包括正、反相柱层析分离富集以及快速的高效液相色谱除杂制备。化合物1(异西瑞香素)为双香豆素,化合物2(雁皮素B)、3(雁皮素C)、4((+)-狼毒宁B)、5(异狼毒宁B)、6(异狼毒宁A)为双二氢黄酮。其中,化合物1为狼毒属植物中首次制备,化合物2、6为该类双二氢黄酮的新异构体。这6种化合物的化学结构分别如下:
背景技术
瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)系瑞香科狼毒属植物,俗名断肠草,分布于中、俄、蒙、朝等国,在我国主要产自北方各省区及西南地区,生于海拔2600~4200米干燥而向阳的高山草坡、草坪或河滩台地。其味苦辛,性平,有大毒,入肺脾肝经,根入药,有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究表明瑞香狼毒具有很好的抗肿瘤活性,最新研究还发现其具有抗病毒、抗菌、抗惊厥和免疫调节等作用。目前,从瑞香狼毒中分离鉴定出的化学成分主要有二萜类、倍半萜类、黄酮类、香豆素类、木脂素和苯丙素苷类等,其中,黄酮类多为双二氢黄酮,是该药材的指标性化学成分,也是其主要活性成分之一。雁皮素C(化合物3)对恶性疟原虫氯喹耐药性株具有明显的杀除作用,其IC50值可达0.56μg/ml(Nunome S,et al.PLANTA MED,2004,70(1));(+)-狼毒宁B(化合物4)在体外能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,对人肺腺癌细胞A549的IC50值可达1.08μmol/L(Zhang C,et al.ACTA PHARMACOL SIN,2013,34(2));异狼毒宁B(化合物5)显示较强的抗真菌和抗有丝***活性,对稻瘟霉的MIC值为6.25μg/mL(Yang G,et al.CHEM PHARM BULL,2005,53(7));对化合物2、6的分离制备和药理研究还未见报道。另外,作为质控指标成分,必须有大量可用的化学对照品供应,但目前市场上对包括这6种化合物在内的香豆素和双二氢黄酮类对照品鲜有提供。因此,对瑞香狼毒药材中这6种化合物同时、高效制备方法的研究具有重要意义。
发明内容
本发明在前期研究瑞香狼毒化学成分***分离分析的基础上,提供了一种快速制备瑞香狼毒药材中6种化合物(异西瑞香素、雁皮素B、雁皮素C、(+)-狼毒宁B、异狼毒宁B和异狼毒宁A)的新工艺。以瑞香狼毒药材为原料,经正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析初步分离富集,以制备型高效液相色谱为最终分离手段,通过一步高效液相制备,收集含各化合物的流份直接减压浓缩至干即可获得纯度大于98%的化合物。具体步骤如下:
(1)正相硅胶柱层析:
取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏,以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解,在不断搅拌下,加入与浸膏等质量的200~300目柱层析硅胶,拌样,常温下充分晾干;之后干法上样,常压下过200~300目硅胶柱,依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱,收集氯仿-甲醇20:1流份,负压浓缩回收溶剂后,得一级粗分物。
(2)反相ODS柱层析:
将上述一级粗分物以甲醇溶解后,加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50μm ODS柱层析填料拌样,常温下充分晾干并处理成粉状;之后干法上样,过40~50μm ODS层析柱(柱长40cm,内径8cm),中压泵加压,压力为5~10MPa,流量控制在50~100ml/min,依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱,收集70%甲醇-水流份,负压浓缩回收溶剂后,得二级粗分物。
(3)高效液相色谱制备:
将上述二级粗分物以DMSO溶解,配制成浓度为50~100mg/ml的供试品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤;滤液采用柱长25-50cm、直径2-10cm的高效液相制备色谱柱进行分离,每次进样体积为0.5~2.5ml,以体积浓度70%~80%甲醇-水或45%~55%乙腈-水溶液为洗脱体系,流速控制在10~100ml/min,在线紫外检测,检测波长设定为295nm,分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份,负压干燥得6种粉末,即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品。
上述方法中,高效液相制备柱的填料为C18键合相,其粒径为5~10μm,紫外检测波长优选295nm,具体检测波长根据样品中目标化合物信号的超载情况而定。
本发明从瑞香狼毒材中同时制备6种化合物(1种双香豆素,5种双二氢黄酮),具有如下优点和进步:
①本发明采用三步法,先通过正、反相两步柱层析对目标化合物进行初步富集,然后采用一步高效液相制备方法分别进行除杂和精制,工艺较简单。
②本发明以制备型高效液相为最后分离手段,分离效率高,可以保证对照品的纯度。
③本发明发展的高效液相制备方法为快速制备方法,单针分离时间在40-60分钟之间,非常适合大批量化学对照品的制备;同时加上制备溶剂的回收再利用,可降低批量制备的成本。
④本发明采用紫外检测器在线检测,对各个对照品的分离情况可直接观察,可直接选择性收集高纯度样品,从而实现纯度保证下的高回收率。
总之,本发明工艺步骤简单,产品纯度高、色泽好,非常适合大规模生产。
附图说明
图1为瑞香狼毒药材二级粗分物及6种化合物(异西瑞香素、雁皮素B、雁皮素C、(+)-狼毒宁B、异狼毒宁B、异狼毒宁A)的HPLC分析谱图(295nm),
图1a:为二级粗分物图;
图1b:为异西瑞香素图;
图1c:为雁皮素B图;
图1d:为雁皮素C图;
图1e:为(+)-狼毒宁B图;
图1f:为异狼毒宁B图;
图1g:为异狼毒宁A图。
其积分报告分别如下:
Name | Retention Time | Area | %Area | |
1 | - | 4.39 | 36.5 | 1.77 |
2 | 异西瑞香素 | 6.21 | 2030.1 | 98.23 |
Name | Retention Time | Area | %Area | |
1 | - | 4.37 | 63 | 0.66 |
2 | 雁皮素B | 14.64 | 9523.4 | 99.34 |
Name | Retention Time | Area | %Area | |
1 | 雁皮素C | 16.21 | 6040.6 | 99.25 |
2 | - | 18.34 | 45.4 | 0.75 |
Name | Retention Time | Area | %Area | |
1 | - | 4.37 | 124.2 | 0.60 |
2 | (+)-狼毒宁B | 28.50 | 20530.6 | 99.40 |
Name | Retention Time | Area | %Area | |
1 | - | 4.37 | 185.6 | 1.01 |
2 | 异狼毒宁B | 36.65 | 18280.2 | 98.99 |
Name | Retention Time | Area | %Area | |
1 | - | 4.37 | 254.6 | 1.28 |
2 | 异狼毒宁A | 45.11 | 19579.1 | 98.72 |
(HPLC条件:色谱柱为江申Chromatorex C18(4.6×250mm,10μm),柱温30℃,流速1ml/min,进样体积5μl,流动相为:0~60min,50%乙腈-水)。
具体实施方式
现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明,实施例仅限于说明本发明,而非对本发明的限定。
实施例1
本实施例中,以瑞香狼毒药材95%(体积浓度,下同)乙醇提取物为原料,第一步正相柱层析采用200~300目硅胶,第二步反相柱层析采用40~50μm ODS,第三步高效液相色谱制备采用5μm C18键合相制备柱,采用体积浓度75%的甲醇-水溶液为洗脱体系,经三步分离即获得6种化合物纯品。具体工艺步骤如下:
(1)正相硅胶柱层析:取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏,以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解,在不断搅拌下,加入与浸膏等质量的200~300目柱层析硅胶,拌样,常温下充分晾干;之后干法上样,常压下过200~300目硅胶柱,依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1(体积比,下同)、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱,收集氯仿-甲醇20:1流份,负压浓缩回收溶剂后,得一级粗分物。
(2)反相ODS柱层析:将上述一级粗分物以甲醇溶解后,加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50μm ODS柱层析填料拌样,常温下充分晾干并处理成粉状;之后干法上样,过40~50μm ODS层析柱(柱长40cm,内径8cm),中压泵加压,压力为5~10MPa,流量控制在50~100ml/min,依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水(体积浓度,下同)洗脱,收集70%甲醇-水流份,负压浓缩回收溶剂后,得二级粗分物。
(3)高效液相色谱制备:将上述二级粗分物以DMSO溶解,配制成浓度为50mg/ml的供试品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤;色谱柱为Chromatorex C18制备柱,粒径5μm,尺寸250×20mm;进样体积为0.5ml,以体积浓度为75%的甲醇-水溶液(体积浓度,下同)为洗脱体系,流速控制在20ml/min,在线紫外检测,检测波长设定为295nm,分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份,负压干燥得6种淡棕色粉末,即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品(质量依次约1.5mg,3.6mg,1.5mg,6.0mg,5.2mg,6.6mg)。
实施例2
本实施例中,以瑞香狼毒药材95%乙醇提取物为原料,第一步正相柱层析采用200~300目硅胶,第二步反相柱层析采用40~50μm ODS,第三步高效液相色谱制备采用10μm C18键合相制备柱,采用50%的乙腈-水溶液为洗脱体系,经三步分离即获得6种化合物纯品。具体工艺步骤如下:
(1)正相硅胶柱层析:取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏,以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解,在不断搅拌下,加入与浸膏等质量的200~300目柱层析硅胶,拌样,常温下充分晾干;之后干法上样,常压下过200~300目硅胶柱,依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱,收集氯仿-甲醇20:1流份,负压浓缩回收溶剂后,得一级粗分物。
(2)反相ODS柱层析:将上述一级粗分物以甲醇溶解后,加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50μm ODS柱层析填料拌样,常温下充分晾干并处理成粉状;之后干法上样,过40~50μm ODS层析柱(柱长40cm,内径8cm),中压泵加压,压力为5~10MPa,流量控制在50~100ml/min,依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱,收集70%甲醇-水流份,负压浓缩回收溶剂后,得二级粗分物。
(3)高效液相色谱制备:将上述二级粗分物以DMSO溶解,配制成浓度为60mg/ml的供试品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤;色谱柱为Chromatorex C18制备柱,粒径10μm,尺寸300×50mm;进样体积为1ml,以体积浓度为50%的乙腈-水溶液为洗脱体系,流速控制在40ml/min,在线紫外检测,检测波长设定为295nm,分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份,负压干燥得6种淡棕色粉末,即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品(质量依次约3.6mg,8.6mg,3.6mg,14.4mg,12.4mg,15.5mg)。
实施例3
本实施例中,以瑞香狼毒药材95%乙醇提取物为原料,第一步正相柱层析采用200~300目硅胶,第二步反相柱层析采用40~50μm ODS,第三步高效液相色谱制备采用5μm C18键合相制备柱,采用70%的甲醇-水溶液为洗脱体系,经三步分离即获得6种化合物纯品。具体工艺步骤如下:
(1)正相硅胶柱层析:取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏,以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解,在不断搅拌下,加入与浸膏等质量的200~300目柱层析硅胶,拌样,常温下充分晾干;之后干法上样,常压下过200~300目硅胶柱,依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱,收集氯仿-甲醇20:1流份,负压浓缩回收溶剂后,得一级粗分物。
(2)反相ODS柱层析:将上述一级粗分物以甲醇溶解后,加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50μm ODS柱层析填料拌样,常温下充分晾干并处理成粉状;之后干法上样,过40~50μm ODS层析柱(柱长40cm,内径8cm),中压泵加压,压力为5~10MPa,流量控制在50~100ml/min,依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱,收集70%甲醇-水流份,负压浓缩回收溶剂后,得二级粗分物。
(3)高效液相色谱制备:将上述二级粗分物以DMSO溶解,配制成浓度为70mg/ml的供试品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤;色谱柱为Chromatorex C18制备柱,粒径5μm,尺寸500×60mm;进样体积为1.4ml,以体积浓度为70%甲醇-水溶液为洗脱体系,流速控制在60ml/min,在线紫外检测,检测波长设定为295nm,分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份,负压干燥得6种淡棕色粉末,即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品(质量依次约5.8mg,14.1mg,5.8mg,23.5mg,20.4mg,25.8mg)。
实施例4
本实施例中,以瑞香狼毒药材95%乙醇提取物为原料,第一步正相柱层析采用200~300目硅胶,第二步反相柱层析采用40~50μm ODS,第三步高效液相色谱制备采用10μm C18键合相制备柱,采用45%乙腈-水溶液为洗脱体系,经三步分离即获得6种化合物纯品。具体工艺步骤如下:
(1)正相硅胶柱层析:取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏,以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解,在不断搅拌下,加入与浸膏等质量的200~300目柱层析硅胶,拌样,常温下充分晾干;之后干法上样,常压下过200~300目硅胶柱,依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱,收集氯仿-甲醇20:1流份,负压浓缩回收溶剂后,得一级粗分物。
(2)反相ODS柱层析:将上述一级粗分物以甲醇溶解后,加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50μm ODS柱层析填料拌样,常温下充分晾干并处理成粉状;之后干法上样,过40~50μm ODS层析柱(柱长40cm,内径8cm),中压泵加压,压力为5~10MPa,流量控制在50~100ml/min,依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱,收集70%甲醇-水流份,负压浓缩回收溶剂后,得二级粗分物。
(3)高效液相色谱制备:将上述二级粗分物以DMSO溶解,配制成浓度为80mg/ml的供试品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤;色谱柱为Chromatorex C18制备柱,粒径10μm,尺寸600×80mm;进样体积为1.8ml,以体积浓度为45%乙腈-水溶液为洗脱体系,流速控制在90ml/min,在线紫外检测,检测波长设定为295nm,分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份,负压干燥得6种淡棕色粉末,即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品(质量依次约8.6mg,20.7mg,8.6mg,34.5mg,29.9mg,38.0mg)。
上述6种化合物的物理参数及结构鉴定结果如下:
化合物1,白色粉末。UV(MeOH,)λmax nm:205,350。MS(+ESI)m/z:353.068([M+H]+)。分子量352,分子式为C19H12O7。该化合物鉴定为异西瑞香素。
化合物2,淡棕色粉末。UV(MeOH,)λmax nm:215,295。CD(c=0.1mg/ml,MeOH)未出峰。MS(+ESI)m/z:557.148([M+H]+)。分子量556,分子式为C31H24O10。该化合物为新异构体,命名为雁皮素B。
化合物3,淡棕色粉末。UV(MeOH,)λmax nm:215,295。CD(c=0.1mg/ml,MeOH)未出峰。MS(+ESI)m/z:557.148([M+H]+)。分子量556,分子式为C31H24O10。该化合物鉴定为雁皮素C。
化合物4,淡棕色粉末。UV(MeOH,)λmax nm:215,295。CD(c=0.1mg/ml,MeOH)-4.2(346),0(325),+13.8(302),+1.0(274),+3.2(253),0(240),-2.7(233),-0.3(225),-7.3(217)。MS(+ESI)m/z:571.165([M+H]+)。分子量570,分子式为C32H26O10。该化合物鉴定为(+)-狼毒宁B。
化合物5,淡棕色粉末。UV(MeOH,)λmax nm:215,295。CD(c=0.2mg/ml,MeOH)未出峰。MS(+ESI)m/z:571.165([M+H]+)。分子量570,分子式为C32H26O10。该化合物鉴定为异狼毒宁B。
化合物6,淡棕色粉末。UV(MeOH,)λmax nm:215,295。CD(c=0.1mg/ml,MeOH)-13.0(309),0(299),+19.4(286),0(260),-1.1(254),0(247),+1.6(241),0(234),-14.1(217)。MS(+ESI)m/z:571.165([M+H]+)。分子量570,分子式为C32H26O10。该化合物为新异构体,命名为狼毒宁A。
各化合物的NMR氢谱、碳谱数据见下表:
注:1.溶剂为DMSO-d6。2.na表示信号未出现或不明显。
Claims (5)
1.一种快速制备瑞香狼毒中6种化合物的方法,其特征在于:以瑞香狼毒药材95%乙醇(体积浓度,下同)提取物为原料,依次经正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析初步分离富集,最后通过一步高效液相色谱制备,收集含各化合物的流份,分别直接减压浓缩至干即可获得纯度大于98%的6种化合物;它们分别为异西瑞香素、雁皮素B、雁皮素C、(+)-狼毒宁B、异狼毒宁B和异狼毒宁A。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
(1)正相硅胶柱层析:
取瑞香狼毒药材95%乙醇(体积浓度,下同)提取浸膏,以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解,在不断搅拌下,加入与浸膏等质量的200~300目柱层析硅胶,拌样,常温下充分晾干;之后干法上样,常压下过200~300目硅胶柱,依次以氯仿、氯仿-甲醇100:1(体积比,下同)、氯仿-甲醇50:1、氯仿-甲醇20:1洗脱,收集氯仿-甲醇20:1流份,负压浓缩回收溶剂后,得一级粗分物;
(2)反相ODS柱层析:
将上述一级粗分物以甲醇溶解后,加入与一级粗分物等质量的粒径为40~50μm ODS柱层析填料拌样,常温下充分晾干并处理成粉状;之后干法上样,过40~50μm ODS层析柱(柱长40cm,内径8cm),中压泵加压,压力为5~10MPa,流量控制在50~100ml/min,依次以15%(体积浓度,下同)、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱,收集70%甲醇-水流份,负压浓缩回收溶剂后,得二级粗分物;
(3)高效液相色谱制备:
将上述二级粗分物以DMSO溶解,配制成浓度为50~100mg/ml的供试品溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤;滤液采用柱长25-50cm、直径2-10cm的高效液相制备色谱柱进行分离,每次进样体积为0.5~2.5ml,以体积浓度70%~80%甲醇-水或45%~55%乙腈-水溶液为洗脱体系,流速控制在10~100ml/min,在线紫外检测,检测波长设定为295nm,分别收集含有化合物异西瑞香素、雁皮素B、雁皮素C、(+)-狼毒宁B、异狼毒宁B和异狼毒宁A的流份,负压干燥得6种粉末,即分别为纯度大于98%的化合物异西瑞香素、雁皮素B、雁皮素C、(+)-狼毒宁B、异狼毒宁B和异狼毒宁A纯品。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:第一步正相柱分离所采用的填料为200~300目柱层析硅胶,洗脱剂为体积比100:0~20:1的氯仿-甲醇溶液;第二步反相柱分离所采用的填料为40~50μm柱层析ODS,洗脱剂为体积浓度15%~70%的甲醇-水溶液。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:第三步高效液相制备过程采用的制备柱填料为C18键合相填料,粒径为5~10μm。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:高效液相制备过程采用采用在线紫外检测,其检测波长优选295nm。
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