CN1544433A - 瑞香狼毒中新狼毒素b的提取分离方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法及其应用，其从瑞香狼毒根中分离鉴定出一个对多种植物病原菌具有抑制和杀灭作用的广谱性杀菌活性成分，即新狼毒素B，本发明包括以下操作步骤：以瑞香狼毒根为原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯与丙酮的混合物为溶剂，采用30℃～55℃超声波常压连续提取3次，每次提取时间30～50min。提取液经过滤、浓缩和柱色谱层析获得60％～99％的新狼毒素B。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种医药、兽药和农药中间体或原药领域中瑞香狼毒的综合利用，尤其是涉及一种瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法及其作为植物杀菌剂的应用。
二、背景技术：
瑞香狼毒(Stellera Chamaejasme L.)系瑞香科狼毒属植物，别名有狼毒、断肠草等，其根是传统中药狠毒的基质，具有散结逐水，止痛和杀虫作用。早在1959年出版的《中国土农药志》中就有将瑞香狼毒作为植物源农药应用的记载，当时人们将狼毒根的粉末埋入地下用于防治田间地下害虫，或将狼毒的水提液喷洒在植物叶面用于防除叶面豆蚜、菜蚜、叶锈病等。近年来，有研究者相继开发出含狼毒粗提物的植物原农药，有的已申请专利。但这些狼毒型植物源农药均为杀虫剂，少数几个有明确的有效成分和含量，大部分专利中则不清楚其杀虫活性成分。张洁等(专利申请号00116146)发明了由紫茎泽兰、瑞香狼毒和鱼藤制备广谱性生灭虫剂的方法，该法制备的灭虫剂属于复方制剂，其杀虫有效成分不清，作用对象不含植物病原菌。张克杰等(专利申请号02133769)叙述了由狼毒根、茎制备生物农药狼毒素水乳剂的工艺，该法制备的产品属于单方制剂，杀虫有效成分及其含量明确，为1.1％～5％。但同样其作用对象仅为植物害虫，不含植物病原菌。刘世贵等(专利申请号02133971)公开了由狼毒促提取物、印楝素和益母草生物碱等制备植物杀虫剂的方法，该法得到的产品为复配制剂，其中狼毒提取物中的有效成分不清楚，作用对象同样仅为植物害虫。韩明理等(专利申请号02100771.3)叙述了由瑞香狼毒制备0.3％狼毒素植杀水剂的制备方法，该产品为单方制剂，有效成分为狼毒素，作用对象仍然为只是植物害虫。其生产工艺中只涉及狼毒根的粗提物，而不涉及狼毒素的分离。综上所述，可以看出，狼毒作为植物源农药的应用主要为杀虫剂，关于其杀菌剂的研究和开发还属于空白。
Niwa等人(Tetrahydron Letters，1984，25(34)：3735-3738)最早从瑞香狼毒根中分离鉴定出新狼毒素B。随后有冯宝民(中草药，2001，32(1)：14-15)等多人的研究相继证实了Niwa等人的研究结果。这些研究具有共同的特点，即都是属于植物化学或天然产物化学的基础理论研究，其研究方法均为实验室的常规方法，提取效率低，分离方法复杂繁琐，根本不适宜于工业化规模生产。其次，所有关于新狼毒素B的研究报道极少涉及其生物活性的研究，更没有关于新狼毒素B对植物病原菌即作为植物杀菌剂的研究。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法及其应用，其从瑞香狼毒根中分离鉴定出一个对多种植物病原菌具有抑制和杀灭作用的广谱性杀菌活性成分，即新狼毒素B，适合规模化从狼毒根中提取分离新狼毒素B，生产方法和工艺简便、经济、合理，同时，提供新狼毒素B作为广谱性植物杀菌活性成分的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特殊之处在于包括以下操作步骤：将狼毒根粉加入溶剂进行提取，然后进行第一次硅胶柱层析粗分，得一次粗分物，再进行第二次硅胶柱层析粗分，得二次粗分物，再对二次粗分物进行纯化。
上述操作步骤包括：以瑞香狼毒根为原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯与丙酮的混合物为溶剂，采用30℃～55℃超声波常压连续提取3次，每次提取时间30～50min。提取液经过滤、浓缩和柱色谱层析获得60％～99％的新狼毒素B。
上述操作步骤包括：
(1)将狼毒根粉碎至一定程度，按照狼毒根粉重量(kg)和溶剂体积(L)1∶4～1∶10的比例，采用间歇式超声波提取，提取温度30℃～55℃，每批原材料采用同种溶剂连续提取3次，每次提取时间为30～50min，超声功率为1.8W，每次超声时间为6s，两次超声之间的时间间隔为4s；
(2)每次提取结束后，采用离心过滤，收集滤液，将3次提取液合并，负压蒸除溶剂后，得粗提物，回收的溶剂可反复使用，总提取率根据溶剂的种类不同而不同，一般为7％～21％，粗提物中新狼毒素B的含量为5％～25％，粗提物无需分离纯化，可直接用于配制植物杀菌剂水乳剂，也可选用其他有机溶剂对该粗提物进行二次超声提取，所得粗提物一次提取物或二次提取物用于新狼毒素B的粗分；
(3)用丙酮或甲醇或二者的混合物溶解粗提物，配成质量浓度约20％的溶液，在不断搅拌下，加入相当于粗提物3～7倍质量的大约200目的柱层析硅胶，将拌样后的硅胶在常温下晾干，加到硅胶柱的顶端，进行干柱层析，依次采用氯仿、乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯流份，负压蒸除溶剂后，得一次粗分物，该粗分物中的新狼毒素B含量为45％～55％，可直接用于配制医用或农用杀菌剂；
(4)将一次粗分物采用与(3)类似的方法进行柱层析，所不同的是采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶剂作为洗脱剂，以新狼毒素B标准品为对照，采用TLC法或HPLC法对各流份进行检测，合并含有新狼毒素B的流份，负压蒸除溶剂后，得二次粗分物，该粗分物中的新狼毒素B含量为80％～90％，可直接用于配制医用或农用杀菌剂；
(5)用甲醇溶解二次粗分物，上sephadex LH-20柱进行纯化，收集含有新狼毒素B的流份，负压蒸除溶剂后，得新狼毒素B精品，含量为95％～99％，可作为标准样品或分析纯化学试剂使用。
上述步骤(1)中，提取溶剂选用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇中的一种，提取方案包括：A.直接用乙酸乙酯或丙酮进行超声提取，料(kg)/液(L)比控制在1∶4～1∶10，，提取温度为30℃～55℃，所得粗提取物为淡黄色无晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱层析分离。乙酸乙酯和丙酮的提取率分别为5％～6％和7％～8％；B.首先采用甲醇进行超声提取，提取条件同乙酸乙酯法，所得粗提物可直接用于配制植物杀菌剂或二次提取，本次提取率为18％～25％，用丙酮对甲醇粗提物进行二次超声提取，提取条件同乙酸乙酯法，所得丙酮粗提物相当于所用植物材料的10％～12％，为黄色无晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱层析分离。
上述步骤(2)中，将粗提物用丙酮配成质量浓度约20％的溶液，加入3～7倍质量的柱层析用硅胶，室温晾干拌样后的硅胶或用40℃热风常压干燥，然后加到硅胶柱顶端进行第一次干柱层析粗分，硅胶柱的规格为：高度/直径10∶1，硅胶填充料的粒度为100～300目，其用量为上样量的1～3倍，首先采用氯仿进行洗脱，直到流出液几乎无色为止，然后换用乙酸乙酯洗脱，直至TLC或HPLC检测无新狼毒素B流出，合并乙酸乙酯流份，蒸除溶剂后得一次粗分物，其质量约为上样量的40％～50％。该粗分物的新狼毒素B含量为45％～55％。
上述步骤(3)中，将一次粗分物用丙酮配成饱和溶液，加到硅胶柱顶端进行湿柱硅胶层析，硅胶柱的规格为：高度/直径20∶1。硅胶填充料的粒度为100～300目，其用量为上样量的50～100倍，以氯仿—丙酮7∶3(V/V)的混合溶剂作为洗脱剂，收集含有新狼毒素B的主要流份，蒸除溶剂后得二次粗分物，黄色无晶形粉末，其质量约为上样量的40％～50％，新狼毒素B的含量为80％～90％。
上述步骤(4)中，将二次粗分物用甲醇配成饱和溶液，并事先用甲醇平衡过的sephadex LH-20进行纯化，柱子的规格为：高度/直径10∶1，sephadex LH-20的粒度为200～400目，上样量为柱中sephadex LH-20用量的50～100倍，以甲醇为洗脱剂，减压浓缩含新狼毒素B的流份，得新狼毒素B精品，其质量约为上样量的85％～90％，整个工艺的总收率相当于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，纯度为95％～99％。
上述新狼毒素B的物理参数如下：
新狼毒素B，淡黄色无定型固体，mp261℃(分解)，[α]D＝+161.685°(c0.089，EtOH)，UV(MeOH，nm)：λmax298，221。IR(KBr)：υmaxcm-13422(O-H)，1640(C＝O)，1517(C＝C)，1254、1160、1088(C-O)。FAB MS e/z：541([M+1]+，100)，272([1/2M+1]+，42)。1H NMRδ(CD3COCD3)：2.91(4H，s，br，HO-7，HO-7″，HO-4′，HO-4)，3.15(1H，d，J＝4.4Hz，H-3)，3.40(1H，d，J＝7.2Hz，H-3″)，5.14(1H，d，J＝8.4Hz，H-2″)，5.75(1H，d，J＝4.8Hz，H-2)，5.86(2H，s，H-6，H-6″)，5.95(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，6.08(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，11.69(1H，s，HO-5″)，11.97(1H，s，HO-5)。以下为H-2′，H-2″，H-3′，H-3″，H-5′，H-5″，H-6′，H-6″：6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，6.89(2H，d，J＝8.4Hz)，7.00(2H，d，J＝8.4Hz)，7.28(2H，d，J＝8.8Hz)。13CNMRδ(CD3COCD3)：48.27，49.14(C-3，C-3″)，80.15，82.07(C-2，C-2″)，95.38，95.10(C-8，C-8″)，96.37，96.16(C-6，C-6″)，103.02，104.07(C-10，C-10″)，115.39，115.65(C-3′，C-3)，127.51，127.78(C-1′，C-1)，127.89，129.21(C-2′，C-2″′)，157.63，157.93(C-4′，C-4)，162.17，164.05(C-9，C-9′′)，166.97，166.76(C-7，C-7″)，195.37，197.49(C-4，C-4″)。
HPLC图谱：洗脱剂CH3OH/H2O(V/V)47∶5，Waters ALC/JPC-201高压液相色谱仪，柱子为Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒径4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外检测器，检测波长296nm。
一种瑞香狼毒中新狼毒素B作为植物杀菌剂的应用，其特殊之处在于：所述杀菌剂以瑞香狼毒根提取物为原料，以新狼毒素B为主要杀菌有效成分，用于预防和治疗由苹果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternariasolani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，烟草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici.)等引起的植物病害。
上述新狼毒素B为2200mg·L-1浓度。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
本发明首次采用生物活性跟踪法和化学分离法，从瑞香狼毒根中分离鉴定出一个对多种植物病原菌具有抑制和杀灭作用的广谱性杀菌活性成分，即新狼毒素B(chamaechromone)。同时，开发出从狼毒根中提取分离新狼毒素B的生产工艺，提取效率高，分离方法简单，适宜于工业化规模生产，并首次将新狼毒素B作为植物杀菌剂应用。
四、附图说明：
图1为本发明的工艺流程图；
图2为新狼毒素B的化学结构式；
图3为新狼毒素B的HPLC图谱。
五、具体实施方式：
1、参见图1，本发明采用4步法来获得不同含量的新狼毒素B，即提取、第一次硅胶柱层析粗分、第二次硅胶柱层析粗分、sephadexLH-20纯化，各步分离所获得目标物中新狼毒素B的含量分别为5％～25％，45％～55％，80％～90％，95％～99％。其工艺流程如下：
1.1、将狼毒根粉碎至一定程度，其细度无严格要求，一般为直径1mm。按照狼毒根粉重量(kg)和溶剂体积(L)1∶8的比例，采用间歇式超声波提取，提取温度为40℃。每批原材料采用同种溶剂连续提取3次，每次提取时间为40min。超声功率为1.8W，每次超声时间为6s，两次超声之间的时间间隔为4s。如果以分离新狼毒素B精品为最终目的，选用乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯/丙酮1∶1(V/V)为溶剂。如果以提取粗提取用于配制瑞香狼毒杀菌剂为最终目的，则选用甲醇为溶剂。
1.2、提取时的固液分离，可采用负压过滤、离心过滤或压榨过滤三种方法之一，最好采用离心过滤。滤液经水泵减压，在38℃下蒸除溶剂后，得粗提物。回收的溶剂可反复使用。总提取率根据溶剂的种类不同而不同，乙酸乙酯、丙酮和甲醇的提取率分别为5.2％、6.4％和21％。三种粗提物中新狼毒素B的含量大约分别为20％、6％和5％。三种粗提物无需分离纯化，均可直接用于配制植物杀菌剂水乳剂。如果以分离新狼毒素B精品为最终目的，则选用乙酸乙酯或丙酮提取物。
1.3、在对乙酸乙酯或丙酮粗提取进行第一次硅胶柱层析时，选择丙酮溶解粗提物，配成质量浓度约20％的溶液。然后，加入相当于粗提物3～7倍质量的大约200目的柱层析硅胶，快速拌匀后，常温晾干。加到相当于拌样硅胶质量的1/8的硅胶柱的顶端，进行干柱层析。依次采用氯仿、乙酸乙酯进行洗脱。新狼毒素B存在于乙酸乙酯流份中，水泵减压蒸除溶剂后，得一次粗分物。该粗分物中的新狼毒素B含量为45％～55％，可直接用于配制医用或农用杀菌剂，亦可作为农用杀菌剂原药出售。
1.4、在对一次粗分物进行硅胶柱层析时，采用常规干柱层析。采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶剂装柱，同时又作为洗脱剂。以新狼毒素B标准品为对照，采用TLC法或HPLC法对各流份进行检测。合并含有新狼毒素B的所有流份，负压蒸除溶剂后，得二次粗分物。该粗分物中的新狼毒素B含量为80％～90％，可直接用于配制医用或农用杀菌剂。
1.5、对二次粗分物的纯化采用sephadex LH-20凝胶色谱进行。柱子的规格为：高度/直径10∶1。sephadex LH-20的粒度为300目。上样量为柱中sephadex LH-20用量的1/50倍。以甲醇为洗脱剂，收集合并仅含新狼毒素B的流份，减压浓缩后可获得新狼毒素B精品，其收率约为上样量的85％～90％，相当于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，纯度为95％～99％。
2、新狼毒素B作为植物杀菌剂的应用
本发明首次发现了新狼毒素B在植物杀菌方面的新作用和新用途，填补了狼毒和新狼毒素B在植物杀菌方面的研究空白。研究结果证实，新狼毒素B在2200mg·L-1浓度对苹果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternariasolani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，烟草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici.)等植物病原菌的抑制率分别为81.1％，80.0％，77.3％，87.8％，98.5％，96.8％，81.0％。因此，新狼毒素B有望成为新的植物源农用杀菌剂。
3、参见图2，图2为新狼毒素B的化学结构式，物理参数如下：新狼毒素B，淡黄色无定型固体，mp261℃(分解)，[α]D＝+161.685°(c0.089，EtOH)，UV(MeOH，nm)：λmax298，221。IR(KBr)：υmaxcm-13422(O-H)，1640(C＝O)，1517(C＝C)，1254、1160、1088(C-O)。FAB MS e/z：541([M+1]+，100)，272([1/2M+1]+，42)。1H NMR δ(CD3COCD3)：2.91(4H，s，br，HO-7，HO-7″，HO-4′，HO-4)，3.15(1H，d，J＝4.4Hz，H-3)，3.40(1H，d，J＝7.2Hz，H-3″)，5.14(1H，d，J＝8.4Hz，H-2″)，5.75(1H，d，J＝4.8Hz，H-2)，5.86(2H，s，H-6，H-6″)，5.95(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，6.08(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，11.69(1H，s，HO-5″)，11.97(1H，s，HO-5)。以下为H-2′，H-2″，H-3′，H-3″，H-5′，H-5″，H-6′，H-6″：6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，6.89(2H，d，J＝8.4Hz)，7.00(2H，d，J＝8.4Hz)，7.28(2H，d，J＝8.8Hz)。13CNMRδ(CD3COCD3)：48.27，49.14(C-3，C-3″)，80.15，82.07(C-2，C-2″)，95.38，95.10(C-8，C-8″)，96.37，96.16(C-6，C-6″)，103.02，104.07(C-10，C-10″)，115.39，115.65(C-3′，C-3)，127.51，127.78(C-1′，C-1)，127.89，129.21(C-2′，C-2″′)，157.63，157.93(C-4′，C-4)，162.17，164.05(C-9，C-9′′)，166.97，166.76(C-7，C-7″)，195.37，197.49(C-4，C-4″)。
参见图3，HPLC图谱：洗脱剂CH3OH/H2O(V/V)47∶5，WatersALC/JPC-201高压液相色谱仪，柱子为Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒径4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外检测器，检测波长296nm。
Claims (10)
1、一种瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于包括以下操作步骤：将狼毒根粉加入溶剂进行提取，然后进行第一次硅胶柱层析粗分，得一次粗分物，再进行第二次硅胶柱层析粗分，得二次粗分物，再对二次粗分物进行纯化。
2、根据权利要求1所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于包括以下操作步骤：以瑞香狼毒根为原料，用4～10倍重量的乙酸乙酯或丙酮或乙酸乙酯与丙酮的混合物为溶剂，采用30℃～55℃超声波常压连续提取3次，每次提取时间30～50min，提取液经过滤、浓缩和柱色谱层析获得60％～99％的新狼毒素B。
3、根据权利要求2所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)将狼毒根粉碎，按照狼毒根粉重量(kg)和溶剂体积(L)1∶4～1∶10的比例，采用间歇式超声波提取，提取温度30℃～55℃，每批原材料采用同种溶剂连续提取3次，每次提取时间为30～50min，超声功率为1.8W，每次超声时间为6s，两次超声之间的时间间隔为4s；
(2)每次提取结束后，采用离心过滤，收集滤液，将3次提取液合并，负压蒸除溶剂后，得粗提物，回收的溶剂可反复使用，总提取率根据溶剂的种类不同而不同，一般为7％～21％，粗提物中新狼毒素B的含量为5％～25％，粗提物无需分离纯化，可直接用于配制植物杀菌剂水乳剂，也可选用其他有机溶剂对该粗提物进行二次超声提取，所得粗提物一次提取物或二次提取物用于新狼毒素B的粗分；
(3)用丙酮或甲醇或二者的混合物溶解粗提物，配成质量浓度约20％的溶液，在不断搅拌下，加入相当于粗提物3～7倍质量的200目的柱层析硅胶，将拌样后的硅胶在常温下晾干，加到硅胶柱的顶端，进行干柱层析，依次采用氯仿、乙酸乙酯进行洗脱，收集乙酸乙酯流份，负压蒸除溶剂后，得一次粗分物，该粗分物中的新狼毒素B含量为40％～50％，可直接用于配制医用或农用杀菌剂；
(4)将一次粗分物采用与(3)类似的方法进行柱层析，所不同的是采用氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶剂作为洗脱剂，以新狼毒素B标准品为对照，采用TLC法或HPLC法对各流份进行检测，合并含有新狼毒素B的流份，负压蒸除溶剂后，得二次粗分物，该粗分物中的新狼毒素B含量为80％～90％，可直接用于配制医用或农用杀菌剂；
(5)用甲醇溶解二次粗分物，上sephadex LH-20柱进行纯化，收集含有新狼毒素B的流份，负压蒸除溶剂后，得新狼毒素B精品，含量为90％～95％，可作为标准样品或分析纯化学试剂使用。
4、根据权利要求3所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于：所述步骤(1)中，提取溶剂选用氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇或甲醇，提取方案包括：A.直接用乙酸乙酯或丙酮进行超声提取，料(kg)/液(L)比控制在1∶4～1∶10，提取温度为30℃～55℃，所得粗提取物为淡黄色无晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱层析分离，乙酸乙酯和丙酮的提取率分别为5％～6％和7％～8％；B.首先采用甲醇进行超声提取，提取条件同乙酸乙酯法，所得粗提物可直接用于配制植物杀菌剂或二次提取，本次提取率为18％～25％，用丙酮对甲醇粗提物进行二次超声提取，提取条件同乙酸乙酯法，所得丙酮粗提物相当于所用植物材料的10％～12％，为黄色无晶形粉末，含有5％～10％的新狼毒素B，直接用于柱层析分离。
5、根据权利要求4所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将粗提物用丙酮配成质量浓度约20％的溶液，加入3～7倍质量的柱层析用硅胶，室温晾干拌样后的硅胶或用40℃热风常压干燥，然后加到硅胶柱顶端进行第一次干柱层析粗分，硅胶柱的规格为：高度/直径10∶1，硅胶填充料的粒度为100～300目，其用量为上样量的1～3倍，首先采用氯仿进行洗脱，直到流出液几乎无色为止，然后换用乙酸乙酯洗脱，直至TLC或HPLC检测无新狼毒素B流出，合并乙酸乙酯流份，蒸除溶剂后得一次粗分物，其质量为上样量的40％～50％，该粗分物的新狼毒素B含量为40％～50％。
6、根据权利要求5所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将一次粗分物用丙酮配成饱和溶液，加到硅胶柱顶端进行湿柱硅胶层析，硅胶柱的规格为：高度/直径20∶1，硅胶填充料的粒度为100～300目，其用量为上样量的50～100倍，以氯仿-丙酮7∶3(V/V)的混合溶剂作为洗脱剂，收集含有新狼毒素B的主要流份，蒸除溶剂后得二次粗分物，黄色无晶形粉末，其质量为上样量的40％～50％，新狼毒素B的含量为80％～90％。
7、根据权利要求6所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于：所述步骤(4)中，将二次粗分物用甲醇配成饱和溶液，并事先用甲醇平衡过的sephadex LH-20进行纯化，柱子的规格为：高度/直径10∶1，sephadex LH-20的粒度为200～400目，上样量为柱中sephadex LH-20用量的50～100倍，以甲醇为洗脱剂，减压浓缩含新狼毒素B的流份，得新狼毒素B精品，其质量为上样量的85％～90％，整个工艺的总收率相当于狼毒根原材料的0.5％～1.5％，纯度为90％～95％。
8、根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的瑞香狼毒中新狼毒素B的提取分离方法，其特征在于：新狼毒素B的化学结构特征和特征物理参数如下：
新狼毒素B(neochamaejasmine B)
新狼毒素B，淡黄色无定型固体，mp261℃(分解)，[α]D＝+161.685°(c0.089，EtOH)，UV(MeOH，nm)：λmax298，221。IR(KBr)：υmaxcm-13422(O-H)，1640(C＝O)，1517(C＝C)，1254、1160、1088(C-O)。FAB MS e/z：541([M+1]+，100)，272([1/2M+1]+，42)。1H NMRδ(CD3COCD3)：2.91(4H，s，br，HO-7，HO-7″，HO-4′，HO-4)，3.15(1H，d，J＝4.4Hz，H-3)，3.40(1H，d，J＝7.2Hz，H-3″)，5.14(1H，d，J＝8.4Hz，H-2″)，5.75(1H，d，J＝4.8Hz，H-2)，5.86(2H，s，H-6，H-6″)，5.95(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，6.08(1H，d，J＝2.0Hz，H-8或H-8″)，11.69(1H，s，HO-5″)，11.97(1H，s，HO-5)。以下为H-2′，H-2″，H-3′，H-3″，H-5′，H-5″，H-6′，H-6″：6.76(2H，d，J＝8.4Hz)，6.89(2H，d，J＝8.4Hz)，7.00(2H，d，J＝8.4Hz)，7.28(2H，d，J＝8.8Hz)。13C NMRδ(CD3COCD3)：48.27，49.14(C-3，C-3″)，80.15，82.07(C-2，C-2″)，95.38，95.10(C-8，C-8″)，96.37，96.16(C-6，C-6″)，103.02，104.07(C-10，C-10″)，115.39，115.65(C-3′，C-3)， 127.51，127.78(C-1′，C-1)，127.89，129.21(C-2′，C-2)，157.63，157.93(C-4′，C-4)，162.17，164.05(C-9，C-9″)，166.97，166.76(C-7，C-7″)，195.37，197.49(C-4，C-4″)。
HPLC图谱：洗脱剂CH3OH/H2O(V/V)47∶5，Waters ALC/JPC-201高压液相色谱仪，柱子为Nova.Pak C18，150mm×4mm(i.d)，粒径4.5μm，流速0.7ml·min-1，紫外检测器，检测波长296nm。
9、一种瑞香狼毒中新狼毒素B作为植物杀菌剂的应用，其特征在于：所述杀菌剂以瑞香狼毒根提取物为原料，以新狼毒素B为主要杀菌有效成分，用于预防和治疗由苹果干腐病菌(Bakeri Rehm)，小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，蕃茄早疫病菌(Alternaria solani)，南瓜枯萎病菌(Fusarium bulbigenum)，玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)，烟草赤星病菌(Alternaria alternata)和辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici.)等引起的植物病害。
10、根据权利要求9所述的瑞香狼毒中新狼毒素B作为植物杀菌剂的应用，其特征在于：所述新狼毒素B为2200mg·L-1浓度。
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