CN103484417B - 一种提高生产2-klg发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用 - Google Patents

一种提高生产2-klg发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高生产2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用，通过基因工程技术，将来源于G.oxydans的pqqA及pqqABCDE基因，分别表达于本实验室构建的由山梨醇生产2-KLG的G.oxydans一步工程菌中，解除小菌对伴生菌依赖的问题，实现了从D-山梨醇到2-KLG的直接转化，简化了维生素C生产工艺，为了进一步提高2-KLG的产量，将PQQ合成的关键基因pqqA及基因簇pqqABCDE分别表达于G.oxydans一步工程菌中，2-KLG的产量最高可达51.8g/L，较未表达PQQ的一步工程菌提高了60％。

Description

一种提高生产2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)工程菌，特别是一种通过调节辅酶代谢提高G.oxydans一步工程菌生产维生素C前体2-KLG产量的G.oxydans工程菌，属于遗传工程领域。
背景技术
维生素C(Vitamin C，VC)，又称为抗坏血酸(Ascorbic acid)，是一种人体必需的维生素和抗氧化剂，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等工业。目前国内维生素C工业化生产采用二步发酵法，二步发酵法生产维生素C的第二步发酵过程，即将D-山梨糖转化2-KLG的过程，是由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)组成的混菌发酵***实现的。K.vulgare是革兰氏阴性菌，具有将D-山梨糖转化为2-KLG的相关酶系，但其单独培养时生长极其微弱，几乎不积累2-KLG。B.megaterium是产芽孢的革兰氏阳性菌，不直接参与相关的酶催化过程。B.megaterium能显著促进K.vulgare的生长和2-KLG积累。如果将B.megaterium从发酵体系中移除，K.vulgare的生长速率会显著下降，并几乎完全失去合成2-KLG的能力。
虽然经过多年来在工业生产中的实践，利用混菌体系发酵生产维生素C的技术已经较为成熟，但是混菌体系导致的一系列的问题仍然给维生素C工业的发展带来诸多限制：(1)菌种选育困难。菌种选育通常是以单菌的某些表型作为参照来进行筛选的，而针对混菌发酵体系的操作到目前为止尚未找到合适的方法。(2)代谢工程操作难以实施。由于K.vulgare单菌生长非常困难，导致目前尚无合适的方法得到目标转化子。(3)生产工艺复杂性增加。在实际生产过程中，无法对混菌体系中两菌比例进行快速检测，而这一比例又对2-KLG生产有显著影响。(4)噬菌体污染问题。B.megaterium广泛存在于土壤中，对多种噬菌体均较为敏感。由于噬菌体问题导致的倒罐是维生素C生产过程中一个难以忽视的问题。本实验室通过基因工程手段将维生素C两步发酵相关基因转化到G.oxydans中构建得到一步发酵菌株，实现由山梨醇经单菌一步发酵生成2-KLG，解除了小菌对伴生菌依赖的问题，简化了维生素C生产工艺。参与代谢山梨醇生成2-KLG的3个关键酶均以吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)作为辅酶，调节辅酶代谢有望进一步提高2-KLG的产量。
采用辅酶代谢工程改造G.oxydans一步菌生产维生素C合成前体2-KLG国内未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种2-KLG产量得到提高的的G.oxydans一步工程菌。
所述工程菌含有pqqA、pqqABCDE基因，所述G.oxydans一步菌中表达质粒pGUC-tufB-sdh-GS-sndh。
所述pqqA、pqqABCDE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示。
所述pqqA、pqqABCDE基因克隆于本实验室构建的质粒pGUC1上。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种2-KLG产量提高的G.oxydans基因工程菌的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：
1)根据本实验室对G.oxydans WSH-003的全基因组测序结果中注释的pqqA、pqqABCDE基因序列设计引物进行克隆；
2)将基因与载体连接得到重组表达载体；
3)将得到的重组表达载体转化G.oxydans后得到重组菌株。
下面是本发明技术方案的具体描述：
质粒及重组菌的构建
将本实验室对K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh通过连接肽GGGGS融合后连接到pMD19-T测序，同时将来源于G.oxydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.coli-G.oxydans穿梭质粒载体pGUC1，得到重组质粒载体pGUC-tufB-sdh-GS-sndh。再将K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的pqqA及pqqABCDE，分别获得基因，连接到克隆载体pMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到本实验室构建的G.oxydans一步菌中的质粒pGUC-tufB-sdh-GS-sndh上，构建得到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE，将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109，菌落PCR验证阳性转化子(分别出现81bp及3137bp的条带)；再将来源于G.oxydans WSH-003的tufB启动子序列扩增后克隆到pMD19-T测序，获得正确的转化子后双酶切连接到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE，构建得到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-tufB-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-tufB-pqqABCDE，转化E.coliJM109后菌落PCR验证阳性转化子(出现490bp的条带)。再通过三亲本杂交的方法将重组表达载体转移至G.oxydans WSH-003中。
重组菌的种子培养及发酵
种子培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1.0，pH 4.8～5.1，琼脂20（固体培养基），121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
发酵培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1.2，氯化钙0.2，初始pH 5.1～5.4，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
培养条件：从固体平板上刮取几环菌体接种于装有50mL液体培养基（加入终浓度75μg/mL氨苄青霉素）的500mL双刺摇瓶中，30℃旋转式摇床200r/min振荡培养至对数生长期(30h左右)，按15％(v/v)接种量转接至终浓度75μg/mL氨苄青霉素的新鲜培养基，再培养至对数生长期，按15％(v/v)接种量转接发酵培养基，30℃，200r/min，发酵168h。
山梨醇、2-KLG含量测定：液相色谱（LC）
发酵样品用流动相十倍稀释，0.45μm滤膜过滤。Agilent 1100system,RioRad公司AminexHPX-87H色谱柱；流动相：2.75μmol/L浓硫酸；柱温：35℃；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：示差折光检测器。
本发明通过基因工程改造，来源于G.oxydans的pqqA及pqqABCDE基因，分别表达于本实验室构建的由山梨醇生产2-KLG的G.oxydans一步工程菌中，2-KLG的产量分别提高到38.4g/L及39.2g/L，较未表达PQQ的一步工程菌提高了21％；同时含有pqqA及pqqABCDE的G.oxydans一步工程菌中，2-KLG的产量可提高到51.8g/L，较未表达PQQ的一步工程菌提高了60％。
具体实施方式
实施例1 表达载体的构建
将本实验室对K.vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh通过连接肽GGGGS融合后连接到pMD19-T测序，同时将来源于G.oxydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.coli-G.oxydans穿梭质粒载体pGUC1，得到重组质粒载体pGUC-tufB-sdh-GS-sndh。再根据本实验室对K.vulgareWSH-001的全基因组测序结果中注释的pqqA及pqqABCDE基因设计引物进行扩增，分别连接到克隆载体pMD19-T后进行测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到本实验室构建的G.oxydans一步菌中的质粒pGUC-tufB-sdh-GS-sndh，构建得到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA及pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE，将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109，菌落PCR验证阳性转化子(分别出现81bp及3137bp的条带)；再将本实验室对G.oxydans WSH-003的全基因组测序结果中注释的tufB启动子序列扩增后克隆到pMD19-T测序，获得正确的转化子后双酶切连接到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE，构建得到表达载体pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-tufB-pqqA及pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-tufB-pqqABCDE。
实施例2 G.oxydans工程菌的构建
将构建好的表达载体转化到E.coli JM109，涂布到含有氨苄青霉素的LB培养基上(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加20g/L琼脂，121℃灭菌15min)，挑取转化后平板上的转化子进行PCR验证，再通过三亲本杂交的方法转移至G.oxydans WSH-003中，得到3株G.oxydans工程菌。
实施例3 发酵生产2-KLG
种子培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1，pH 4.8～5.1，琼脂20（固体培养基），121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
发酵培养基(g/L)：山梨醇15，酵母膏1.2，氯化钙0.2，初始pH 5.1～5.4，121℃灭菌15min，氨苄青霉素终浓度100μg/mL。
培养条件：从固体平板上刮取几环菌体接种于装有50mL液体培养基（加入终浓度75μg/mL氨苄青霉素）的500mL双刺摇瓶中，30℃旋转式摇床200r/min振荡培养至对数生长期(30h左右)，按15％(v/v)接种量转接至终浓度75μg/mL氨苄青霉素的新鲜培养基，再培养至对数生长期，按15％(v/v)接种量转接发酵培养基，30℃，200r/min，发酵168h。2-KLG产量分别达到38.4g/L（pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-tufB-pqqA）、39.2g/L（pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-tufB-pqqABCDE）及51.8g/L（pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-tufB-pqqA+pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-tufB-pqqABCDE）。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一种提高2-KLG发酵产量的葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)工程菌，其特征在于将pqqABCDE，或pqqA及pqqABCDE同时表达于G. oxydans一步工程菌中，所述G. oxydans一步菌中表达质粒pGUC-tufB-sdh-GS-sndh，工程菌的构建过程如下：
对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh及sndh通过连接肽GGGGS融合后连接到pMD19-T测序，同时将来源于G. oxydans的强启动子tufB进行扩增连接到克隆载体pMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到E.coli-G.oxydans穿梭质粒载体pGUC1，得到重组质粒载体pGUC-tufB-sdh-GS-sndh；
再将K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的pqqA及pqqABCDE，分别获得基因，连接到克隆载体pMD19-T测序，获得正确的转化子后进行双酶切连接到质粒pGUC-tufB-sdh-GS-sndh上，构建得到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE，将构建好的重组表达载体转化E.coli JM109，菌落PCR验证阳性转化子；再将来源于G. oxydans WSH-003的tufB启动子序列扩增后克隆到pMD19-T测序，获得正确的转化子后双酶切连接到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-pqqABCDE，构建得到pGUC-tufB-sdh-GS-sndh-tufB-pqqA、pGUC-tufB-sdh-GS2-sndh-tufB-pqqABCDE，转化E.coli JM109后菌落PCR验证阳性转化子，再通过三亲本杂交的方法将重组表达载体转移至G. oxydans WSH-003中；
所述pqqA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1，所述pqqABCDE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述基因工程菌在生产2-KLG中的应用。
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