CN112940056B - 苦番红花素的对照品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种苦番红花素的对照品的制备方法，包括正相色谱纯化工序、中压反相色谱纯化工序、高压反相色谱纯化工序，目标物富集回收工序，其中目标物富集回收工序中，将高压反相色谱纯化工序中得到的含有目标物的洗脱液在45℃下避光浓缩至无醇味，将其全部用上样至中压反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa用乙腈或者甲醇洗脱，得到目标流份，在50℃以下的温度下避光浓缩、冷冻干燥，得到苦番红花素对照品。

Description

苦番红花素的对照品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种苦番红花素的制备方法，尤其涉及能够制备可以用于TCL高纯度的苦番红花素的固体对照品的制备方法。

背景技术

西红花(Crocussativus L)，又称番红花，为鸢尾科番红花属植物，原产于欧洲南部至伊朗,经印度传入西藏,故亦称藏红花,习用至今,主产于伊朗、希腊、意大利、西班牙、印度、中国、日本等国家，可用于食品染料和香料。现在我国浙江、江西、江苏、北京、上海有少量栽培。中医将其干燥柱头入药,，具有活血化瘀，凉血解毒，解郁安神的功效。用于经闭症瘕，产后瘀阻，温毒发斑，忧郁痞闷，惊悸发狂,现代药理学研究表明，西红花具有强身健体的功效。目前国内外已经从西红花中分离得到了100多种化合物，主要有菇类、黄酮类、蒽酮类等，并具有治疗精神类疾病、神经退行性疾病、学习记忆障碍、心血管疾病、动脉粥样硬化、高脂血症、糖尿病、高血压、胃溃疡、脂肪肝以及抗癫痈、抗惊厥等多种活性。

作为名贵药材和名贵香料,西红花价格高昂，但是市场上产品良莠不齐，因此通过严格的质量控制手段控制产品质量势在必行。2015年版《中国药典》中西红花的检测方法，仅规定了西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ两种成分含量的检测方法。根据公开文献表明，西红花组分含量测定不能满足相关产品的实际需要。近期，正在研究将西红花中另一种中药的活性成分苦番红花素也纳入到成分检测的范围中来。

苦番红花素的结构式如下：

作为中药西红花的指标成分之一，获得苦番红花素对照品显得十分必要。然而市场上并没有高纯度的苦番红花素的对照品售卖，一般情况仅仅能购买到98％左右纯度的苦番红花素对照品。通过结构分析，苦番红花素因有醛基的存在，易被氧化成羧基，稳定性差，是限制得到高纯度苦番红花素对照品的原因。

因此，研发提供高通量、能提供高纯度、特别是高TLC的纯度苦番红花素，且适合大量制备的苦番红花素对照品制备方法是非常迫切的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量、能提供高纯度苦番红花素，且适合大量制备的苦番红花素对照品制备方法。本发明中，苦番红花素有时也称为目标物、或分离目标物。

如果并未特殊说明，本发明中目标物的纯度和含量的百分数，为以质量比计的含量。如果并未特殊说明，本发明中液体与液体含量配比的百分数，例如甲酸在乙腈水溶液中的含量配比，以体积分数计量。

本发明通过简单高效的操作流程，能够分离得到纯度很高的苦番红花素。本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：

一种苦番红花素的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

正相色谱纯化工序：将含有苦番红花素的原料提取物粗品上样至正相色谱柱，用包含乙酸乙酯、甲醇、水的洗脱液进行洗脱，乙酸乙酯:甲醇:水的比例为15～25:21～2:0.05～0.15，根据HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到第一粗品浓缩液；

中压反相色谱纯化工序：将第一粗品浓缩液上样至中压反相色谱，用浓度12～16％的乙腈水溶液以压力为0.05～0.5Mpa进行洗脱，根据HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到半成品浓缩液，将浓缩液冷冻干燥得到苦番红花素半成品粉末；

高压反相色谱纯化工序：将苦番红花素半成品粉末用甲醇水溶液溶解上样至高压反相色谱柱，以5～15.0Mpa压力用40～60％甲醇水溶液洗脱，除去色素及少量的前后杂，收集含有目标物的洗脱液；

目标物富集回收工序：将高压反相色谱纯化工序中得到的含有目标物的洗脱液在45℃下避光浓缩至无醇味，将其全部用上样至中压反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa用乙腈或者甲醇洗脱，得到目标流份，在50℃以下的温度下避光浓缩、冷冻干燥，得到苦番红花素对照品。

在本发明优选的实施方式中，所述含有苦番红花素的原料提取物粗品的制备方法如下：将原料西红花粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液，在50℃以下的温度下避光浓缩，再进行冷冻干燥。

在本发明优选的实施方式中，正相色谱纯～化工序中，所述乙酸乙酯:甲醇:水的混合比例为18～22:0.8～1.5:0.01～0.15。

在本发明优选的实施方式中，中压反相色谱纯化工序中，用浓度13～15％的乙腈水溶液以压力为0.1～0.3Mpa进行洗脱。

在本发明优选的实施方式中，高压反相色谱纯化工序中，以8～10Mpa压力用45～55％甲醇水溶液洗脱。

在本发明优选的实施方式中，正相色谱纯化工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶。

在本发明优选的实施方式中，中压反相色谱柱的填料为粒径为40-60um的十八烷基硅烷键合硅胶，高压反相色谱柱的填料为粒径为5-10um的十八烷基硅烷键合硅胶。

在本发明优选的实施方式中，醇系的水溶液为60％～85％的甲醇水溶液或者60％～85％的乙醇水溶液浸泡

在本发明优选的实施方式中，目标物富集回收工序：用90～98％的乙腈洗脱，或者用90～98％的甲醇洗脱。

本发明还提供一种纯度为98.5％以上的苦番红花素的固体对照品，上述制备方法制备得到，本发明的方法制备的对照品不但HPLC纯度高。

本发明具有以下特点：

本发明操作简单高效，能够进行工艺放大，分离得到大量苦番红花素单体。

分离获得的产品通过核磁、质谱确定产品结构信息，并非其他文献通过质谱推测鉴定结构。

通过本发明实验方案能够分离得到HPLC高纯度的苦番红花素，优选实施方式中可以得到纯度大于98.5％的苦番红花素单体。

附图说明

图1为本发明实施例1获得的苦番红花素纯品的HPLC图谱；

图2为本发明比较例1获得的苦番红花素纯品的HPLC图谱；

图3为苦番红花素纯品的H-NMR图谱；

图4为苦番红花素纯品的C-NMR图谱；

图5为苦番红花素纯品的质谱图。

具体实施方式

以下记载本发明的具体实施方式。

本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：

正相色谱纯化工序，将含有苦番红花素的原料提取物粗品上样至正相色谱柱，用包含乙酸乙酯、甲醇、水的洗脱液进行洗脱，乙酸乙酯:甲醇:水的比例为15～25:21～2:0.05～0.15，根据HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到第一粗品浓缩液；

中压反相色谱纯化工序，将第一粗品浓缩液上样至中压反相色谱，用浓度12～16％的乙腈水溶液以压力为0.05～0.5Mpa进行洗脱，根据HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到半成品浓缩液，将浓缩液冷冻干燥得到苦番红花素半成品粉末；

高压反相色谱纯化工序，将苦番红花素半成品粉末用甲醇水溶液溶解上样至高压反相色谱柱，以5～15.0Mpa压力用40～60％甲醇水溶液洗脱，除去色素及少量的前后杂，收集含有目标物的洗脱液；

目标物富集回收工序，将高压反相色谱纯化工序中得到的含有目标物的洗脱液在45℃下避光浓缩至无醇味，将其全部用上样至中压反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa用乙腈或者甲醇洗脱，得到目标流份，在50℃以下的温度下避光浓缩、冷冻干燥，得到苦番红花素对照品。

本发明的发明人发现，通常的标准品制备思路，是不断的增加色谱分离的分辨率，利用更高压力和分离度更好的色谱柱进行不断的纯度提高。然而本发明的发明人发现该技术思路对于获得98％以下的纯度的苦番红花素是基本上可用，可实施的。然而，当通过色谱柱提纯工序获得的粗品纯度达到98.5％以上或者更高之后，即使继续加大制备分离的分辨率，纯度也非常难于提高。原因并不十分清楚，可能是由于目标化合物稳定性不好，因此在提取分离过程中，自身发分解导致此种方法仅仅能获得最高98％左右的纯品。

以往的回收过程，在获得高压反相色谱纯化的洗脱液后，由于这些洗脱液中含有大量的水成分，因此需要较长时间的浓缩和干燥过程，即使发明人小心的使用低温，避光、冷冻干燥的过程，仍然无法获得98.5％以上的纯品。本发明人改进了最后的目标物回收过程，获得高压反相色谱纯化的洗脱液后，对于该洗脱液并不进行浓缩干燥，仅仅在45℃下避光浓缩至无醇味，紧接着就快速的将其用注射泵全部上样至全新装柱并冲洗干净的中压反相色谱柱上。浓缩方法没有特别限制，可以使用加热蒸发浓缩，旋转蒸发仪浓缩等。所谓浓缩至无醇味，实质混合溶液中的甲醇基本已经被蒸发去除了(含量小于5％)，仅剩下难以蒸干的水。此时几乎是将目标物的水溶液直接上样至反相柱色谱上，由于极性关系，几乎所有的目标物，都会吸附在色谱柱上。此时再通过有机溶剂的洗脱剂，例如甲醇或乙腈，进行洗脱，可以得到目标物溶解在的甲醇或者乙腈中的洗脱液，该洗脱液可以快速的进行浓缩。很可能是由于大大压缩了纯化样品的回收时间，从而更明显的抑制了化合物本身的分解变质，因此突破了无法超过98％的纯度的障碍，获得了高于99％的纯度的苦番红花素，特别适合作为高质量的对照品使用。同时整个过程适合放大，可以极大的提高对照品的制备通量。

本发明中的正相色谱纯化工序中，将含有苦番红花素的原料提取物粗品上样至正相色谱柱，用包含乙酸乙酯、甲醇、水的洗脱液进行洗脱，乙酸乙酯:甲醇:水的比例为15～25:21～2:0.05～0.15。所使用的正相色谱柱的填料，可以用公知的正相填料，所谓正相填料，就是固定相的极性大于流动相的极性的填料，如果流动相为有机溶剂，常用的填料为硅胶、Al₂O₃、极性键合相填料等，本发明中优选使用硅胶。硅胶的粒径大小没有特别限制，从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，第一正相色谱柱提纯工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶。为了更好的获得分离效率，优选正相色谱纯化工序中，所述乙酸乙酯:甲醇:水的混合比例为18～22:0.8～1.5:0.01～0.15。

本发明中，中压反相色谱分离用于将与目标物极性有差异的其他成分分离，采用0.05～0.5Mpa的洗脱压力能够实现分辨率和速度之间的平衡，中压柱分离工序中，中压反相色谱柱的压力优选为0.1Mpa～0.2Mpa，此压力因为能平衡分离效果和分离速度而特别优选。所谓的高压反相色谱柱分离，通常指洗脱压力大于1Mpa的色谱柱分离技术。本发明中，以5～15.0Mpa压力进行洗脱，实现分辨率和速度之间的平衡。本发明的中压反相色谱纯化工序中，进一步优选用浓度13～15％的乙腈水溶液以压力为0.1～0.3Mpa进行洗脱。本发明的高压反相色谱纯化工序中，进一步优选以8～10Mpa压力用45～55％甲醇水溶液洗脱。

本发明中色谱柱制备工序中使用的反相色谱柱的反相填料，可以用公知的非极性的，键合的官能团为烷烃的(例如：C18(ODS)、C8、C4等)的硅胶。优选C18(ODS)硅胶柱，即十八烷基硅烷键合硅胶，优选使用40～60μm的填料，合理的粒径有利于维持适当的柱压和分辨率，十八烷基硅烷键合硅胶在市场上易于购买。从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，反相色谱柱的填料为粒径为40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

根据本发明的原理，在目标物富集回收工序中，可使用的中压反相色谱柱可以是任意的中压反相色谱柱，只要填料承载量能够满足目标物的容量的中压反相色谱柱即可。

本发明的制备方法中作为含有苦番红花素的原料提取物粗品可以直接使用市售的番红花提取物，还可以使用现有公知的方法提取，优选使用以下方法提取：

将原料西红花粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液，在50℃以下的温度下避光浓缩，再进行冷冻干燥。此处所谓的醇系水溶液，优选使用甲醇、乙醇的水溶液，进一步优选使用为60％～85％的甲醇水溶液或者60％～85％的乙醇水溶液。

本发明的目标物富集回收工序中，可以用甲醇或者乙腈这些反相洗脱剂直接洗脱乙腈吸附下反相柱上的目标物，但是考虑到反相柱的寿命，优选使用90～98％的乙腈洗脱，或者用90～98％的甲醇洗脱。

本发明中，考虑到目标物可能不稳定，所有的浓缩、冻干工序中，都优选避光下进行，优选在45℃以下的温度进行减压除去乙腈后，浓缩过程优选控制在60分钟以内，然后直接进行冷冻干燥，这样可以提高稳定性，抑制纯品目标物的降解，获得更高纯度的固体对照品。

综上，本发明通过以上的制备方法，首次获得了固体纯度98.5％以上的的苦番红花素化合物。

实施例

以下，通过实施例进一步详细说明本发明的典型的提取方式。以下实验方案仅仅是示例，并非对本发明的限定。本领域人员可以在理解实施例原理和发明精神的前提下进行任意的变更。

实施例1

A.原料提取：将西红花910g，加入10L 80％甲醇水(甲醇采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶)，超声提取2次，每次1小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，45℃下避光浓缩至无醇味，共3L；

B.冷冻干燥：将步骤A中的浓缩液，进行冷冻干燥处理(冷冻干燥机采购于宁波新芝生物科技股份有限公司)，得到西红花提取物粉末；

C.正相纯化：称取8.5kg烟台江友硅胶，加入25L乙酸乙酯湿法装柱(乙酸乙酯采购于上海泰坦科技股份有限公司，30L/桶)；将步骤B中的提取物粉末加1L的甲醇溶解后(甲醇采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶)，加入1.5kg烟台江友硅胶拌样，置阴凉处自然风干后上样；然后用乙酸乙酯:甲醇:水＝20:1:0.1进行等度洗脱目标物质，根据HPLC检测收集洗脱液，得到HPLC 90％的目标流份，45℃下避光浓缩至400ml；

D.中压制备纯化：将步骤C中所得到的浓缩液上中压制备柱(Daiso RPS-C18，40-60um，1.8-2.0kg填料，柱尺寸460×100mm，采购于苏州汇通色谱分离纯化有限公司)，流速：50mL/min，用14％乙腈水等度洗脱(乙腈采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶)，根据HPLC检测收集洗脱液，得到HPLC 98.5％左右的目标流份；45℃下避光浓缩至无乙腈味，冷冻干燥得到粉末；

E.高压制备纯化：将步骤D中所得到HPLC 98.5％左右的苦番红花素粉末用40％甲醇水溶解(甲醇采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶)；采用LC-20AP制备型液湘制备(采购于岛津株式会社)，色谱柱采用YMC-Triart C18，250*50mm、7um，流速为120ml/min，检测波长为254nm，，50％甲醇水等度洗脱，除去色素及少量的前后杂，收集目标流份；

F.产品回收：将步骤E中得到的高压目标流份在45℃下避光浓缩至无醇味，用中压C18柱(Daiso RPS-C18，40-60um，1.8-2.0kg填料，柱尺寸460×100mm，采购于苏州汇通色谱分离纯化有限公司)，上样吸附后，用95％乙腈洗脱目标，得到目标流份，在45℃下避光浓缩、冷冻干燥，获得目标物35g。

比较例1

A.原料提取：将西红花910g，加入10L 80％甲醇水(甲醇采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶)，超声提取2次，每次1小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，45℃下避光浓缩至无醇味，共3L；

B.冷冻干燥：将步骤A中的浓缩液，进行冷冻干燥处理(冷冻干燥机采购于宁波新芝生物科技股份有限公司)，得到西红花提取物粉末；

C.正相纯化：称取8.5kg烟台江友硅胶，加入25L乙酸乙酯湿法装柱(乙酸乙酯采购于上海泰坦科技股份有限公司，30L/桶)；将步骤B中的提取物粉末加1L的甲醇溶解后(甲醇采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶)，加入1.5kg烟台江友硅胶拌样，置阴凉处自然风干后上样；然后用乙酸乙酯:甲醇:水＝20:1:0.1进行等度洗脱目标物质，根据HPLC检测收集洗脱液，得到HPLC 90％的目标流份，45℃下避光浓缩至400ml；

D.中压制备纯化：将步骤C中所得到的浓缩液上中压制备柱(Daiso RPS-C18，40-60um，1.8-2.0kg填料，柱尺寸460×100mm，采购于苏州汇通色谱分离纯化有限公司)，流速：50mL/min，用14％乙腈水等度洗脱(乙腈采购于上海星可高纯溶剂有限公司，30L/桶)，根据HPLC检测收集洗脱液，得到HPLC 98.5％左右的目标流份；45℃下避光浓缩至无乙腈味，冷冻干燥得到粉末；

E.高压制备纯化：将步骤D中所得到HPLC 98.5％左右的苦番红花素粉末用40％甲醇水溶解，采用LC-20AP制备型液湘制备(采购于岛津株式会社)，色谱柱采用YMC-TriartC18，250*50mm、7um，流速为120ml/min，检测波长为254nm，，50％甲醇水等度洗脱，除去色素及少量的前后杂，收集目标流份，45℃下避光浓缩，冷冻干燥，获得目标物40g。

采用以下的HPLC色谱条件对实施例1和比较例1的苦番红花素对照品，

供试品溶液取2.5mg样品，加1mL水溶液溶解，配成2.5mg/mL样品，现配现测。

流动相组成：A-水，B-乙腈

时间(min)	流速(mL/min)	％B
			0.0	1.000	13.0
22.0	1.000	13.0
			28.0	1.000	100％

从HPLC图谱读出的结果，可知本发明实施例1获得的目标物纯度为100％，比较例1的纯度为98.25％。此处的浓度的绝对值受仪器分辨率限制，并不完全准确，但是实施例与比较例的相对差别，说明了本发明提取方法的优异技术效果。

参考图3和图4，获得的苦番红花素NMR图谱归属数据如下：

¹H-NMR

¹³C-NMR

本发明获得的苦番红花素的质谱信息参照图5。

仪器：Sciex TripleTOF 4600 LC/MS

检测模式：正离子模式ESI源参数如下：

上述披露的各技术特征并不限于已披露的与其它特征的组合，本领域技术人员还可根据发明之目的进行各技术特征之间的其它组合，以实现本发明之目的，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种苦番红花素的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

正相色谱纯化工序：将含有苦番红花素的原料提取物粗品上样至正相色谱柱，用包含乙酸乙酯、甲醇、水的洗脱液进行洗脱，乙酸乙酯:甲醇:水的比例为15～25: 1～2: 0.05～0.15，根据HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到第一粗品浓缩液；

中压反相色谱纯化工序：将第一粗品浓缩液上样至中压反相色谱，用浓度12～16%的乙腈水溶液以压力为0.05～0.5Mpa进行洗脱，根据HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩得到半成品浓缩液，将浓缩液冷冻干燥得到苦番红花素半成品粉末；

高压反相色谱纯化工序，将苦番红花素半成品粉末用甲醇水溶液溶解上样至高压反相色谱柱，以5～15.0Mpa压力用40～60%甲醇水溶液洗脱，除去色素及少量的前后杂，收集含有目标物的洗脱液；

目标物富集回收工序，将高压反相色谱纯化工序中得到的含有目标物的洗脱液在45℃下避光浓缩至无醇味，将其全部用上样至中压反相色谱柱，以压力为0.05～0.5Mpa用乙腈或者甲醇洗脱，得到目标流份，在50℃以下的温度下避光浓缩、冷冻干燥，得到苦番红花素对照品，所述含有苦番红花素的原料提取物粗品的制备方法如下，

将原料西红花粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液，在50℃以下的温度下避光浓缩，再进行冷冻干燥, 正相色谱纯化工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶,中压反相色谱柱的填料为粒径为40-60um的十八烷基硅烷键合硅胶，高压反相色谱柱的填料为粒径为5-10um的十八烷基硅烷键合硅胶,醇系的水溶液为60%～85%的甲醇水溶液或者60%～85%的乙醇水溶液浸泡,目标物富集回收工序：用90～98%的乙腈洗脱，或者用90～98%的甲醇洗脱。

2.根据权利要求1所述的苦番红花素的对照品的制备方法，其特征在于，正相色谱纯化工序中，所述乙酸乙酯:甲醇:水的混合比例为15～22:1～1.5:0.05～0.15。

3.根据权利要求1所述的苦番红花素的对照品的制备方法，其特征在于，中压反相色谱纯化工序中，用浓度13～15%的乙腈水溶液以压力为0.1～0.3Mpa进行洗脱。

4.根据权利要求1所述的苦番红花素的对照品的制备方法，其特征在于，高压反相色谱纯化工序中，以8～10Mpa压力用45～55%甲醇水溶液洗脱。

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