CN105566414B

CN105566414B - 从杨梅果肉中分离纯化四种黄酮糖苷的方法

Info

Publication number: CN105566414B
Application number: CN201610049046.1A
Authority: CN
Inventors: 李鲜; 闫淑霞; 孙崇德; 陈昆松
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-01-25
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2018-09-07
Anticipated expiration: 2036-01-25
Also published as: CN105566414A

Abstract

本发明提供一种从杨梅果肉中分离纯化四种黄酮糖苷的方法，四种黄酮糖苷为矢车菊素‑3‑O‑葡萄糖苷、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷，通过样品提取、固相萃取柱和半制备高效液相色谱分离三个步骤完成。本发明以杨梅果肉冷冻干燥粉末为原料，经溶剂提取、C18

Description

从杨梅果肉中分离纯化四种黄酮糖苷的方法

技术领域

本发明属于天然植物中有效成分的提取分离纯化技术领域，具体涉及一种从杨梅果肉中分离纯化四种黄酮糖苷的方法，是以杨梅果肉为原料，采用溶剂萃取、C18固相萃取柱和半制备高效液相色谱的联用技术同时分离纯化杨梅果肉中的四种黄酮糖苷的方法。

背景技术

杨梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)原产中国，主要分布于长江以南各地，主产区包括浙江、江苏、福建等省份，作为药用树种已有两千多年的栽培历史，是杨梅科植物中最具有经济价值的树种，具有很高的营养价值。据报道，杨梅果实提取物具有抗氧化、抗癌、抗炎、降糖等活性，这些作用可能与其果实中富含的黄酮糖苷类化合物有关。前人的研究报道黄酮糖苷类化合物具有抗癌、降糖、降血脂、预防心血管疾病、消炎、神经保护等活性，对人体健康起非常重要的作用。因此，黄酮糖苷类化合物的分离纯化具有非常重要的保健价值。

随着近年来对黄酮糖苷类化合物的深入研究，市场需求量迅速增大。杨梅果肉中富含花青苷(尤其是C3G)，是提取花青苷的一个很好来源。同时，杨梅果实还含有一些黄酮醇类物质。目前，将杨梅果实中的这些黄酮糖苷类化合物从杨梅果肉中同时分离纯化得到高浓度的化合物的研究未见报道。采用溶剂萃取、C18固相萃取柱和半制备高效液相色谱的联用技术可有效快速的分离纯化杨梅果肉中的四种黄酮糖苷类化合物。

发明内容

本发明目的是提供一种从杨梅果肉中分离纯化四种黄酮糖苷的方法，四种黄酮糖苷为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷，通过以下步骤实现：

(1)将杨梅果肉液氮处理后使用冷冻干燥机除去果肉水分，将冷冻干燥后的杨梅果肉用磨样机打磨成粉末状；所述杨梅品种为‘荸荠’；

(2)取一定质量的冷冻干燥杨梅果肉粉末，用含0.5％甲酸的80％甲醇溶液超声提取2次，固液比为1:20，每次30min，经真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无甲醇相，溶于含0.5％甲酸的去离子水中；

(3)将步骤(2)得到的粗提水溶液上样C18固相萃取柱，上样后的固相萃取柱先用含0.5％甲酸的水洗脱4个柱床体积以去掉一些极性较高的杂质，然后依次用甲醇进行梯度洗脱，梯度洗脱为依次用含0.5％甲酸的10％甲醇溶液洗脱10个柱床体积、50％甲醇溶液洗脱4个柱床体积，洗脱液在旋转蒸发仪上37℃蒸干分别得到富含花青苷的10％洗脱组分和富含黄酮醇的50％洗脱组分；其中固相萃取柱型号为Waters C18Cartridges(12cc/2g)；

所述步骤(3)中梯度洗脱液分别为含0.5％甲酸的10％甲醇溶液、50％甲醇溶液。

(4)将10％洗脱组分用含0.1％盐酸的甲醇溶液配制成100mg/mL的浓度，进样量为300μL，流速为5mg/mL，收集保留时间为39.1min的组分，在旋转蒸发仪上37℃蒸干得到一种花青苷单体粉末C3G；将50％洗脱组分用甲醇溶液配制成100mg/mL的浓度，进样量为200μL，流速为5mg/mL，分别收集保留时间为62.6、63.8、75.6min的组分，在旋转蒸发仪上37℃蒸干分别得到三种黄酮醇单体粉末，分别是杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷。

本发明四种黄酮糖苷的结构式如下：

本发明纯化得到的C3G、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷四种黄酮糖苷经过高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)鉴定，与文献报道一致。

本发明的另一个目的是提供所述方法在杨梅果肉中分离纯化黄酮糖苷类化合物中的应用，所述黄酮糖苷类化合物具体为一种花青苷类物质即矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)以及三种黄酮醇类物质即杨梅苷、金丝桃苷和槲皮苷。

本发明采用溶剂萃取、C18固相萃取柱和半制备高效液相色谱的联用技术，以杨梅果肉冷冻干燥粉末为原料同时分离纯化得到高纯度的四种黄酮糖苷。本发明相对于现有技术有如下优点：(1)不需要高温高压及惰性气体的保护，合成工艺简单；(2)所用有机试剂安全，只需用到甲醇和乙腈即可；(3)纯化产物回收率高，纯度高；(4)整个纯化过程通过HPLC进行精确定量，准确度高；(5)操作简单，重现性好。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2为粗提液HPLC图谱，其中A为‘荸荠’果肉粗提物HPLC图谱，B为经C18固相萃取柱纯化后10％洗脱组分的HPLC色谱图，C为50％洗脱组分的HPLC色谱图；峰1为C3G，2为杨梅苷，3为金丝桃苷，4为槲皮苷。

图3为10％洗脱组分半制备高效液相图谱，组分Ⅰ为C3G；A检测波长为520nm，B检测波长为310nm。

图4为50％洗脱组分半制备高效液相图谱，组分Ⅰ为C3G，组分Ⅱ为杨梅苷，组分Ⅲ为金丝桃苷，组分Ⅳ为槲皮苷。A检测波长为520nm，B检测波长为350nm。

图5为纯化后得到的四种黄酮糖苷的二级质谱鉴定图谱；A为C3G，B为杨梅苷，C为金丝桃苷，D为槲皮苷。

具体实施方式

本发明结合附图和实例作进一步说明。

实施例一本发明通过以下试验进行影响因素的筛选确定

参见图1，(1)纯化材料的选择：新鲜的杨梅果肉液氮处理后使用冷冻干燥机除去果肉水分。将冷冻干燥后的杨梅果肉用磨样机打磨成粉末状。精确称量一定量不同杨梅品种的干样粉末，按固液比1:20加入含0.5％甲酸的80％甲醇，浸泡2h，超声30min，重复2次，合并上清液，过滤膜，37℃旋转真空浓缩到只剩水相，10000rpm离心5min，用于黄酮糖苷类化合物的HPLC分析。HPLC检测以色谱柱SunFireTM C18柱(5μm,4.6×250mm)为固定相；流动相A相为0.1％甲酸，B相为乙腈：0.1％甲酸(体积比1:1)；洗脱梯度为：0-15min，10-38％B；15-40min，38-48％B；40-45min，48-100％B；45-47min，100-10％B；47-50min，10％B；扫描波长：200-600nm；流速：1mL/min；进样体积：10μL；柱温：25℃。结果表明，‘荸荠’果肉中黄酮糖苷类化合物含量较高(表1)，且杂质较少，可作为纯化材料。

表1

n.d.表示未检测到。

(2)甲醇浓度选择：按照图1的提取方式获得的水溶液在C18固相萃取柱上样，直至流出液中检测的C3G的浓度为上样液中的5％时停止上样。上样后的C18固相萃取柱，先用含0.5％甲酸的水冲洗4个柱床体积(BV)，柱床体积为12mL，洗掉提取液中的杂质，然后依次用含0.5％甲酸的10％、20％、30％、40％、50％、60％甲醇溶液洗脱，每个梯度2BV，收集洗脱液，取1mL洗脱液浓缩到0.2mL含0.5％甲酸的甲醇中，用HPLC检测各梯度洗脱液中C3G的含量，确定洗脱溶剂的最佳浓度。结果表明，含0.5％甲酸的10％甲醇能洗脱大多数的C3G(表2)，50％甲醇可以洗脱大部分的黄酮醇。故将含0.5％甲酸的10％甲醇、50％甲醇作为梯度洗脱时的洗脱溶剂，以简化纯化步骤。洗脱液蒸干得到10％洗脱组分和50％洗脱组分。经固相萃取柱纯化后，四种黄酮糖苷的纯度明显提高(图2)。

表2

甲醇浓度(％)	C3G含量(mg/mL)	C3G质量(mg)
			0(水)	0	0
10	1.51	36.27
			20	0.94	22.57
30	0.14	3.30
			40	0.03	0.70
50	0	0
			60	0	0

(3)半制备高效液相纯化：利用Waters制备型HPLC(2535泵-2998检测器-2707自动进样器)。色谱条件：以SunFire^TM prep C18OBD^TM制备柱(5μm,19×250mm)为固定相；0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈：水(1:1)含0.1％甲酸溶液(B)为流动相。流速为5mL/min；扫描波长为280、350nm；柱温25℃；进样量为300μL。10％洗脱组分制备流动相洗脱条件为：0-10min,10％B；10-30min,10-30％B；30-50min,30-45％B；50-60min,45-60％B，而后100％甲醇冲洗柱子20min，参见图3。50％洗脱组分制备流动相洗脱条件为：0-35min,20-38％B；35-60min,38-48％B,60-80min,48-100％B,80-85min,100-20％B，参见图4。通过半制备高效液相纯化，可得到四种物质。四种物质结构经二级质谱(MS²)鉴定。质谱条件：ESI离子源，C3G正离子模式(ESI⁺)；黄酮醇为负离子模式(ESI^-)；干燥器(N₂)温度：350℃；流速：10.0L/min；雾化器压力：35psi；毛细管电压：4000V；质量扫描范围：m/z 50～1000。质谱数据采用MRM模式。特征碎片与文献报道一致，参见图5，可以确定四种物质分别是C3G、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷。经HPLC纯度测定后，C3G、杨梅苷、金丝桃苷和槲皮苷的纯度分别为96.22％、91.53％、91.92％和93.56％。

实施例二

(1)样品制备：将冷冻干燥后的‘荸荠’果肉粉末40g置于800mL含0.5％甲酸的80％甲醇溶液中超声提取30min，重复2次，合并上清液，过滤膜，37℃旋转真空浓缩到只剩水相，10000rpm离心5min，定容到250mL含0.5％甲酸的水中。浓缩液过C18固相萃取柱(6个)，每个小柱用40mL的水洗去糖，含0.5％甲酸的10％甲醇冲洗120mL，50％甲醇冲洗48mL，将洗脱液在旋转蒸发仪上37℃蒸干得到10％洗脱组分粉末389.47mg，50％洗脱组分粉末255.7mg。

(2)半制备液相进一步分离纯化：取10％洗脱组分粉末90mg，用含0.1％盐酸的甲醇配制为100mg/mL,采用半制备液相纯化，如见图3所示，进样量为300μL，收集保留时间为39.1min的组分。将其37℃旋转真空蒸干，得到深红色粉末38.8mg，即为组分ⅠC3G(图3)。取50％洗脱组分粉末120mg甲醇配制为100mg/mL,采用半制备液相纯化，如图4所示，进样量为200μL，分别收集保留时间为62.6、63.8、75.6min的组分。将其37℃旋转真空蒸干，分别得到黄色粉末3.4mg、6.5mg、4.1mg，分别为组分Ⅱ杨梅苷，组分Ⅲ金丝桃苷，组分Ⅳ槲皮苷(图4)。经过HPLC纯度测定，经半制备纯化后得到的C3G、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷纯度分别为95.89％、92.54％、90.87％、91.22％，回收率均高于70％。

实施例三

(1)样品制备：将冷冻干燥后的‘荸荠’果肉粉末50g置于1000mL含0.5％甲酸的80％甲醇溶液中超声提取30min，重复2次，合并上清液，过滤膜，37℃旋转真空浓缩到只剩水相，10000rpm离心5min，定容到200mL含0.5％甲酸的水中。浓缩液过C18固相萃取柱(7个)，每个小柱用40mL的水洗去糖，含0.5％甲酸的10％甲醇冲洗120mL，50％甲醇冲洗48mL，将洗脱液在旋转蒸发仪上37℃蒸干得到10％洗脱组分粉末620.4mg，50％洗脱组分粉末298.5mg。

(2)半制备液相进一步分离纯化：取10％洗脱组分粉末240mg，用含0.1％盐酸的甲醇配制为100mg/mL,采用半制备液相纯化，如见图3所示，进样量为300μL，收集保留时间为39.1min的组分。将其37℃旋转真空蒸干，得到深红色粉末102.4mg，即为组分ⅠC3G(图3)。取50％洗脱组分粉末240mg甲醇配制为100mg/mL,采用半制备液相纯化，如图4所示，进样量为200μL，分别收集保留时间为62.6、63.8、75.6min的组分。将其37℃旋转真空蒸干，分别得到黄色粉末4.6mg、15.6mg、7.6mg，分别为组分Ⅱ杨梅苷，组分Ⅲ金丝桃苷，组分Ⅳ槲皮苷(图4)。经过HPLC纯度测定，经半制备纯化后得到的C3G、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷纯度分别为99.17％、90.38％、94.57％、93.61％，回收率均高于70％。

Claims

1.一种从杨梅果肉中分离纯化四种黄酮糖苷的方法，四种黄酮糖苷为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）将杨梅果肉液氮处理后使用冷冻干燥机除去果肉水分，将冷冻干燥后的杨梅果肉用磨样机打磨成粉末状；

（2）取冷冻干燥的杨梅果肉粉末，用含0.5%甲酸的80%甲醇溶液超声提取2次，固液比为1:20，每次30 min，经真空抽滤后，合并上清液，在旋转蒸发仪上蒸干至无甲醇相，溶于含0.5%甲酸的去离子水中；

（3）将步骤（2）得到的水溶液上样C18 Sep-Pak®固相萃取柱，上样后固相萃取柱先用含0.5%甲酸的水洗脱4个柱床体积以去掉一些极性较高的杂质，然后依次用甲醇进行梯度洗脱，洗脱液在旋转蒸发仪上37℃蒸干分别得到富含花青苷的10%洗脱组分和富含黄酮醇的50%洗脱组分；所述的固相萃取柱型号为Waters C18 Sep-Pak® Cartridges 12 cc/2g；所述的梯度洗脱液分别为含0.5%甲酸的10%甲醇溶液、50%甲醇溶液，洗脱顺序为含0.5%甲酸的10%甲醇溶液10个柱床体积、50%甲醇溶液4个柱床体积；

（4）将10%洗脱组分用含0.1%盐酸的甲醇溶液配制成100 mg/mL的浓度，进样量为300 μL，流速为5mg/mL，收集保留时间为39.1 min的组分，在旋转蒸发仪上37℃蒸干得到一种花青苷单体粉末，为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，将50%洗脱组分用甲醇溶液配制成100 mg/mL的浓度，进样量为200 μL，流速为5mg/mL，分别收集保留时间为62.6、63.8、75.6 min的组分，在旋转蒸发仪上37℃蒸干分别得到三种黄酮醇单体粉末，分别为杨梅苷、金丝桃苷、槲皮苷；

四种黄酮糖苷的结构式如下：

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