CN101941961B - 一种从凤仙花中提取分离山奈酚的方法 - Google Patents

Abstract

一种从凤仙花中提取分离山奈酚的方法。该方法是关于中药有效成分的提取分离方法，具体涉及一种山奈酚的提取分离方法。该方法是针对目前山奈酚制备过程复杂、成本较高的现状而建立的。该方法具体步骤为首先将凤仙花提取得到的总提取物，然后经过大孔树脂纯化得到山奈酚粗品，最后用柱层析和重结晶方法制备得到山奈酚的纯品。该方法能有效从凤仙花中分离得到山奈酚单体，为含山奈酚中成药的质量检测提供对照品，并有利于山奈酚活性的开发。

Description

一种从凤仙花中提取分离山奈酚的方法

技术领域

本发明是关于中药有效成分的提取分离方法，具体涉及一种山奈酚的提取分离方法。

背景技术

山奈酚为一种黄酮醇类化合物。该化合物具有多种药理活性，如抗氧化作用、抗炎作用等，存在于多种中药及其相关制剂中，如银杏及其提取物和制剂、桑叶、白蕊草、石韦、菟丝子、罗汉果、金钱通淋颗粒等。山奈酚的含量是上述中药和制剂质量的重要检测指标，因此，在实际工作中需要提取分离纯度高的山奈酚作为对照品。同时，山奈酚作为一种具有多种药理活性的成分，在对于其活性进行深入研究的过程中，如何简化山奈酚的提取制备工艺、提高分离纯度，是制剂工艺研究过程的关键环节之一。

目前，报道的山奈酚的制备方法有如下方法：

1)国际专利WO2006/093368A1“MANUFACTURING METHOD OFKAEMPFEROL”，公开了从茶叶的种子和叶子中提取山奈酚的方法，该方法主要公开了主要采用酸、碱或酶对茶叶种子和叶子中含量较高的两种山奈酚的糖苷，即camelliaside A、camelliaside B，进行水解得到山奈酚的方法。

2)文献报道以银杏为原料制备山奈酚的方法(苏静、谈锋、谢峻等，循环高速逆流色谱从银杏叶提取物中制备异鼠李素和山奈酚，西南大学学报(自然科学版)，2009，31(10)：96-100)。该方法的主要过程是银杏叶超声提取、提取液氯仿净化、树脂富集黄酮成分、总黄酮用甲醇-25％盐酸(4∶1)混合液水解、3次HSCCC(高速逆流色谱)分离，得到山奈酚。

3)文献报道的另外一种以银杏为原料制备山奈酚的方法(徐涛、潘见、袁传勋等，液相色谱法制备山柰酚单体，安徽化工，2005，(2)：54-55)。该方法取银杏提取物，正丁醇萃取、正丁醇萃取液浓缩、浓缩物用3M的盐酸水解、水解液离心、上清液用树脂富集、得到山奈酚的粗品、粗品再用制备高效液相色谱法进行分离、冷冻干燥得到山奈酚。

可见，上述山奈酚的制备方法较为繁琐，具体体现在：1)需要采用水解方法使山奈酚的糖苷转变为山奈酚；2)山奈酚的制备中对设备的要求严格，使山奈酚的制备成本上升。

因此，需要寻找一种更为方便快捷的制备山奈酚的方法。

凤仙花为凤仙花属植物凤仙花Impatiens balsamina L.的干燥花瓣，具有活血通经、利尿止痛的作用，其中含有多种黄酮类化合物，文献显示山奈酚为其中含量较高的黄酮类成分(胡喜兰、韩照祥、刘玉芬等，凤仙花不同提取物中山奈酚的测定，分析实验室，2007，26(5)：33-35)。因此以凤仙花的干燥花瓣为原料分离制备山奈酚，相对于上述采用水解的方法，方法简便。基于此，文献报道了相应的从凤仙花中制备山奈酚的方法(胡喜兰、程青芳、尹福军等，凤仙花中山萘酚的提取、分离与纯化，时珍国医国药，2010，21(4)：932-933)。

该方法的具体步骤是：

1)取凤仙花的干燥花瓣，置于索式提取器中，石油醚浸泡过夜，后回流至提取液无色；

2)再将提取过的花瓣，置于索式提取器中，乙酸乙酯浸泡过夜，后回流至提取液无色；

3)乙酸乙酯提取液回收溶剂，得山奈酚的粗提物；

4)采用葡聚糖凝胶(LH-20)进行分离，收集含山奈酚的流分，并浓缩得相应山奈酚精提物；

5)采用制备高效液相色谱对山奈酚精提物进行分离制备山奈酚。

该方法山奈酚制备成本较高，不合适大规模工业化生产。原因有：1)葡聚糖凝胶(LH-20)价格较贵；2)制备高效液相仪器昂贵，同时制备山奈酚的量有限。另外，该方法步骤较多，过程较为复杂。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以凤仙花为原料，提取分离山奈酚的方法。该方法相对于已有方法更为简便，适合工业化生产。

本发明的目的是通过如下技术方案来实现：

A：取干燥的凤仙花花瓣，适当粉碎，加入10～100％乙醇或甲醇进行提取，提取液浓缩回收溶剂，得总提取物；

B：总提取物加水适当分散，上大孔树脂吸附柱，先用水溶液洗脱除杂，再用10～40％乙醇洗脱除杂，最后用40～100％的乙醇洗脱并收集该部分洗脱液，浓缩回收溶剂，得山奈酚粗品；

C：取聚酰胺湿法装柱，将30～100％乙醇溶解的山奈酚粗品溶液加入柱顶，用30～100％乙醇洗脱，收集洗脱液，薄层检识，合并含有山奈酚的流份，回收溶剂，得山奈酚的精品；

D：取山奈酚的精品，于甲醇或乙醇与水组成的混合溶剂中重结晶，过滤，干燥，得山奈酚纯品。

上述方法中步骤A中的提取方式为煎煮、加热回流、超声提取、微波提取、高压提取中的任意一种。

上述方法中步骤A的方法为：取干燥的凤仙花花瓣25重量份，加入浓度为40～100％的乙醇或甲醇400～900体积份，加热回流提取0.5～2小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取2～5次，合并提取液，药渣弃去；提取液回收乙醇，得稠膏，即总提取物。

上述方法中步骤A的优选方法为：取干燥的凤仙花花瓣25重量份，加入浓度为80％的乙醇750体积份，加热回流提取1小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取3次，合并提取液，药渣弃去，提取液回收乙醇，得稠膏，即总提取物，6.8重量份。

上述方法中步骤B中大孔吸附树脂为非极性、弱极性或中等极性中的任意一种。

上述方法中步骤B的方法为：取总提取物，加药材量5～9倍体积份的水稀释，上非极性、弱极性或中等极性中的任意一种大孔吸附树脂柱，树脂量为药材量的6～10倍体积份，径高比为1∶5～8，吸附流速2～4BV/h；先用水洗脱5～13BV，流速2～5BV/h，再用10～40％的乙醇洗脱5～10BV，流速2～5BV/h；最后用40～100％的乙醇洗脱2～5BV，流速2～5BV/h，收集40～100％的乙醇洗脱液，回收溶剂，得山奈酚粗品。

上述方法中步骤B的优选方法为：取上述总提取物6.8重量份，加药材量6倍体积份的水稀释，上D101型大孔吸附树脂柱，树脂量为药材量的8倍体积份，径高比为1∶6，吸附流速3BV/h，先用水洗脱9BV，流速3BV/h，再用30％的乙醇洗脱9BV，流速3BV/h，最后用50％的乙醇洗脱4BV，流速2BV/h，收集50％的乙醇洗脱液，回收溶剂，得0.55重量份山奈酚粗品。

上述方法中步骤C的方法为：取山奈酚粗品，用药材量0.1～1倍体积份50～90％的乙醇充分溶解，得上样液，另取聚酰胺湿法装柱，将上样液加入柱顶，径高比为1∶8～15，以50～100％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，薄层检识，合并含有山奈酚的流份，回收溶剂得山奈酚的精品。

上述方法中步骤C优选的方法为：取山奈酚粗品0.55重量份，用药材量0.2倍体积份70％的乙醇充分溶解，得上样液，另取药材量0.4倍重量份的80～100目聚酰胺，用70％乙醇湿法装柱，径高比为1∶10，将上样液加入柱顶，以70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，薄层检识，合并含有山奈酚的流份，回收溶剂得0.25重量份山奈酚的精品。

上述方法中步骤D的方法为：取山奈酚的精品，于2～8∶4～9甲醇-水或2～8∶4～9乙醇-水的混合溶剂中进行重结晶，过滤，干燥得山奈酚纯品。

上述方法中步骤D优选的方法为：取0.25重量份山奈酚的精品，于3∶7乙醇-水混合溶剂中重结晶，过滤，干燥得0.15重量份山奈酚纯品。

采用本方法提取制备山奈酚，提取工艺路线简单，适合于工业化大规模生产。

具体实施方式

下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：山奈酚的纯度检查

用高效液相色谱法检查纯度。仪器：Waters 600高效液相色谱仪。色谱柱：YWG-C₁₈色谱柱，250mm×4.6mm，5μm。流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液(50～70∶50～30)；流速：0.8～1.2mL/min；柱温：室温；检测波长：367nm；进样量：10μl；保留时间(RT)：山奈酚为5～30min；色谱图纪录时间：60min。面积归一化法测纯度，山奈酚的纯度为98.8％。

实验例2：山奈酚的结构测定

熔点用X-4型数字显示显微熔点测定仪；紫外(UV)光谱用日本岛津UV-260型紫外可见分光光度计；红外(IR)光谱用Perkin-Elmer 983G型仪器测定，KBr压片；核磁共振氢谱和碳谱(¹HNMR和¹³CNMR)用MERCURY-400核磁共振仪测定；质谱(MS)用Finnigan-LCQ^DECA型质谱仪测定。

上述精制方法所得的山奈酚纯品为：黄色颗粒状结晶，熔点276～278℃。UVλmax(nm)：226，267，349。IRυmax(KBr，cm^-1)：3324(OH)，1662(C＝O)。MS(m/z)：309(M+Na)。¹H NMR(δ，DMSO-d₆)：12.47(5-OH)，10.85(7-OH)，10.12(3-OH)，9.43(4′-OH)，8.03(2H，d，J＝9.0Hz，C_2′-H，C_6′-H)，6.91(2H，d，J＝9.0Hz，C_3′-H，C_5′-H)，6.43(1H，d，J＝1.8Hz，C₈-H)，6.18(1H，d，J＝1.8Hz，C₆-H)。¹³C NMR(δ，DMSO-d₆)：175.9(C-4)，163.9(C-7)，160.7(C-5)，159.2(C-4′)，156.2(C-9)，146.8(C-2)，135.6(C-3)，129.5(C-2′)，129.5(C-6′)，121.7(C-1′)，115.4(C-3′)，115.4(C-5′)，103.1(C-10)，98.2(C-6)，93.5(C-8)。

以上波谱数据与文献报道一致，结构如下：

实验例3大孔吸附树脂富集山奈酚粗品的实验

取干燥的凤仙花花瓣2.5kg，加入浓度为80％的乙醇75L，加热回流提取1小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取3次，合并提取液，药渣弃去；提取液回收乙醇，得稠膏即总提取物0.68kg。

取上述总提取物0.68kg，加15L水稀释，用D101型大孔吸附树脂柱，树脂量为20L(水中体积)，径高比为1∶6，吸附流速3BV/h；先用水洗脱9BV，流速3BV/h，再用30％的乙醇洗脱9BV，流速3BV/h；最后用50％的乙醇洗脱4BV，流速2BV/h，收集该部分洗脱液，回收溶剂，得0.055kg山奈酚粗品。

实验例4聚酰胺柱层析方法与重结晶方法联用制备山奈酚纯品的实验

山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。柱层析时使用的吸附剂为聚酰胺80～100目(台州市路桥四甲生化塑料厂生产，1kg)。取上述山奈酚粗品0.055kg，用0.5L 70％的乙醇充分溶解，得上样液，湿法上样(聚酰胺层析柱用70％乙醇水溶液湿法装柱，层析柱的直径高比为1∶10)。以70％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，每份400ml，共收集60份，每份减压浓缩至小体积后，用聚酰胺薄层检测。薄层条件：聚酰胺薄膜预制；展开剂：氯仿-甲醇-甲酸(10∶2∶0.05)；显色条件：1％AlCl₃乙醇溶液显色，紫外灯365nm波长下观察。其中第25～40份中山奈酚的含量较高，将其合并，减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品0.025kg。

取山奈酚精品0.025kg，于3∶7乙醇-水混合溶剂中重结晶，过滤，干燥，得0.015kg的山奈酚纯品，为黄色颗粒状结晶。

实施例1

取干燥的凤仙花花瓣2.5kg，加入浓度为90％的甲醇60L，加热回流提取1小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取2次，合并提取液，药渣弃去；提取液回收乙醇，得稠膏即总提取物0.55kg。

取上述总提取物0.55kg，加12.5L水稀释，用AB-8型大孔吸附树脂柱，树脂量为15L(水中体积)，径高比为1∶5，吸附流速2BV/h；先用水洗脱5BV，流速2BV/h，再用20％的乙醇洗脱6BV，流速2BV/h；最后用50％的乙醇洗脱5BV，流速2BV/h，收集该部分洗脱液，回收溶剂，得0.043kg山奈酚粗品。

山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。柱层析时使用的吸附剂为聚酰胺80～100目(台州市路桥四甲生化塑料厂生产，1kg)。取上述山奈酚粗品0.043kg，用0.5L 70％的乙醇充分溶解，得上样液，湿法上样(聚酰胺层析柱用80％乙醇水溶液湿法装柱，层析柱的直径高比为1∶10)。以80％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，每份200ml，共收集80份，每份减压浓缩至小体积后，用聚酰胺薄层检测。薄层条件：聚酰胺薄膜预制；展开剂：氯仿-甲醇-甲酸(10∶2∶0.05)；显色条件：1％AlCl₃乙醇溶液显色，紫外灯365nm波长观察。其中第20～30份中山奈酚的含量较高，将其合并，减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品0.015kg。

取山奈酚精品0.015kg，于5∶5甲醇-水混合溶剂中重结晶，过滤，干燥，得0.008kg的山奈酚纯品，为黄色颗粒状结晶。

实施例2

取干燥的凤仙花花瓣2.5kg，加入浓度为80％的乙醇70L，加热回流提取1.5小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取3次，合并提取液，药渣弃去；提取液回收乙醇，得稠膏即总提取物0.65kg。

取上述总提取物0.65kg，加15L水稀释，用D101型大孔吸附树脂柱，树脂量为20L(水中体积)，径高比为1∶7，吸附流速3BV/h；先用水洗脱9BV，流速3BV/h，再用30％的乙醇洗脱7BV，流速2BV/h；最后用70％的乙醇洗脱4BV，流速2BV/h，收集该部分洗脱液，回收溶剂，得0.05kg山奈酚粗品。

山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。柱层析时使用的吸附剂为聚酰胺120～200目(台州市路桥四甲生化塑料厂生产，1kg)。取上述山奈酚粗品0.05kg，用0.7L 70％的乙醇充分溶解，得上样液，湿法上样(聚酰胺层析柱用70％乙醇水溶液湿法装柱，层析柱的直径高比为1∶12)。以70％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，每份400ml，共收集60份，每份减压浓缩至小体积后，用硅胶薄层检测，展开剂：氯仿-甲醇-甲酸(10∶1∶0.05)；显色条件：1％AlCl₃乙醇溶液显色，紫外灯365nm波长观察。其中第25～40份中山奈酚的含量较高，将其合并，减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品0.023kg。

取山奈酚精品0.023kg，于3∶7乙醇-水混合溶剂中重结晶，过滤，干燥，得0.014kg的山奈酚纯品，为黄色颗粒状结晶。

实施例3

取干燥的凤仙花花瓣2.5kg，加入浓度为70％的乙醇80L，加热回流提取1小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取3次，合并提取液，药渣弃去；提取液回收乙醇，得稠膏即总提取物0.70kg。

取上述总提取物0.70kg，加20L水稀释，用HPD100型大孔吸附树脂柱，树脂量为22L(水中体积)，径高比为1∶7，吸附流速3BV/h；先用水洗脱12BV，流速3BV/h，再用30％的乙醇洗脱10BV，流速4BV/h；最后用80％的乙醇洗脱4BV，流速2BV/h，收集该部分洗脱液，回收溶剂，得0.074kg山奈酚粗品。

山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。柱层析时使用的吸附剂为聚酰胺80～100目(台州市路桥四甲生化塑料厂生产，1.3kg)。取上述山奈酚粗品0.074kg，用1L 75％的乙醇充分溶解，得上样液，湿法上样(聚酰胺层析柱用75％乙醇水溶液湿法装柱，层析柱的直径高比为1∶10)。以75％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，每份400ml，共收集70份，每份减压浓缩至小体积后，用硅胶薄层检测，展开剂：氯仿-甲醇(7∶3)；显色条件：1％AlCl₃乙醇溶液显色，紫外灯365nm波长观察。其中第20～35份中山奈酚的含量较高，将其合并，减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品0.022kg。

取山奈酚精品0.022kg，于4∶6乙醇-水混合溶剂中重结晶，过滤，干燥，得0.013kg的山奈酚纯品，为黄色颗粒状结晶。

实施例4

取干燥的凤仙花花瓣2.5kg，加入浓度为60％的甲醇80L，加热回流提取2小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取4次，合并提取液，药渣弃去；提取液回收乙醇，得稠膏即总提取物0.75kg。

取上述总提取物0.75kg，加20L水稀释，用D4020型大孔吸附树脂柱，树脂量为25L(水中体积)，径高比为1∶8，吸附流速4BV/h；先用水洗脱13BV，流速4BV/h，再用30％的乙醇洗脱10BV，流速5BV/h；最后用90％的乙醇洗脱3BV，流速2BV/h，收集该部分洗脱液，回收溶剂，得0.087kg山奈酚粗品。

山奈酚纯品的制备采用聚酰胺柱层析和重结晶联用的方法制备。柱层析时使用的吸附剂为聚酰胺80～100目(台州市路桥四甲生化塑料厂生产，1.3kg)。取上述山奈酚粗品0.087kg，用1.5L 60％的乙醇充分溶解，得上样液，湿法上样(聚酰胺层析柱用60％乙醇水溶液湿法装柱，层析柱的直径高比为1∶13)。以60％乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，每份400ml，共收集120份，每份减压浓缩至小体积后，用聚酰胺薄层检测。薄层条件：聚酰胺薄膜预制；展开剂：氯仿-甲醇-甲酸(10∶2∶0.05)；显色条件：1％AlCl₃乙醇溶液显色，紫外灯365nm波长观察。其中第55～73份中山奈酚的含量较高，将其合并，减压抽干溶剂得黄色山奈酚精品0.02kg。

取山奈酚精品0.02kg，于3∶7甲醇-水混合溶剂中重结晶，过滤，干燥，得0.011kg的山奈酚纯品，为黄色颗粒状结晶。

Claims (1)

1.一种山奈酚的提取分离方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

A：取干燥的凤仙花花瓣25重量份，适当粉碎，加入浓度为80％的乙醇750体积份，加热回流提取1小时，过滤，药渣以同样的方法先后提取3次，合并提取液，药渣弃去，提取液回收乙醇，得稠膏，即总提取物，6.8重量份；

B：取上述总提取物6.8重量份，加药材量6倍体积份的水稀释，上D101型大孔吸附树脂柱，树脂量为药材量的8倍体积份，径高比为1∶6，吸附流速3BV/h，先用水洗脱9BV，流速3BV/h，再用30％的乙醇洗脱9BV，流速3BV/h，最后用50％的乙醇洗脱4BV，流速2BV/h，收集50％的乙醇洗脱液，浓缩回收溶剂，得0.55重量份山奈酚粗品；

C：取山奈酚粗品0.55重量份，用药材量0.2倍体积份70％的乙醇充分溶解，得上样液，另取药材量0.4倍重量份的80～100目聚酰胺，用70％乙醇湿法装柱，径高比为1∶10，将上样液加入柱顶，以70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，薄层检识，合并含有山奈酚的流份，回收溶剂得0.25重量份山奈酚的精品；

D：取0.25重量份山奈酚的精品，于3∶7乙醇-水混合溶剂中重结晶，过滤，干燥得0.15重量份山奈酚纯品。