CN104312935A - 一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。本发明通过在酵母中表达肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)，实现葡萄糖醛酸的生成途径，同时表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶(Udh)，成功构建了葡萄糖二酸的合成途径。其中，重组毕赤酵母在YPD发酵培养基中生成葡萄糖二酸40mg/L，在YPD-MI(YPD培养基中加入60mM肌醇)发酵培养基中生成葡萄糖二酸60mg/L。本发明提出的重组酵母发酵生成葡萄糖二酸的方法，具有广阔的发展前景，为生物合成葡萄糖二酸奠定了基础。

Description

一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法

技术领域

本发明涉及一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

葡萄糖二酸(glucuric acid，saccharic acid)又名葡萄糖质酸，是葡萄糖的醛基及C-6上羟基均被氧化成羧酸(如硝酸作用)而形成的糖酸。熔点125～126℃，溶于水和乙醇，稍溶于***，是β葡萄糖醛酸酶的抑制剂。

葡萄糖二酸及其衍生物在一些植物及哺乳动物中均有发现，特别是在一些十字花科蔬菜、草莓和柑橘类水果中含量丰富。葡萄糖二酸具有重要的生物功能，被美国能源部确定为“最有价值的生物炼制产品”。它可以降低胆固醇、用于癌症的治疗，同时其钙盐也是一种食品添加剂。葡萄糖二酸在水溶液中不稳定，易转变为葡萄糖二酸内酯的形式，二者在水溶液处于互变平衡状态。葡萄糖二酸1,4内酯也是一种重要的功能产品，它可使肝素、透明质酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破坏大大减少，帮助身体有效的排除毒素，并能够缓解关节炎、痛风、气喘和相关组织功能下降所引起的其他不适。

葡萄糖二酸由于对人体无毒，并且其结构域单糖结构相似，可以通过糖转运***进入细胞内部，能够在病灶部位聚集，并少量被缺血组织快速吸收，因此可以作为显像剂应用于心肌梗死和肿瘤的研究中。同时，葡萄糖二酸也可用作聚合物的组成部分，比如新型尼龙和超支化聚酯。葡萄糖二酸已成功利用在生产羟化尼龙上，这种材料是一种环保型的可生物降解的新材料。

目前葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法，如硝酸氧化、以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)为催化剂的共催化氧化等。硝酸氧化法主要是以葡萄糖为原料，通过硝酸氧化为葡萄糖二酸及其小分子物质。此种方法生成的产物较多，副产物复杂，同时产生大量气体，其反应废液对环境产生污染，因此逐渐被新方法取代。

2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)氧化体系是近年来发展起来的一种新的方法，TEMPO属于亚硝酰自由基，是一种稳定的自由基，其氮氧自由基通过不成对电子在氮氧之间移动形成了共振结构。TEMPO氧化体系对糖类伯羟基的氧化选择性高、反应条件温和、能避免降解。由于葡萄糖二酸的水溶液易形成葡萄糖1，4-内酯及葡萄糖6,3-内酯，所以在制备过程中以制得单钾盐为最终产物。此方法所用TEMPO可回收利用，产物纯化容易，便于操作，是目前常用的一种方法。但是由于反应过程中的反应温度及pH不易控制，因此仍然需要改进。

由于化学法所存在的局限较多，通过生物法来制备葡萄糖二酸越来越受到研究者的关注。葡萄糖二酸是存在于哺乳动物的代谢途径中，它与抗坏血酸是葡萄糖醛酸代谢途径的终产物。然而，从D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。Prather等通过重组大肠杆菌，分别从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和小鼠体内获取肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)，从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)获得醛酸脱氢酶基因，克隆到大肠杆菌中，实现了葡萄糖二酸的生物合成。

酵母是单细胞低等真核生物，既有原核生物细胞容易培养、生长速度快、操作简单，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。由于它培养时营养要求低、生长快、培养基廉价、可进行高密度发酵培养，因此是一种可用于生产目标生物产品的优良宿主。

目前尚未发现有通过重组酵母来发酵生产葡萄糖二酸的报道，原始的酵母菌株并不能生成葡萄糖二酸，鉴于此，本发明中构建的新型重组工程菌，在微生物发酵生产葡萄糖二酸方面，提供了新的方法与思路。

发明内容

本发明通过将肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)及醛酸脱氢酶基因(Udh)克隆表达至酵母菌株中，构建重组酵母，该重组酵母菌能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡萄糖二酸。

本发明提供一种重组酵母菌，该重组酵母菌同时表达肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh。

所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1来源于以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)。

所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1，在本发明的一种实施方式中，来源于Pichia pastorisGS115。

所述肌醇加氧酶基因MIOX来源于以下任意一种：小鼠(mouse)、毕赤酵母(Pichia pastorisGS115)、白假丝酵母(Candida albicans)。

所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本发明的一种实施方式中，来源于Pichia pastorisGS115。

所述醛酸脱氢酶基因Udh来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的序列。

所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列分别是SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的序列。

所述醛酸脱氢酶基因Udh前有GAP启动子。

所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1前有毕赤酵母组成型启动子TEF。

所述重组酵母菌的出发宿主菌为以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、毕赤酵母(Pichia pastoris)。

所述肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇加氧酶基因及醛酸脱氢酶基因为整合表达。

本发明还提供一种所述重组酵母菌的构建方法，包括：(1)在Udh基因前融合GAP启动子构成融合片段，连接到表达载体后转化到酵母宿主菌中，得到重组菌；(2)将MIOX基因、组成型启动子TEF、Ino1基因按顺序融合，连接到表达载体上再转化到步骤1得到的重组菌中。

所述构建方法，具体是：(1)Pichia pastoris GS115/Udh的构建：以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组为模板扩增Udh基因，以pGAPZB质粒为模板扩增GAP启动子，将GAP启动子与Udh基因融合成上下游分别引入了酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组质粒，命名为pPIC9K-GAP-Udh，将重组质粒转化到宿主Pichia pastoris GS115中即得到Pichia pastoris GS115/Udh；(2)以Pichiapastoris GS115基因组为模板扩增MIOX基因、Ino1基因，以pGAPZB质粒为模板扩增毕赤酵母组成型启动子TEF，将MIOX、TEF、Ino1按顺序融合，并在融合片段两端添加XhoI，XbaI酶切位点，将融合片段连接到表达载体pGAPZB后，用BspHI线性化后电转入步骤1构建的表达宿主Pichia pastoris GS115/Udh中，筛选正确的重组酵母菌，命名为Pichiapastoris GS115/Udh-MTI。

本发明还提供一种利用所述重组酵母菌生产葡萄糖二酸的方法，其特征在于，是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。

所述方法具体是将重组酵母菌种子液以5％-10％的接种量接种到发酵培养基中，与25℃-30℃，180rpm-220rpm，培养24h—96h。

所述发酵培养基，在本发明的一种实施方式中，其碳源为葡萄糖和/或肌醇。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是将种子培养液按10％接种量接种到含有50ml发酵培养基的量为500ml的摇瓶中，温度为30℃，摇床转速200rpm，培养60小时。

本发明提供了一种通过重组酵母发酵生成葡萄糖二酸的方法，重组毕赤酵母在YPD培养基中产生葡萄糖二酸40mg/L,在YPD-MI(在YPD培养基中添加60mM肌醇)的培养基中，产生葡萄糖二酸60mg/L,对照毕赤酵母Pichia pastorisGS115中，没有检测到葡萄糖二酸。本发明所用的来源于毕赤酵母中的肌醇加氧酶基因与现有报道的来源于小鼠的MIOX氨基酸差异较大，并且目前没有来源于毕赤酵母中MIOX基因能够将肌醇转化为醛酸的相关报道。重组酵母合成葡萄糖二酸，还具有培养时营养要求低、生长快、培养基廉价、遗传稳定、表达水平高、可高密度发酵等许多优点。本发明采用代谢工程的策略，改造微生物菌株来合成目的产物葡萄糖二酸，为生物法高效生产葡萄糖二酸打下了坚实的基础。

附图说明

图1：重组毕赤酵母摇瓶发酵产葡萄糖二酸；1为对照菌株Pichia pastorisGS115，2为重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115/Udh-MTI在YPD培养基中培养结果，3为重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115/Udh-MTI在YPD-MI中培养结果；

图2：LC-MS检测发酵液中葡萄糖二酸的结果；A为葡萄糖二酸标样，B为重组毕赤酵母发酵液。

具体实施方式

葡萄糖二酸的检测：液质联用(LC-MS)，仪器岛津离子阱飞行时间质谱仪LCMS-IT-TOF。葡萄糖二酸标样的配制：准确称取10mg葡萄糖二酸钙粉末溶于20％甲酸中，将溶解后的溶液转移至100ml容量瓶中定容，其浓度为100mg/L。再用去离子水分别稀释至50、20、10、5和1mg/L。

样品制备：1ml发酵液在8000rpm下离心10min，取上清经0.22um滤膜过滤，滤液供液相质谱分析。

分析条件：

流动相：A：1mM甲酸铵+0.01％甲酸+水；B：1mM甲酸铵+乙腈

洗脱程序：0-12min30％B；12-30min30％-65％；30-31min65％-95％；31-35min95％

35-36min95％-30％B；36-40min30％

色谱柱：Shim-packVP-ODS(150L×2.0)

流速：0.15ml/min进样量：5ul

离子化模式：电喷雾负离子模式

雾化气流速：1.5L/min

CDL温度：200℃HB温度：200℃

扫描范围：MS1，m/z150-300

实施例1 重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115/Udh的构建

以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida KT2440)基因组为模板，udh-F(序列如SEQ ID NO.7所示)、udh-R(序列如SEQ ID NO.8所示)为引物扩增Udh基因，同时以pGAPZB质粒为模板，G-F(序列如SEQ ID NO.9所示)、G-R(序列如SEQ ID NO.10所示)为引物扩增GAP启动子。使用融合PCR方法，将GAP启动子与Udh基因融合，通过引物在融合片段上下游分别引入酶切位点SacI和NotI。通过对融合片段双酶切，连接至具有相应切口的表达载体pPIC9K上，转化至E.coliJM109中，在确保阅读框正确的前提下鉴定出重组表达质粒pPIC9K-GAP-Udh，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经SalI线性化后电转入表达宿主Pichia pastoris GS115中，重组克隆子经PCR验证正确，命名为Pichia pastorisGS115/Udh。

实施例2 重组菌Pichia pastoris GS115/Udh-MTI的构建

以Pichia pastoris GS115基因组为模板，用引物M-F(序列如SEQ ID NO.11所示)、M-R(序列如SEQ ID NO.12所示)扩增MIOX基因，用引物I-F(序列如SEQ ID NO.13所示)、I-R(序列如SEQ ID NO.14所示)扩增Ino1基因。同时以pGAPZB质粒为模板，用引物T-F(序列如SEQ ID NO.15所示)、T-R(序列如SEQ ID NO.16所示)扩增毕赤酵母组成型启动子TEF。将获得的MIOX、TEF、Ino1基因按顺序融合，通过设计引物，在融合片段两端添加XhoI，XbaI两个酶切位点。经双酶切，连接至具有相应切口的表达载体pGAPZB上，转化E.coli TOP10中，在确保阅读框正确的前提下，鉴定出重组表达质粒pGAPZB-MTI，经测序比对，序列正确。重组质粒经BspHI线性化后电转入表达宿主Pichia pastoris GS115/Udh中，重组克隆子经PCR验证正确，命名为Pichia pastoris GS115/Udh-MTI。

表1为实施例1、2中用到的引物。

表1 引物

实施例3 重组毕赤酵母发酵生产葡萄糖二酸

将重组菌Pichia pastoris GS115/Udh-MTI进行发酵培养。单克隆接种于25ml的YPD培养基(酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L),30℃、200rpm培养24h。按10％接种量接种至50ml(摇瓶容量为500ml)发酵培养基中发酵，培养60小时。发酵培养基分为YPD培养基及YPD-MI培养基(YPD培养基中加入60mM肌醇)。培养结束后，取1ml发酵液在8000rpm下离心10min，取上清经0.22um滤膜过滤，通过LC-MS检测产物。图2为LC-MS检测发酵液中葡萄糖二酸的结果，其中A为葡萄糖二酸标样、B为重组毕赤酵母发酵液。由标样可以看出葡萄糖二酸的[M-1]⁺为209.02，在重组菌株发酵液中可以检测到具有相同分子量(m/z)的葡萄糖二酸。

实施例4 比较重组毕赤酵母在不同发酵培养基中生成葡萄糖二酸的情况

在YPD发酵培养基中与YPD-MI培养基(YPD培养基中加入60mM肌醇)中，发酵重组毕赤酵母，培养60小时后，检测产物，结果如图1所示，对照菌株Pichia pastoris GS115不产葡萄糖二酸，重组菌Pichia pastoris GS115/Udh-MTI在YPD培养基中生成葡萄糖二酸40mg/L,在YPD-MI培养基中生成葡萄糖二酸60mg/L.在培养基中添加肌醇有利于代谢途径关键酶MIOX基因的表达和活性，同时增加了途径中间产物肌醇的含量，因此有利于葡萄糖二酸的生成。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种重组酵母菌，其特征在于，所述重组酵母菌同时表达肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh。

2.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1来源于以下任意一种：酿酒酵母、毕赤酵母、闪烁古生球菌；所述肌醇加氧酶基因MIOX来源于以下任意一种：小鼠、毕赤酵母、白假丝酵母；所述醛酸脱氢酶基因Udh来源于恶臭假单胞菌。

3.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示的序列。

4.根据权利要求1或3所述的重组酵母菌，其特征在于，所述重组酵母菌的出发宿主菌为以下任意一种：酿酒酵母、解脂假丝酵母、毕赤酵母。

5.根据权利要求1或3所述的重组酵母菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇加氧酶基因及醛酸脱氢酶基因为整合表达。

6.一种权利要求1或3所述重组酵母菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在Udh基因前融合GAP启动子构成融合片段，连接到表达载体后转化到酵母宿主菌中，得到重组菌；(2)将MIOX基因、组成型启动子TEF、Ino1基因按顺序融合，连接到表达载体上再转化到步骤1得到的重组菌中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：(1)Pichia pastorisGS115/Udh的构建：以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组为模板扩增Udh基因，以pGAPZB质粒为模板扩增GAP启动子，将GAP启动子与Udh基因融合成上下游分别引入了酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组质粒，命名为pPIC9K-GAP-Udh，将重组质粒转化到宿主Pichia pastorisGS115中即得到Pichiapastoris GS115/Udh；(2)以Pichia pastoris GS115基因组为模板扩增MIOX基因、Ino1基因，以pGAPZB质粒为模板扩增毕赤酵母组成型启动子TEF，将MIOX、TEF、Ino1按顺序融合，并在融合片段两端添加XhoI，XbaI酶切位点，将融合片段连接到表达载体pGAPZB后，用BspHI线性化后电转入步骤1构建的表达宿主Pichia pastoris GS115/Udh中，筛选正确的重组酵母菌，命名为Pichia pastorisGS115/Udh-MTI。

8.一种利用权利要求1所述重组酵母菌生产葡萄糖二酸的方法，其特征在于，是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法具体是将重组酵母菌种子液以5％-10％的接种量接种到发酵培养基中，与25℃-30℃，180rpm-220rpm，培养24h—96h。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖和/或肌醇。