CN109321590B - 利用乙酸生产l-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用乙酸生产L‑乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明公开的利用乙酸生产L‑乳酸的基因工程菌,通过对受体菌进行如下改造得到:敲除受体菌的poxB基因、pflB基因、aceEF基因、ldhA基因、lldD基因;增加受体菌中acs基因、pta基因、ackA基因、aceA基因、aceK基因、aceB基因、maeA基因、maeB基因和ldh2基因编码蛋白质的含量。本发明获得的工程菌,在摇瓶培养中利用乙酸获得的L‑乳酸产量能达到理想水平,避免了葡萄糖等碳源的使用,有助于降低L‑乳酸发酵的原料成本,具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术、基因工程和发酵工程领域,具体涉及一种利用乙酸生产L-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
人类社会每年消耗大量的石油和煤炭等化石资源,由此排放大量的温室气体引发气候变化的担忧。因此,可再生生物质资源的开发利用成为当前科学界和工业界关注的热点之一。目前,来源于农业与种植业的葡萄糖、木糖、淀粉和纤维素等是发酵工业中微生物普遍利用的碳源和能源物质。我国是一个生物发酵产业大国,许多产品的产量位居世界第一,每年消耗了大量的粮食资源。因此,粮食短缺和农副产品价格持续上涨,已经成为制约生物发酵产业发展的关键因素。为解决“与人争粮、与粮争地”的难题,迫切需要开发来源广泛、价格低廉的新型发酵碳源。甲醇、乙酸和合成气等逐渐成为工业生物技术领域中的研究热点。
乙酸又名醋酸,是一种简单的二碳羧酸,也是食醋的主要成分。乙酸在自然界中分布广泛,主要是以酯类存在于水果和植物油中。在动物的组织内、***物和血液中,乙酸以游离酸的形式存在。许多微生物可以通过厌氧发酵将有机物转化为乙酸。能够利用乙酸作为碳源生长的微生物有细菌、真菌和酵母等,例如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌等。
乳酸又名2-羟基丙酸,是一种重要的有机酸。乳酸分子中有一个手性碳原子,有D-乳酸和L-乳酸两种构型。与D-乳酸相比,L-乳酸能够被人体降解,被广泛应用于食品、饮料、医药和化妆品等领域。此外,乳酸能够通过化学法聚合为聚乳酸,可作为生物可降解材料使用。2015年,全球乳酸产量约为50万吨,市场需求以L-乳酸为主,用于食品和饮料领域的占比接近50%,用于聚乳酸领域的占比超过30%。
乳酸的常见制备方法有化学法和微生物发酵法。化学法生产乳酸的主要途径包括乳腈法和丙烯腈法,以乳腈法为主。该方法以乙醛与氢氰酸为原料,经碱性催化合成乳腈,再经过蒸馏纯化并用浓酸水解产生乳酸,最后通过酯化精制获得不同等级的产品。化学法利用的原料乙醛和氢氰酸具有较强的毒性,而且产物是D-乳酸和L-乳酸的混合物,由于D-乳酸在人体内的代谢问题,难以应用到食品和饮料等领域。
微生物发酵法具有生产成本低、原料来源广、产物光学纯度高等优点,是工业上生产乳酸的主要方法。发酵法使用的菌种有乳杆菌、芽孢杆菌和米根霉等。虽然利用纤维素、木薯、糖蜜和菊芋等非粮廉价原料发酵生产乳酸已有若干研究,但是玉米淀粉仍是目前大规模发酵中使用的主要原料,由此导致L-乳酸市场价格偏高,限制了其在生物可降解材料和其它领域中的广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何利用乙酸这种潜在的大宗发酵碳源来制备L-乳酸。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了重组菌的构建方法,所述方法包括对受体菌进行下述A1-A14的改造,得到所述重组菌;
A1、敲除所述受体菌的丙酮酸氧化酶基因(poxB基因,GeneBank号:NC_000913.3,Gene ID:946132)或抑制所述poxB基因的表达或抑制所述poxB基因编码的蛋白质的活性;
A2、敲除所述受体菌的丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB基因,GeneBank号:NC_000913.3,Gene ID:945514)或抑制所述pflB基因的表达或抑制所述pflB基因编码的蛋白质的活性;
A3、敲除所述受体菌的丙酮酸脱氢酶基因(aceE基因和aceF基因,记为aceEF基因;aceE基因,GeneBank号:NC_000913.3,Gene ID:944834;aceF基因,GeneBank号:NC_000913.3,Gene ID:944794)或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性;
A4、敲除所述受体菌的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA基因,GeneBank号:NC_000913.3,Gene ID:946315)或抑制所述ldhA基因的表达或抑制所述ldhA基因编码的蛋白质的活性;
A5、敲除所述受体菌的L-乳酸脱氢酶基因(lldD基因,GeneBank号:NC_000913.3,Gene ID:948121)或抑制所述lldD基因的表达或抑制所述lldD基因编码的蛋白质的活性;
A6、增加所述受体菌中乙酰辅酶A合成酶基因(acs基因)编码蛋白质的含量或增强所述acs基因编码蛋白质的活性;
A7、增加所述受体菌中磷酸转乙酰酶基因(pta基因)编码蛋白质的含量或增强所述pta基因编码蛋白质的活性;
A8、增加所述受体菌中乙酸激酶基因(ackA基因)编码蛋白质的含量或增强所述ackA基因编码蛋白质的活性;
A9、增加所述受体菌中异柠檬酸裂解酶基因(aceA基因)编码蛋白质的含量或增强所述aceA基因编码蛋白质的活性;
A10、增加所述受体菌中异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶基因(aceK基因)编码蛋白质的含量或增强所述aceK基因编码蛋白质的活性;
A11、增加所述受体菌中苹果酸合成酶基因(aceB基因)编码蛋白质的含量或增强所述aceB基因编码蛋白质的活性;
A12、增加所述受体菌中NAD-依赖型苹果酸酶基因maeA基因编码蛋白质的含量或增强所述maeA基因编码蛋白质的活性;
A13、增加所述受体菌中NADP-依赖型苹果酸酶基因maeB基因编码蛋白质的含量或增强所述maeB基因编码蛋白质的活性;
A14、增加所述受体菌中L-乳酸脱氢酶基因(ldh2基因)编码蛋白质的含量或增强所述ldh2基因编码蛋白质的活性;
所述受体菌为含有所述poxB基因、所述pflB基因、所述aceEF基因、所述ldhA基因和所述lldD基因的细菌或真菌。
上述方法中,所述受体菌可为1)或2):
1)大肠杆菌;
2)大肠杆菌MG1655。
上述方法中,所述acs基因编码蛋白质为下述a1)或a2)的蛋白质:
a1)序列表中序列12所示的蛋白质;
a2)将序列表中序列12的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述ackA基因编码蛋白质为下述b1)或b2)的蛋白质:
b1)序列表中序列13所示的蛋白质;
b2)将序列表中序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述pta基因编码蛋白质为下述c1)或c2)的蛋白质:
c1)序列表中序列14所示的蛋白质;
c2)将序列表中序列14的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述aceA基因编码蛋白质为下述d1)或d2)的蛋白质:
d1)序列表中序列15所示的蛋白质;
d2)将序列表中序列15的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述aceK基因编码蛋白质为下述e1)或e2)的蛋白质:
e1)序列表中序列16所示的蛋白质;
e2)将序列表中序列16的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述aceB基因编码蛋白质为下述f1)或f2)的蛋白质:
f1)序列表中序列17所示的蛋白质;
f2)将序列表中序列17的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述maeA基因编码蛋白质为下述g1)或g2)的蛋白质:
g1)序列表中序列18所示的蛋白质;
g2)将序列表中序列18的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述maeB基因编码蛋白质为下述h1)或h2)的蛋白质:
h1)序列表中序列19所示的蛋白质;
h2)将序列表中序列19的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质;
和/或,所述ldh2基因编码蛋白质为下述i1)或i2)的蛋白质:
i1)序列表中序列20所示的蛋白质;
i2)将序列表中序列20的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述方法中,所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述方法中,A1通过向所述受体菌中导入含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A2通过向所述受体菌中导入含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A3通过向所述受体菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A4通过向所述受体菌中导入含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A5通过向所述受体菌中导入含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A6通过向所述受体菌中导入含有所述acs基因的acs基因表达盒实现;
和/或,A7通过向所述受体菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现;
和/或,A8通过向所述受体菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现;
和/或,A9通过向所述受体菌中导入含有所述aceA基因的aceA基因表达盒实现;
和/或,A10通过向所述受体菌中导入含有所述aceK基因的aceK基因表达盒实现;
和/或,A11通过向所述受体菌中导入含有所述aceB基因的aceB基因表达盒实现;
和/或,A12通过向所述受体菌中导入含有所述maeA基因的maeA基因表达盒实现;
和/或,A13通过向所述受体菌中导入含有所述maeB基因的maeB基因表达盒实现;
和/或,A14通过向所述受体菌中导入含有所述ldh2基因的ldh2基因表达盒实现。
向所述受体菌中导入各表达盒均可通过将含有相应表达盒的表达载体导入所述受体菌中实现。
所述表达载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为质粒pBBR1MCS-2或质粒pUC19。
上述方法中,各基因的敲除均可通过λ-red同源重组方式实现。
上述方法中,所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子;
所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子;
所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子;
所述含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子;
所述含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子;
和/或,所述acs基因表达盒、所述pta基因表达盒、所述ackA基因表达盒、所述aceA基因表达盒、所述aceK基因表达盒、所述aceB基因表达盒、所述maeA基因表达盒、所述maeB基因表达盒和所述ldh2基因表达盒中启动子为下述j1)或j2):
j1)序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子;
j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有启动子功能的DNA分子;
和/或,所述acs基因表达盒中所述acs基因为下述k1)或k2):
k1)序列表中序列1的第70-2028位所示的DNA分子;
k2)与k1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述pta基因表达盒中所述pta基因为下述l1)或l2):
l1)序列表中序列2的第1347-3491位所示的DNA分子;
l2)与l1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为下述m1)或m2):
m1)序列表中序列2的第70-1272位所示的DNA分子;
m2)与m1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述aceA基因表达盒中所述aceA基因为下述n1)或n2):
n1)序列表中序列3的第70-1374位所示的DNA分子;
n2)与n1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述aceK基因表达盒中所述aceK基因为下述o1)或o2):
o1)序列表中序列3的第1436-3172位所示的DNA分子;
o2)与o1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述aceB基因表达盒中所述aceB基因为下述p1)或p2):
p1)序列表中序列4的第70-1671位所示的DNA分子;
p2)与p1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述maeA基因表达盒中所述maeA基因为下述q1)或q2):
q1)序列表中序列5的第70-1767位所示的DNA分子;
q2)与q1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述maeB基因表达盒中所述maeB基因为下述r1)或r2):
r1)序列表中序列5的第1791-4070位所示的DNA分子;
r2)与r1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
和/或,所述ldh2基因表达盒中所述ldh2基因为下述s1)或s2):
s1)序列表中序列6的第70-1050位所示的DNA分子;
s2)与s1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且具有相同功能的DNA分子;
上述方法中,所述75%或75%以上同一性均可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
上述方法中,所述acs基因表达盒为序列表中序列1的第9-2028位所示的DNA分子;
所述pta基因表达盒和所述ackA基因表达盒为序列中序列2的第9-3491位所示的DNA分子;
所述aceA基因表达盒和所述aceK基因表达盒为序列表中序列3的第9-3172位所示的DNA分子;
所述aceB基因表达盒为序列表中序列4的第9-1671位所示的DNA分子;
所述maeA基因表达盒和所述maeB基因表达盒为序列表中序列5的第9-4070位所示的DNA分子;
所述ldh2基因表达盒为序列表中序列6的第9-1050位所示的DNA分子。
本发明还提供了利用所述方法制备的重组菌。
本发明还提供了一种成套试剂,所述成套试剂由所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段、所述含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段、所述acs基因表达盒、所述pta基因表达盒、所述ackA基因表达盒、所述aceA基因表达盒、所述aceK基因表达盒、所述aceB基因表达盒、所述maeA基因表达盒、所述maeB基因表达盒和所述ldh2基因表达盒组成。
所述成套试剂可用于生产L-乳酸和/或降解乙酸。
本发明还提供了所述成套试剂或所述重组菌的下述任一应用:
X1、生产L-乳酸;
X2、制备生产L-乳酸产品;
X3、降解乙酸;
X4、制备降解乙酸产品。
本发明还提供了L-乳酸的制备方法,所述方法包括:以乙酸为碳源,利用所述重组菌进行生物转化,制备得到L-乳酸。
其中,进行所述生物转化可在MM液体培养基中进行。
所述MM液体培养基的组成如下:每升培养基含8g乙酸、2g NH4Cl、5g(NH4)2SO4、6gKH2PO4、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl,1mL微量元素溶液,余量为水。
所述微量元素溶液的组成如下:每升微量元素溶液含3.6g FeCl2·4H2O、5gCaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.03g H3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1g thiamine-HCl,其余为0.5M HCl。
进行所述生物转化的条件可为:30-37℃瓶震荡培养24-72h(如37℃,48h)。摇瓶的转速可为50-200rpm。
本发明的有益效果:本发明通过在大肠杆菌中表达9个代谢途径相关的基因和敲除6个内源基因,获得了能够以乙酸为碳源,发酵获得L-乳酸的工程菌株,并且重组菌在摇瓶培养中的L-乳酸的产量能达到较高水平,避免了葡萄糖等碳源的使用,有助于降低L-乳酸发酵的原料成本,具有较好的应用前景。
附图说明
图1为pMCS-LA1载体图谱。
图2为pMCS-LA2载体图谱。
图3为pUC19-LA1载体图谱。
图4为pUC19-LA2载体图谱。
图5为pUC19-LA3载体图谱。
图6为pUC19-LA4载体图谱。
图7为pUC19-LA24载体图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。下述实施例中,如无特殊说明,序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸,末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶,均为NEB(New England Biolabs,http://www.neb-china.com/)公司产品;质粒提取和DNA片段回收所用的试剂盒,均为北京博迈德基因技术有限公司(http://www.biomed168.com/)产品;实施例中涉及的DNA合成和测序工作,由北京博迈德基因技术有限公司完成。
E.coli MG1655:来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC,The ColiGenetic Stock Center(http://cgsc2.biology.yale.edu/),编号CGSC#6300。
E.coli NEB 5-alpha:来源于NEB(New England Biolabs),货号C2987I。
质粒pKD13:来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC,The ColiGenetic Stock Center,编号CGSC#7633。
质粒pKD46:来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC,The ColiGenetic Stock Center,编号CGSC#7739。
质粒pCP20:来源于E.coli Genetic Resources at Yale CGSC,The ColiGenetic Stock Center,编号CGSC#7637。
质粒pBBR1MCS-2:公众可根据NCBI accession number U23751.1的序列自行提交基因合成公司获得,该质粒记载在如下文献中:Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistancecassettes,1995,Gene,166:175-176。
质粒pUC19:来源于NEB(New England Biolabs)公司,货号N3041S。
MM液体培养基的组成如下:每升培养基含8g乙酸、2g NH4Cl、5g(NH4)2SO4、6gKH2PO4、8g 3-吗啉丙磺酸、0.5g NaCl,1mL微量元素溶液,余量为水。
微量元素溶液的组成如下:每升微量元素溶液含3.6g FeCl2·4H2O、5g CaCl2·2H2O、1.3g MnCl2·2H2O、0.38g CuCl2·2H2O、0.5g CoCl2·6H2O、0.94g ZnCl2、0.03gH3BO3、0.4g Na2EDTA·2H2O、1g thiamine-HCl,其余为0.5M HCl。
实施例1、构建重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)
一、重组表达载体pMCS2-LA1和pMCS2-LA2的构建
1、人工合成序列表中序列1所示的DNA,含有acs表达盒,上游为SacI位点,下游为XbaI位点,其中第9-51位核苷酸为启动子序列,第70-2028位核苷酸为acs基因序列。
2、人工合成序列表中序列2所示的DNA,含有ackA和pta表达盒,上游为XbaI位点,下游为EcoRI位点,其中第9-51位核苷酸为启动子序列,第70-1272位核苷酸为ackA基因序列,第1347-3491位核苷酸为pta基因序列。
3、用SacI和XbaI双酶切序列1中合成的DNA序列,回收大小约为2022bp的DNA片段;用SacI和XbaI双酶切质粒pBBR1MCS-2,回收大小约为5124bp的DNA片段;将上述约2022bp和5124bp的两个DNA片段连接,得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中,并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基,37℃培养16h,得到转化子。提取转化子的质粒,用SacI和XbaI进行酶切验证,酶切产物大小约为2022bp和5124bp的质粒为阳性质粒,将此重组质粒命名为重组质粒pMCS-LA1。将重组质粒pMCS-LA1进行测序,结果表明:pMCS-LA1为将质粒pBBR1MCS-2的SacI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第9-2028位所示的acs表达盒得到的重组质粒。
4、用XbaI和EcoRI双酶切序列2中合成的DNA序列,回收大小约为3489bp的DNA片段;用XbaI和EcoRI双酶切质粒pMCS-LA1,回收大小约为7116bp的DNA分子;将上述约3489bp和7116bp的两个DNA片段连接,得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中,并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基,37℃培养16h,得到转化子。提取转化子的质粒,用XbaI和EcoRI进行酶切验证,酶切产物大小约为3489bp和7116bp的质粒为阳性质粒,将此重组质粒命名为重组质粒pMCS-LA2。将重组质粒pMCS-LA2进行测序,结果表明:pMCS-LA2为将质粒pMCS-LA1的XbaI和EcoRI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列2的第9-3491位所示的ackA和pta表达盒得到的重组质粒。
二、重组表达载体pUC19-LA1和pUC19-LA2的构建
1、人工合成序列表中序列3所示的DNA,含有aceA和aceK表达盒,上游为SacI位点,下游为SpeI和KpnI位点,其中第9-51位核苷酸为启动子序列,第70-1374位核苷酸为aceA基因序列,第1436-3172位核苷酸为aceK基因序列。
2、人工合成序列表中序列4所示的DNA,含有aceB表达盒,上游为SpeI位点,下游为XhoI和KpnI位点,其中第9-51位核苷酸为启动子序列,第70-1671位核苷酸为aceB基因序列。
3、用SacI和KpnI双酶切步骤1中合成的DNA序列,回收大小约为3179bp的DNA片段;用SacI和KpnI双酶切质粒pUC19,回收大小约为2680bp的DNA片段;将上述约3179bp和2680bp的两个DNA片段连接,得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养16h,得到转化子。提取转化子的质粒,用SacI和KpnI进行酶切验证,酶切产物大小约为3179bp和2680bp的质粒为阳性质粒,将此重组质粒命名为pUC19-LA1。将得到的重组质粒pUC19-LA1进行测序验证,结果表明:pUC19-LA1为将质粒pUC19的SacI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列3的第9-3181位所示的DNA序列得到的重组质粒,该重组质粒含有序列3的第9-3172位所示的aceA和aceK表达盒。
4、用SpeI和KpnI双酶切步骤2中合成的DNA序列,回收大小约为1682bp的DNA片段;用SpeI和KpnI双酶切质粒pUC19-LA1,回收大小约为5846bp的DNA片段;将上述约1682bp和5846bp的两个DNA片段连接,得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养16h,得到转化子。提取转化子的质粒,用SpeI和KpnI进行酶切验证,酶切产物大小约为1682bp和5846bp的质粒为阳性质粒,将此重组质粒命名为pUC19-LA2。将得到的重组质粒pUC19-LA2进行测序验证,结果表明:pUC19-LA2为将质粒pUC19-LA1的SpeI和KpnI的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列4的第9-1680位所示的DNA序列得到的重组质粒,该重组质粒含有序列4的第9-1671位所示的aceB表达盒。
三、重组表达载体pUC19-LA3的构建
1、人工合成序列表中序列5所示的DNA,含有maeA和maeB表达盒,上游为XhoI位点,下游为KpnI位点,其中第9-51位核苷酸为启动子序列,第70-1767位核苷酸为maeA基因序列,第1791-4070位核苷酸为maeB基因序列。
2、用XhoI和KpnI双酶切步骤1中合成的DNA序列,回收大小约为4072bp的DNA片段;用XhoI和KpnI双酶切质粒pUC19-LA2,回收大小约为7515bp的DNA片段;将上述约4072bp和7515bp的两个DNA片段连接,得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养16h,得到转化子。提取转化子的质粒,用XhoI和KpnI进行酶切验证,酶切产物大小约为4072bp和7515bp的质粒为阳性质粒,将此重组质粒命名为pUC19-LA3。将得到的重组质粒pUC19-LA3进行测序验证,结果表明:pUC19-LA3为将质粒pUC19-LA2的XhoI和KpnI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列5的第9-4070位所示的maeA和maeB表达盒得到的重组质粒。
四、重组表达载体pUC19-LA4的构建
1、人工合成序列表中序列6所示的DNA,含有ldh2表达盒,上游为KpnI位点,下游为XbaI位点,其中第9-51位核苷酸为启动子序列,第70-1050位核苷酸为ldh2基因序列。
2、用KpnI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列,回收大小约为1044bp的DNA片段;用KpnI和XbaI双酶切质粒pUC19-LA3,回收大小约为11576bp的DNA片段;将上述约1044bp和11576bp的两个DNA片段连接,得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB5-alpha中,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养16h,得到转化子。提取转化子的质粒,用KpnI和XbaI进行酶切验证,酶切产物大小约为1044bp和11576bp的质粒为阳性质粒,将此重组质粒命名为pUC19-LA4。将得到的重组质粒pUC19-LA4进行测序验证,结果表明:pUC19-LA4为将质粒pUC19-LA3的KpnI和XbaI的识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列6的第9-1050位所示的ldh2表达盒得到的重组质粒。
五、重组表达载体pUC19-LA24的构建
1、人工合成序列表中序列6所示的DNA,含有ldh2表达盒,上游为KpnI位点,下游为XbaI位点,其中第9-51位核苷酸为启动子序列,第70-1050位核苷酸为ldh2基因序列。
2、用KpnI和XbaI双酶切步骤1中合成的DNA序列,回收大小约为1044bp的DNA片段;用KpnI和XbaI双酶切质粒pUC19-LA2,回收大小约为7517bp的DNA片段;将上述1044bp和7517bp的两个DNA片段连接,得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养16h,得到转化子。提取转化子的质粒,用KpnI和XbaI进行酶切验证,酶切产物大小约为1044bp和7517bp的质粒为阳性质粒,将此重组质粒命名为pUC19-LA24。将得到的重组质粒pUC19-LA24进行测序验证,结果表明:pUC19-LA24为将质粒pUC19-LA2的KpnI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列6的第9-1050位所示的ldh2表达盒得到的重组质粒。
六、大肠杆菌E.coli LA5的构建
1、敲除poxB基因
1)合成poxB基因敲除所用的引物poxBF和poxBR,序列如下:
poxBF:
5’-ATGAAACAAACGGTTGCAGCTTATATCGCCAAAACACTCGAATCGGCAGGGGTGAAACGCGTGTAGGCTGGAGC TGCTTCG-3’;
poxBR:
5’-GGGCGTCGCGGTAATCTTCCAGCGCTTTATCCAGAAACTTGCGATCGGCTTTTTCTTCCAATTCCGGGGATCCG TCGACC-3’。
2)以质粒pKD13为模板,采用引物poxBF和poxBR进行PCR扩增得到1500bp左右的DNA片段,命名为poxB同源重组片段,琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。经过测序,poxB同源重组片段的核苷酸序列为序列8,其中,第1-60位为poxB基因上游同源臂,第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因,第1365-1424位为poxB基因下游同源臂。
3)利用电转化的方法将pKD46转化至受体菌株E.coli MG1655中,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,30℃培养24h,得到转化子,提质粒验证,获得含有pKD46的重组菌,记为E.coli MG1655(pKD46)。
4)将E.coli MG1655(pKD46)接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,30℃培养1h,加入***糖至终浓度5g/L,继续培养1.5h,接下来制备E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞,将步骤2)中获得的DNA片段转入E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞中,并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基,37℃培养24h,得到转化子。
5)利用菌落PCR的方法,以poxBF和poxBR为引物进行PCR,将PCR产物纯化之后测序,筛选正确的poxB基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆,记为E.coli MG1655poxB-K(pKD46)。
6)将E.coli MG1655poxB-K(pKD46)接种于LB液体培养基中,42℃培养传代三次,除去pKD46质粒,得到E.coli MG1655poxB-K;E.coli MG1655poxB-K是poxB基因被Kan基因替换了的E.coli MG1655。
7)将E.coli MG1655poxB-K接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养24h,转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养3h,制备E.coli MG1655poxB-K感受态细胞。
8)利用电转化的方法将质粒pCP20转化到E.coli MG1655poxB-K感受态细胞中,并涂布于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB固体培养基,30℃培养48h,得到转化子。利用菌落PCR的方法验证转化子,以poxBF和poxBR为引物,得到202bp片段的为阳性克隆。将该阳性克隆送去测序,其为敲除E.coli MG1655基因组上的poxB基因得到的菌,将该菌接种到LB液体培养基中,42℃传代三次,除去pCP20,将得到的菌株命名为突变体E.coli LA1。
2、敲除pflB基因
与上述步骤1的方法基本相同,不同的是如下:
pflB基因敲除引物序列如下:
pflBF:
5’-
ATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACAGCCTGGGAAGGTTTTACCAAAGGTGACTGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’;
pflBR:
5’
-TTACATAGATTGAGTGAAGGTACGAGTAATAACGTCCTGCTGCTGTTCTTTAGTCAGCGAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’;
利用pflB基因敲除引物得到的pflB同源重组片段的核苷酸序列为序列9,其中,第1-60位为pflB基因上游同源臂,第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因,第1365-1424位为pflB基因下游同源臂。所用转化受体菌株为上述步骤1得到的突变体E.coli LA1。利用菌落PCR的方法验证转化子,以pflBF和pflBR为引物,得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序,其为敲除E.coli LA1基因组上的pflB基因得到的菌,将该菌接种到LB液体培养基中,42℃传代三次,除去pCP20,将得到的菌株命名为突变体E.coli LA2。
3、敲除aceEF基因
与上述步骤1的方法基本相同,不同的是如下:
aceEF基因敲除引物序列如下:
aceEFF:
5’-ATGTCAGAACGTTTCCCAAATGACGTGGATCCGATCGAAACTCGCGACTGGCTCCAGGCGGTGTAGGCTGGA GCTGCTTCG-3’;
aceEFR:
5’-TTACATCACCAGACGGCGAATGTCAGACAGCGTGTTGTTAATGATGGTAATGAAACGGGCATTCCGGGGATC CGTCGACC-3’;
利用aceEF基因敲除引物得到的aceEF同源重组片段的核苷酸序列为序列7,其中,第1-60位为aceEF基因上游同源臂,第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因,第1365-1424位为aceEF基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤2得到的突变体E.coli LA2。利用菌落PCR的方法验证转化子,以aceEFF和aceEFR为引物,得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序,其为敲除E.coli LA2基因组上的aceEF基因得到的菌,将该菌接种到LB液体培养基中,42℃传代三次,除去pCP20,将得到的菌株命名为突变体E.coli LA3。
4、敲除ldhA基因
与上述步骤1的方法基本相同,不同的是如下:
ldhA基因敲除引物序列如下:
ldhAF:
5’-
ATGAAACTCGCCGTTTATAGCACAAAACAGTACGACAAGAAGTACCTGCAACAGGTGAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’;
ldhAR:
5’-
TTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGGTTTCGCCTTTTTCCAGATTGCTTAAGTTTTGCAGCGTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’;
利用ldhA基因敲除引物得到的ldhA同源重组片段的核苷酸序列为序列10,其中,第1-60位为ldhA基因上游同源臂,第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因,第1365-1424位为ldhA基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤3得到的突变体E.coli LA3。利用菌落PCR的方法验证转化子,以ldhAF和ldhAR为引物,得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序,其为敲除E.coli LA3基因组上的ldhA基因得到的菌,将该菌接种到LB液体培养基中,42℃传代三次,除去pCP20,将得到的菌株命名为突变体E.coli LA4。
5、敲除lldD基因
与上述步骤1的方法基本相同,不同的是如下:
lldD基因敲除引物序列如下:
lldDF:
5’-
ATGATTATTTCCGCAGCCAGCGATTATCGCGCCGCAGCGCAACGCATTCTGCCGCCGTTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’;
lldDR:
5’-
CTATGCCGCATTCCCTTTCGCCATGGGAGCCAGTGCCGCAGGCAACTCTTTACCCAGCCCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’;
利用lldD基因敲除引物得到的lldD同源重组片段的核苷酸序列为序列11,其中,第1-60位为lldD基因上游同源臂,第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因,第1365-1424位为lldD基因下游同源臂。转化受体菌株为上述步骤4得到的突变体E.coli LA4。利用菌落PCR的方法验证转化子,以lldDF和lldDR为引物,得到202bp的片段阳性克隆。将该阳性克隆送去测序,其为敲除E.coli LA4基因组上的lldD基因得到的菌,将该菌接种到LB液体培养基中,42℃传代三次,除去pCP20,将得到的菌株命名为突变体E.coli LA5。
七、重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)的构建
1、将上述步骤一得到的重组质粒pMCS-LA2和上述步骤四得到的重组质粒pUC19-LA4通过电转化的方法转化到上述步骤六得到的大肠杆菌E.coli LA5,并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基,37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基,37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒,验证转化的正确性,得到含有两个质粒(pMCS-LA2与pUC19-LA4)的重组菌记为E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)。
E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)为敲除E.coli MG1655染色体基因poxB、pflB、aceEF、ldhA和lldD,并且含有基因acs、pta、ackA、aceA、aceK、aceB、maeA、maeB和ldh2的外源表达盒的重组菌。
八、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA4)的构建
1、将上述步骤四得到的重组质粒pUC19-LA4通过电转化的方法转化到上述步骤六得到的大肠杆菌E.coli LA5,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒,验证转化的正确性,得到含有质粒pUC19-LA4的重组菌记为E.coli LA5(pUC19-LA4)。
E.coli LA5(pUC19-LA4)为敲除E.coli MG1655染色体基因poxB、pflB、aceEF、ldhA和lldD,并且含有基因aceA、aceK、aceB、maeA、maeB和ldh2的外源表达盒的重组菌。
九、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA24)的构建
1、将上述步骤五得到的重组质粒pUC19-LA24通过电转化的方法转化到上述步骤六得到的大肠杆菌E.coli LA5,并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养24h。
2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃培养24h。
3、提取转化子的质粒,验证转化的正确性,得到含有质粒pUC19-LA24的重组菌记为E.coli LA5(pUC19-LA24)。
E.coli LA5(pUC19-LA24)为敲除E.coli MG1655染色体基因poxB、pflB、aceEF、ldhA和lldD,并且含有基因aceA、aceK、aceB和ldh2的外源表达盒的重组菌。
实施例2、重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)在生产L-乳酸中的应用
一、重组菌E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)的摇瓶培养实验
1、将实施例1中步骤七制备的E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中,于37℃、转速200rpm条件下培养16h,作为种子液。
2、按体积比4%的接种量,将种子液接种到含有氨苄青霉素和卡那霉素的MM液体培养基中,250ml摇瓶中装液量为50ml,于37℃、转速100rpm条件下培养24h,分别在培养12h和24h收集发酵液。
3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的L-乳酸和消耗的乙酸进行定量检测。具体条件如下:
仪器:岛津公司Essentia LC系列HPLC仪,配有DGU-20A脱气机,LC-16送液泵,SIL-16型自动进样器,RID-20A检测器。
检测方法:
取L-乳酸浓度分别为0、1、2、3、4、5g/L的L-乳酸标准品水溶液(L-乳酸,Sigma-Aldrich,产品编号L1875),用0.22μm微孔滤膜过滤,进样10μL,进行HPLC检测,用不同浓度的L-乳酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标,不同浓度为横坐标,绘制标准曲线。取乙酸浓度分别为0、2、4、6、8、10g/L的乙酸标准品水溶液(乙酸,Sigma-Aldrich,产品编号A6283),用0.22μm微孔滤膜过滤,进样10μL,进行HPLC检测,用不同浓度的乙酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标,不同物质的浓度为横坐标,绘制标准曲线。
取2mL的发酵液,先用紫外分光光度计测定菌液在600nm的OD值,再于12000rpm离心10min,将其发酵上清液转移到新的离心管内,用0.22μm微孔滤膜过滤,进样10μL,进行HPLC检测。
将待测样品发酵上清液的L-乳酸色谱峰面积代入上述标准曲线中,计算得到待测样品发酵上清液的L-乳酸含量。将待测样品发酵上清液的乙酸色谱峰面积代入上述标准曲线中,计算得到待测样品发酵上清液的残留乙酸含量,将接种后初始的乙酸含量减去发酵上清液中的残留乙酸含量得到重组菌消耗的乙酸量。
E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)在摇瓶培养中的L-乳酸产量和乙酸消耗如表1所示:
表1 E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)的L-乳酸产量和乙酸消耗
注:表中数据为三次重复实验所得的均值。
由表1中的结果可以看出,本发明构建的重组菌株E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)能够在添加乙酸为碳源的培养基中,发酵获得L-乳酸,最终L-乳酸产量为2.46g/L,得率为0.40g/g,约为理论得率的53%。
二、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA4)的摇瓶培养实验
1、将实施例1中步骤八制备的E.coli LA5(pUC19-LA4)在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,于37℃、转速200rpm条件下培养16h,作为种子液。
2、按体积比4%的接种量,将种子液接种到含有氨苄青霉素的MM液体培养基中,250ml摇瓶中装液量为50ml,于37℃、转速100rpm条件下培养24h,分别在培养12h和24h收集发酵液。
3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的L-乳酸和消耗的乙酸进行定量检测,具体条件上述步骤一中步骤3所述,E.coli LA5(pUC19-LA4)在摇瓶培养中的L-乳酸产量和乙酸消耗如表2所示:
表2 E.coli LA5(pUC19-LA4)的L-乳酸产量和乙酸消耗
注:表中数据为三次重复实验所得的均值。
与E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)相比,对照菌E.coli LA5(pUC19-LA4)没有过表达乙酸利用相关的acs、pta和ackA基因,尽管E.coli LA5(pUC19-LA4)经过24h发酵的L-乳酸产量为1.69g/L,但L-乳酸产量和乙酸消耗相对E.coli LA5(pMCS-LA2+pUC19-LA4)较低。由此可见,基因acs、pta和ackA的过表达对于增加细菌的乙酸利用和L-乳酸合成有重要作用。
三、对照菌E.coli LA5(pUC19-LA24)的摇瓶培养实验
1、将实施例1中步骤九制备的E.coli LA5(pUC19-LA24)在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中,于37℃、转速200rpm条件下培养16h,作为种子液。
2、按体积比4%的接种量,将种子液接种到含有氨苄青霉素的MM液体培养基中,250ml摇瓶中装液量为50ml,于37℃、转速100rpm条件下培养24h,分别在培养12h和24h收集发酵液。
3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的L-乳酸和消耗的乙酸进行定量检测,具体条件上述步骤一中步骤3所述,E.coli LA5(pUC19-LA24)在摇瓶培养中的L-乳酸产量和乙酸消耗如表3所示:
表3 E.coli LA5(pUC19-LA24)的L-乳酸产量和乙酸消耗
注:表中数据为三次重复实验所得的均值。与E.coli LA5(pUC19-LA4)相比,对照菌E.coli LA5(pUC19-LA24)没有过表达NAD-依赖型苹果酸酶基因maeA和NADP-依赖型苹果酸酶基因maeB,尽管细菌能够消耗乙酸并生长,但不能够积累L-乳酸作为发酵产物。由此可见,基因maeA和maeB的过表达能够促进三羧酸循环中苹果酸代谢流溢出从而合成丙酮酸,再由L-乳酸脱氢酶催化合成L-乳酸,基因maeA和maeB对于L-乳酸的合成起到关键作用。
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<210> 1
<211> 2036
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagagctctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60
aaatatacca tgagccaaat tcacaaacac accattcctg ccaacatcgc agaccgttgc 120
ctgataaacc ctcagcagta cgaggcgatg tatcaacaat ctattaacgt acctgatacc 180
ttctggggcg aacagggaaa aattcttgac tggatcaaac cttaccagaa ggtgaaaaac 240
acctcctttg cccccggtaa tgtgtccatt aaatggtacg aggacggcac gctgaatctg 300
gcggcaaact gccttgaccg ccatctgcaa gaaaacggcg atcgtaccgc catcatctgg 360
gaaggcgacg acgccagcca gagcaaacat atcagctata aagagctgca ccgcgacgtc 420
tgccgcttcg ccaataccct gctcgagctg ggcattaaaa aaggtgatgt ggtggcgatt 480
tatatgccga tggtgccgga agccgcggtt gcgatgctgg cctgcgcccg cattggcgcg 540
gtgcattcgg tgattttcgg cggcttctcg ccggaagccg ttgccgggcg cattattgat 600
tccaactcac gactggtgat cacttccgac gaaggtgtgc gtgccgggcg cagtattccg 660
ctgaagaaaa acgttgatga cgcgctgaaa aacccgaacg tcaccagcgt agagcatgtg 720
gtggtactga agcgtactgg cgggaaaatt gactggcagg aagggcgcga cctgtggtgg 780
cacgacctgg ttgagcaagc gagcgatcag caccaggcgg aagagatgaa cgccgaagat 840
ccgctgttta ttctctacac ctccggttct accggtaagc caaaaggtgt gctgcatact 900
accggcggtt atctggtgta cgcggcgctg acctttaaat atgtctttga ttatcatccg 960
ggtgatatct actggtgcac cgccgatgtg ggctgggtga ccggacacag ttacttgctg 1020
tacggcccgc tggcctgcgg tgcgaccacg ctgatgtttg aaggcgtacc caactggccg 1080
acgcctgccc gtatggcgca ggtggtggac aagcatcagg tcaatattct ctataccgca 1140
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ggcgccgttg gttcaagcta tgcctatgca atggttttgc aaggtatcgc tcaagaaatc 180
gggattgttg acattttcaa ggacaagacg aaaggtgacg caattgattt aagcaacgcg 240
ctcccattca ccagtcctaa gaagatttat tctgctgaat acagcgatgc caaggatgct 300
gatctggttg ttatcactgc tggtgctcct caaaagcctg gcgaaactcg cttggatctg 360
gttaacaaga acttgaagat tttgaagtcc attgttgatc cgatcgtgga ttctggcttt 420
aacggtatct tcttggttgc tgctaaccca gttgatatct tgacttatgc tacttggaag 480
ctttccggat tcccgaagag ccgggttgtt ggttcaggta cttctctgga caccgctcgt 540
ttccgtcaat ccattgctga aatggttaac gttgatgctc gttccgtcca cgcatatatc 600
atgggtgaac acggcgacac agaattccct gtatggtccc acgctaacat tggtggcgtt 660
accatcgctg aatgggttaa agcacatcca gaaatcaaag aagacaaact tgttaagatg 720
tttgaagacg ttcgtgacgc tgcttacgaa atcatcaaac tcaagggtgc aaccttctac 780
ggtatcgcaa ctgctttggc acggatttcc aaagcaattc ttaacgatga aaatgcggta 840
ctcccattgt ccgtttacat ggacggccaa tatggcttga acgacatcta cattggtaca 900
cctgctgtga tcaaccgcaa tggtattcag aacattctgg aaatcccatt gaccgaccac 960
gaagaagaat ccatgcagaa gtcggcttca caattgaaga aagttctgac cgatgcgttt 1020
gctaagaacg acatcgaaac acgtcagtaa tctagaaa 1058
<210> 7
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240
agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300
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caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420
gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480
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gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780
tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840
gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900
ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960
tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020
actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080
gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140
tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200
ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260
cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320
agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatgcccgt ttcattacca 1380
tcattaacaa cacgctgtct gacattcgcc gtctggtgat gtaa 1424
<210> 8
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120
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agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300
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<212> DNA
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Cys Leu Ile Asn Pro Gln Gln Tyr Glu Ala Met Tyr Gln Gln Ser Ile
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Asn Val Pro Asp Thr Phe Trp Gly Glu Gln Gly Lys Ile Leu Asp Trp
35 40 45
Ile Lys Pro Tyr Gln Lys Val Lys Asn Thr Ser Phe Ala Pro Gly Asn
50 55 60
Val Ser Ile Lys Trp Tyr Glu Asp Gly Thr Leu Asn Leu Ala Ala Asn
65 70 75 80
Cys Leu Asp Arg His Leu Gln Glu Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ile Ile
85 90 95
Trp Glu Gly Asp Asp Ala Ser Gln Ser Lys His Ile Ser Tyr Lys Glu
100 105 110
Leu His Arg Asp Val Cys Arg Phe Ala Asn Thr Leu Leu Glu Leu Gly
115 120 125
Ile Lys Lys Gly Asp Val Val Ala Ile Tyr Met Pro Met Val Pro Glu
130 135 140
Ala Ala Val Ala Met Leu Ala Cys Ala Arg Ile Gly Ala Val His Ser
145 150 155 160
Val Ile Phe Gly Gly Phe Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Arg Ile Ile
165 170 175
Asp Ser Asn Ser Arg Leu Val Ile Thr Ser Asp Glu Gly Val Arg Ala
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Gly Arg Ser Ile Pro Leu Lys Lys Asn Val Asp Asp Ala Leu Lys Asn
195 200 205
Pro Asn Val Thr Ser Val Glu His Val Val Val Leu Lys Arg Thr Gly
210 215 220
Gly Lys Ile Asp Trp Gln Glu Gly Arg Asp Leu Trp Trp His Asp Leu
225 230 235 240
Val Glu Gln Ala Ser Asp Gln His Gln Ala Glu Glu Met Asn Ala Glu
245 250 255
Asp Pro Leu Phe Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys
260 265 270
Gly Val Leu His Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Ala Leu Thr
275 280 285
Phe Lys Tyr Val Phe Asp Tyr His Pro Gly Asp Ile Tyr Trp Cys Thr
290 295 300
Ala Asp Val Gly Trp Val Thr Gly His Ser Tyr Leu Leu Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Leu Ala Cys Gly Ala Thr Thr Leu Met Phe Glu Gly Val Pro Asn Trp
325 330 335
Pro Thr Pro Ala Arg Met Ala Gln Val Val Asp Lys His Gln Val Asn
340 345 350
Ile Leu Tyr Thr Ala Pro Thr Ala Ile Arg Ala Leu Met Ala Glu Gly
355 360 365
Asp Lys Ala Ile Glu Gly Thr Asp Arg Ser Ser Leu Arg Ile Leu Gly
370 375 380
Ser Val Gly Glu Pro Ile Asn Pro Glu Ala Trp Glu Trp Tyr Trp Lys
385 390 395 400
Lys Ile Gly Asn Glu Lys Cys Pro Val Val Asp Thr Trp Trp Gln Thr
405 410 415
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420 425 430
Lys Ala Gly Ser Ala Thr Arg Pro Phe Phe Gly Val Gln Pro Ala Leu
435 440 445
Val Asp Asn Glu Gly Asn Pro Leu Glu Gly Ala Thr Glu Gly Ser Leu
450 455 460
Val Ile Thr Asp Ser Trp Pro Gly Gln Ala Arg Thr Leu Phe Gly Asp
465 470 475 480
His Glu Arg Phe Glu Gln Thr Tyr Phe Ser Thr Phe Lys Asn Met Tyr
485 490 495
Phe Ser Gly Asp Gly Ala Arg Arg Asp Glu Asp Gly Tyr Tyr Trp Ile
500 505 510
Thr Gly Arg Val Asp Asp Val Leu Asn Val Ser Gly His Arg Leu Gly
515 520 525
Thr Ala Glu Ile Glu Ser Ala Leu Val Ala His Pro Lys Ile Ala Glu
530 535 540
Ala Ala Val Val Gly Ile Pro His Asn Ile Lys Gly Gln Ala Ile Tyr
545 550 555 560
Ala Tyr Val Thr Leu Asn His Gly Glu Glu Pro Ser Pro Glu Leu Tyr
565 570 575
Ala Glu Val Arg Asn Trp Val Arg Lys Glu Ile Gly Pro Leu Ala Thr
580 585 590
Pro Asp Val Leu His Trp Thr Asp Ser Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly
595 600 605
Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg Lys Ile Ala Ala Gly Asp Thr Ser
610 615 620
Asn Leu Gly Asp Thr Ser Thr Leu Ala Asp Pro Gly Val Val Glu Lys
625 630 635 640
Leu Leu Glu Glu Lys Gln Ala Ile Ala Met Pro Ser
645 650
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<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Ser Ser Lys Leu Val Leu Val Leu Asn Cys Gly Ser Ser Ser Leu
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Lys Phe Ala Ile Ile Asp Ala Val Asn Gly Glu Glu Tyr Leu Ser Gly
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Leu Ala Glu Cys Phe His Leu Pro Glu Ala Arg Ile Lys Trp Lys Met
35 40 45
Asp Gly Asn Lys Gln Glu Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ala Ala His Ser
50 55 60
Glu Ala Leu Asn Phe Ile Val Asn Thr Ile Leu Ala Gln Lys Pro Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ala Gln Leu Thr Ala Ile Gly His Arg Ile Val His Gly Gly
85 90 95
Glu Lys Tyr Thr Ser Ser Val Val Ile Asp Glu Ser Val Ile Gln Gly
100 105 110
Ile Lys Asp Ala Ala Ser Phe Ala Pro Leu His Asn Pro Ala His Leu
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Ile Gly Ile Glu Glu Ala Leu Lys Ser Phe Pro Gln Leu Lys Asp Lys
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Asn Val Ala Val Phe Asp Thr Ala Phe His Gln Thr Met Pro Glu Glu
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Ser Tyr Leu Tyr Ala Leu Pro Tyr Asn Leu Tyr Lys Glu His Gly Ile
165 170 175
Arg Arg Tyr Gly Ala His Gly Thr Ser His Phe Tyr Val Thr Gln Glu
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Ala Ala Lys Met Leu Asn Lys Pro Val Glu Glu Leu Asn Ile Ile Thr
195 200 205
Cys His Leu Gly Asn Gly Gly Ser Val Ser Ala Ile Arg Asn Gly Lys
210 215 220
Cys Val Asp Thr Ser Met Gly Leu Thr Pro Leu Glu Gly Leu Val Met
225 230 235 240
Gly Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Ala Ile Ile Phe His Leu His
245 250 255
Asp Thr Leu Gly Met Ser Val Asp Ala Ile Asn Lys Leu Leu Thr Lys
260 265 270
Glu Ser Gly Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Thr Ser Asp Cys Arg Tyr
275 280 285
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Val Tyr Cys His Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Gly Ala Tyr Thr Ala Leu
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Met Asp Gly Arg Leu Asp Ala Val Val Phe Thr Gly Gly Ile Gly Glu
325 330 335
Asn Ala Ala Met Val Arg Glu Leu Ser Leu Gly Lys Leu Gly Val Leu
340 345 350
Gly Phe Glu Val Asp His Glu Arg Asn Leu Ala Ala Arg Phe Gly Lys
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Ser Gly Phe Ile Asn Lys Glu Gly Thr Arg Pro Ala Val Val Ile Pro
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<400> 14
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Arg Leu Ser Val Phe Lys Pro Ile Ala Gln Pro Arg Thr Gly Gly Asp
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50 55 60
Thr Ala Ala Glu Pro Leu Lys Met Ser Tyr Val Glu Gly Leu Leu Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Asn Thr Lys Asp Ala Glu Val Val Leu Val Glu Gly Leu Val Pro
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115 120 125
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130 135 140
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Gly Ala Lys Asn Thr Asn Ile Thr Gly Val Ile Val Asn Lys Leu Asn
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Ala Pro Val Asp Glu Gln Gly Arg Thr Arg Pro Asp Leu Ser Glu Ile
180 185 190
Phe Asp Asp Ser Ser Lys Ala Lys Val Asn Asn Val Asp Pro Ala Lys
195 200 205
Leu Gln Glu Ser Ser Pro Leu Pro Val Leu Gly Ala Val Pro Trp Ser
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Phe Asp Leu Ile Ala Thr Arg Ala Ile Asp Met Ala Arg His Leu Asn
225 230 235 240
Ala Thr Ile Ile Asn Glu Gly Asp Ile Asn Thr Arg Arg Val Lys Ser
245 250 255
Val Thr Phe Cys Ala Arg Ser Ile Pro His Met Leu Glu His Phe Arg
260 265 270
Ala Gly Ser Leu Leu Val Thr Ser Ala Asp Arg Pro Asp Val Leu Val
275 280 285
Ala Ala Cys Leu Ala Ala Met Asn Gly Val Glu Ile Gly Ala Leu Leu
290 295 300
Leu Thr Gly Gly Tyr Glu Met Asp Ala Arg Ile Ser Lys Leu Cys Glu
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Arg Ala Phe Ala Thr Gly Leu Pro Val Phe Met Val Asn Thr Asn Thr
325 330 335
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Asp Asp His Glu Arg Ile Glu Lys Val Gln Glu Tyr Val Ala Asn Tyr
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Met Thr Glu Thr Val Ala Arg Glu Gln Leu Glu Asp Asn Val Val Leu
485 490 495
Gly Thr Leu Met Leu Glu Gln Asp Glu Val Asp Gly Leu Val Ser Gly
500 505 510
Ala Val His Thr Thr Ala Asn Thr Ile Arg Pro Pro Leu Gln Leu Ile
515 520 525
Lys Thr Ala Pro Gly Ser Ser Leu Val Ser Ser Val Phe Phe Met Leu
530 535 540
Leu Pro Glu Gln Val Tyr Val Tyr Gly Asp Cys Ala Ile Asn Pro Asp
545 550 555 560
Pro Thr Ala Glu Gln Leu Ala Glu Ile Ala Ile Gln Ser Ala Asp Ser
565 570 575
Ala Ala Ala Phe Gly Ile Glu Pro Arg Val Ala Met Leu Ser Tyr Ser
580 585 590
Thr Gly Thr Ser Gly Ala Gly Ser Asp Val Glu Lys Val Arg Glu Ala
595 600 605
Thr Arg Leu Ala Gln Glu Lys Arg Pro Asp Leu Met Ile Asp Gly Pro
610 615 620
Leu Gln Tyr Asp Ala Ala Val Met Ala Asp Val Ala Lys Ser Lys Ala
625 630 635 640
Pro Asn Ser Pro Val Ala Gly Arg Ala Thr Val Phe Ile Phe Pro Asp
645 650 655
Leu Asn Thr Gly Asn Thr Thr Tyr Lys Ala Val Gln Arg Ser Ala Asp
660 665 670
Leu Ile Ser Ile Gly Pro Met Leu Gln Gly Met Arg Lys Pro Val Asn
675 680 685
Asp Leu Ser Arg Gly Ala Leu Val Asp Asp Ile Val Tyr Thr Ile Ala
690 695 700
Leu Thr Ala Ile Gln Ser Ala Gln Gln Gln
705 710
<210> 15
<211> 434
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Met Lys Thr Arg Thr Gln Gln Ile Glu Glu Leu Gln Lys Glu Trp Thr
1 5 10 15
Gln Pro Arg Trp Glu Gly Ile Thr Arg Pro Tyr Ser Ala Glu Asp Val
20 25 30
Val Lys Leu Arg Gly Ser Val Asn Pro Glu Cys Thr Leu Ala Gln Leu
35 40 45
Gly Ala Ala Lys Met Trp Arg Leu Leu His Gly Glu Ser Lys Lys Gly
50 55 60
Tyr Ile Asn Ser Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Gln Ala Leu Gln Gln
65 70 75 80
Ala Lys Ala Gly Ile Glu Ala Val Tyr Leu Ser Gly Trp Gln Val Ala
85 90 95
Ala Asp Ala Asn Leu Ala Ala Ser Met Tyr Pro Asp Gln Ser Leu Tyr
100 105 110
Pro Ala Asn Ser Val Pro Ala Val Val Glu Arg Ile Asn Asn Thr Phe
115 120 125
Arg Arg Ala Asp Gln Ile Gln Trp Ser Ala Gly Ile Glu Pro Gly Asp
130 135 140
Pro Arg Tyr Val Asp Tyr Phe Leu Pro Ile Val Ala Asp Ala Glu Ala
145 150 155 160
Gly Phe Gly Gly Val Leu Asn Ala Phe Glu Leu Met Lys Ala Met Ile
165 170 175
Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val His Phe Glu Asp Gln Leu Ala Ser Val
180 185 190
Lys Lys Cys Gly His Met Gly Gly Lys Val Leu Val Pro Thr Gln Glu
195 200 205
Ala Ile Gln Lys Leu Val Ala Ala Arg Leu Ala Ala Asp Val Thr Gly
210 215 220
Val Pro Thr Leu Leu Val Ala Arg Thr Asp Ala Asp Ala Ala Asp Leu
225 230 235 240
Ile Thr Ser Asp Cys Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Phe Ile Thr Gly Glu
245 250 255
Arg Thr Ser Glu Gly Phe Phe Arg Thr His Ala Gly Ile Glu Gln Ala
260 265 270
Ile Ser Arg Gly Leu Ala Tyr Ala Pro Tyr Ala Asp Leu Val Trp Cys
275 280 285
Glu Thr Ser Thr Pro Asp Leu Glu Leu Ala Arg Arg Phe Ala Gln Ala
290 295 300
Ile His Ala Lys Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Ala Tyr Asn Cys Ser Pro
305 310 315 320
Ser Phe Asn Trp Gln Lys Asn Leu Asp Asp Lys Thr Ile Ala Ser Phe
325 330 335
Gln Gln Gln Leu Ser Asp Met Gly Tyr Lys Phe Gln Phe Ile Thr Leu
340 345 350
Ala Gly Ile His Ser Met Trp Phe Asn Met Phe Asp Leu Ala Asn Ala
355 360 365
Tyr Ala Gln Gly Glu Gly Met Lys His Tyr Val Glu Lys Val Gln Gln
370 375 380
Pro Glu Phe Ala Ala Ala Lys Asp Gly Tyr Thr Phe Val Ser His Gln
385 390 395 400
Gln Glu Val Gly Thr Gly Tyr Phe Asp Lys Val Thr Thr Ile Ile Gln
405 410 415
Gly Gly Thr Ser Ser Val Thr Ala Leu Thr Gly Ser Thr Glu Glu Ser
420 425 430
Gln Phe
<210> 16
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Met Pro Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Ala Gln Thr Ile Leu Gln Gly
1 5 10 15
Phe Asp Ala Gln Tyr Gly Arg Phe Leu Glu Val Thr Ser Gly Ala Gln
20 25 30
Gln Arg Phe Glu Gln Ala Asp Trp His Ala Val Gln Gln Ala Met Lys
35 40 45
Asn Arg Ile His Leu Tyr Asp His His Val Gly Leu Val Val Glu Gln
50 55 60
Leu Arg Cys Ile Thr Asn Gly Gln Ser Thr Asp Ala Ala Phe Leu Leu
65 70 75 80
Arg Val Lys Glu His Tyr Thr Arg Leu Leu Pro Asp Tyr Pro Arg Phe
85 90 95
Glu Ile Ala Glu Ser Phe Phe Asn Ser Val Tyr Cys Arg Leu Phe Asp
100 105 110
His Arg Ser Leu Thr Pro Glu Arg Leu Phe Ile Phe Ser Ser Gln Pro
115 120 125
Glu Arg Arg Phe Arg Thr Ile Pro Arg Pro Leu Ala Lys Asp Phe His
130 135 140
Pro Asp His Gly Trp Glu Ser Leu Leu Met Arg Val Ile Ser Asp Leu
145 150 155 160
Pro Leu Arg Leu Arg Trp Gln Asn Lys Ser Arg Asp Ile His Tyr Ile
165 170 175
Ile Arg His Leu Thr Glu Thr Leu Gly Thr Asp Asn Leu Ala Glu Ser
180 185 190
His Leu Gln Val Ala Asn Glu Leu Phe Tyr Arg Asn Lys Ala Ala Trp
195 200 205
Leu Val Gly Lys Leu Ile Thr Pro Ser Gly Thr Leu Pro Phe Leu Leu
210 215 220
Pro Ile His Gln Thr Asp Asp Gly Glu Leu Phe Ile Asp Thr Cys Leu
225 230 235 240
Thr Thr Thr Ala Glu Ala Ser Ile Val Phe Gly Phe Ala Arg Ser Tyr
245 250 255
Phe Met Val Tyr Ala Pro Leu Pro Ala Ala Leu Val Glu Trp Leu Arg
260 265 270
Glu Ile Leu Pro Gly Lys Thr Thr Ala Glu Leu Tyr Met Ala Ile Gly
275 280 285
Cys Gln Lys His Ala Lys Thr Glu Ser Tyr Arg Glu Tyr Leu Val Tyr
290 295 300
Leu Gln Gly Cys Asn Glu Gln Phe Ile Glu Ala Pro Gly Ile Arg Gly
305 310 315 320
Met Val Met Leu Val Phe Thr Leu Pro Gly Phe Asp Arg Val Phe Lys
325 330 335
Val Ile Lys Asp Arg Phe Ala Pro Gln Lys Glu Met Ser Ala Ala His
340 345 350
Val Arg Ala Cys Tyr Gln Leu Val Lys Glu His Asp Arg Val Gly Arg
355 360 365
Met Ala Asp Thr Gln Glu Phe Glu Asn Phe Val Leu Glu Lys Arg His
370 375 380
Ile Ser Pro Ala Leu Met Glu Leu Leu Leu Gln Glu Ala Ala Glu Lys
385 390 395 400
Ile Thr Asp Leu Gly Glu Gln Ile Val Ile Arg His Leu Tyr Ile Glu
405 410 415
Arg Arg Met Val Pro Leu Asn Ile Trp Leu Glu Gln Val Glu Gly Gln
420 425 430
Gln Leu Arg Asp Ala Ile Glu Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Arg Gln Leu
435 440 445
Ala Ala Ala Asn Ile Phe Pro Gly Asp Met Leu Phe Lys Asn Phe Gly
450 455 460
Val Thr Arg His Gly Arg Val Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Glu Ile Cys
465 470 475 480
Tyr Met Thr Glu Val Asn Phe Arg Asp Ile Pro Pro Pro Arg Tyr Pro
485 490 495
Glu Asp Glu Leu Ala Ser Glu Pro Trp Tyr Ser Val Ser Pro Gly Asp
500 505 510
Val Phe Pro Glu Glu Phe Arg His Trp Leu Cys Ala Asp Pro Arg Ile
515 520 525
Gly Pro Leu Phe Glu Glu Met His Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Tyr
530 535 540
Trp Arg Ala Leu Gln Asn Arg Ile Arg Glu Gly His Val Glu Asp Val
545 550 555 560
Tyr Ala Tyr Arg Arg Arg Gln Arg Phe Ser Val Arg Tyr Gly Glu Met
565 570 575
Leu Phe
<210> 17
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Met Thr Glu Gln Ala Thr Thr Thr Asp Glu Leu Ala Phe Thr Arg Pro
1 5 10 15
Tyr Gly Glu Gln Glu Lys Gln Ile Leu Thr Ala Glu Ala Val Glu Phe
20 25 30
Leu Thr Glu Leu Val Thr His Phe Thr Pro Gln Arg Asn Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Arg Ile Gln Gln Gln Gln Asp Ile Asp Asn Gly Thr Leu Pro
50 55 60
Asp Phe Ile Ser Glu Thr Ala Ser Ile Arg Asp Ala Asp Trp Lys Ile
65 70 75 80
Arg Gly Ile Pro Ala Asp Leu Glu Asp Arg Arg Val Glu Ile Thr Gly
85 90 95
Pro Val Glu Arg Lys Met Val Ile Asn Ala Leu Asn Ala Asn Val Lys
100 105 110
Val Phe Met Ala Asp Phe Glu Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asn Lys
115 120 125
Val Ile Asp Gly Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Val Asn Gly Thr Ile
130 135 140
Ser Tyr Thr Asn Glu Ala Gly Lys Ile Tyr Gln Leu Lys Pro Asn Pro
145 150 155 160
Ala Val Leu Ile Cys Arg Val Arg Gly Leu His Leu Pro Glu Lys His
165 170 175
Val Thr Trp Arg Gly Glu Ala Ile Pro Gly Ser Leu Phe Asp Phe Ala
180 185 190
Leu Tyr Phe Phe His Asn Tyr Gln Ala Leu Leu Ala Lys Gly Ser Gly
195 200 205
Pro Tyr Phe Tyr Leu Pro Lys Thr Gln Ser Trp Gln Glu Ala Ala Trp
210 215 220
Trp Ser Glu Val Phe Ser Tyr Ala Glu Asp Arg Phe Asn Leu Pro Arg
225 230 235 240
Gly Thr Ile Lys Ala Thr Leu Leu Ile Glu Thr Leu Pro Ala Val Phe
245 250 255
Gln Met Asp Glu Ile Leu His Ala Leu Arg Asp His Ile Val Gly Leu
260 265 270
Asn Cys Gly Arg Trp Asp Tyr Ile Phe Ser Tyr Ile Lys Thr Leu Lys
275 280 285
Asn Tyr Pro Asp Arg Val Leu Pro Asp Arg Gln Ala Val Thr Met Asp
290 295 300
Lys Pro Phe Leu Asn Ala Tyr Ser Arg Leu Leu Ile Lys Thr Cys His
305 310 315 320
Lys Arg Gly Ala Phe Ala Met Gly Gly Met Ala Ala Phe Ile Pro Ser
325 330 335
Lys Asp Glu Glu His Asn Asn Gln Val Leu Asn Lys Val Lys Ala Asp
340 345 350
Lys Ser Leu Glu Ala Asn Asn Gly His Asp Gly Thr Trp Ile Ala His
355 360 365
Pro Gly Leu Ala Asp Thr Ala Met Ala Val Phe Asn Asp Ile Leu Gly
370 375 380
Ser Arg Lys Asn Gln Leu Glu Val Met Arg Glu Gln Asp Ala Pro Ile
385 390 395 400
Thr Ala Asp Gln Leu Leu Ala Pro Cys Asp Gly Glu Arg Thr Glu Glu
405 410 415
Gly Met Arg Ala Asn Ile Arg Val Ala Val Gln Tyr Ile Glu Ala Trp
420 425 430
Ile Ser Gly Asn Gly Cys Val Pro Ile Tyr Gly Leu Met Glu Asp Ala
435 440 445
Ala Thr Ala Glu Ile Ser Arg Thr Ser Ile Trp Gln Trp Ile His His
450 455 460
Gln Lys Thr Leu Ser Asn Gly Lys Pro Val Thr Lys Ala Leu Phe Arg
465 470 475 480
Gln Met Leu Gly Glu Glu Met Lys Val Ile Ala Ser Glu Leu Gly Glu
485 490 495
Glu Arg Phe Ser Gln Gly Arg Phe Asp Asp Ala Ala Arg Leu Met Glu
500 505 510
Gln Ile Thr Thr Ser Asp Glu Leu Ile Asp Phe Leu Thr Leu Pro Gly
515 520 525
Tyr Arg Leu Leu Ala
530
<210> 18
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Met Glu Pro Lys Thr Lys Lys Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Leu Leu Glu Phe Pro Leu Leu Asn Lys Gly Ser Ala Phe
20 25 30
Ser Met Glu Glu Arg Arg Asn Phe Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro Glu
35 40 45
Val Val Glu Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Arg Ala Trp Ile Gln Tyr
50 55 60
Gln Gly Phe Lys Thr Glu Ile Asp Lys His Ile Tyr Leu Arg Asn Ile
65 70 75 80
Gln Asp Thr Asn Glu Thr Leu Phe Tyr Arg Leu Val Asn Asn His Leu
85 90 95
Asp Glu Met Met Pro Val Ile Tyr Thr Pro Thr Val Gly Ala Ala Cys
100 105 110
Glu Arg Phe Ser Glu Ile Tyr Arg Arg Ser Arg Gly Val Phe Ile Ser
115 120 125
Tyr Gln Asn Arg His Asn Met Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Pro Asn
130 135 140
His Asn Ile Lys Val Ile Val Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly
145 150 155 160
Leu Gly Asp Gln Gly Ile Gly Gly Met Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu
165 170 175
Ser Leu Tyr Thr Ala Cys Gly Gly Ile Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Pro
180 185 190
Val Val Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Pro
195 200 205
Leu Tyr Met Gly Trp Arg Asn Pro Arg Ile Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr
210 215 220
Glu Phe Val Asp Glu Phe Ile Gln Ala Val Lys Gln Arg Trp Pro Asp
225 230 235 240
Val Leu Leu Gln Phe Glu Asp Phe Ala Gln Lys Asn Ala Met Pro Leu
245 250 255
Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Glu Ile Cys Ser Phe Asn Asp Asp Ile Gln
260 265 270
Gly Thr Ala Ala Val Thr Val Gly Thr Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala
275 280 285
Ala Gly Gly Gln Leu Ser Glu Lys Lys Ile Val Phe Leu Gly Ala Gly
290 295 300
Ser Ala Gly Cys Gly Ile Ala Glu Met Ile Ile Ser Gln Thr Gln Arg
305 310 315 320
Glu Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Arg Gln Lys Val Phe Met Val Asp
325 330 335
Arg Phe Gly Leu Leu Thr Asp Lys Met Pro Asn Leu Leu Pro Phe Gln
340 345 350
Thr Lys Leu Val Gln Lys Arg Glu Asn Leu Ser Asp Trp Asp Thr Asp
355 360 365
Ser Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Val Val Arg Asn Val Lys Pro Asp
370 375 380
Ile Leu Ile Gly Val Ser Gly Gln Thr Gly Leu Phe Thr Glu Glu Ile
385 390 395 400
Ile Arg Glu Met His Lys His Cys Pro Arg Pro Ile Val Met Pro Leu
405 410 415
Ser Asn Pro Thr Ser Arg Val Glu Ala Thr Pro Gln Asp Ile Ile Ala
420 425 430
Trp Thr Glu Gly Asn Ala Leu Val Ala Thr Gly Ser Pro Phe Asn Pro
435 440 445
Val Val Trp Lys Asp Lys Ile Tyr Pro Ile Ala Gln Cys Asn Asn Ala
450 455 460
Phe Ile Phe Pro Gly Ile Gly Leu Gly Val Ile Ala Ser Gly Ala Ser
465 470 475 480
Arg Ile Thr Asp Glu Met Leu Met Ser Ala Ser Glu Thr Leu Ala Gln
485 490 495
Tyr Ser Pro Leu Val Leu Asn Gly Glu Gly Met Val Leu Pro Glu Leu
500 505 510
Lys Asp Ile Gln Lys Val Ser Arg Ala Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys
515 520 525
Met Ala Gln Gln Gln Gly Val Ala Val Lys Thr Ser Ala Glu Ala Leu
530 535 540
Gln Gln Ala Ile Asp Asp Asn Phe Trp Gln Ala Glu Tyr Arg Asp Tyr
545 550 555 560
Arg Arg Thr Ser Ile
565
<210> 19
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Met Asp Asp Gln Leu Lys Gln Ser Ala Leu Asp Phe His Glu Phe Pro
1 5 10 15
Val Pro Gly Lys Ile Gln Val Ser Pro Thr Lys Pro Leu Ala Thr Gln
20 25 30
Arg Asp Leu Ala Leu Ala Tyr Ser Pro Gly Val Ala Ala Pro Cys Leu
35 40 45
Glu Ile Glu Lys Asp Pro Leu Lys Ala Tyr Lys Tyr Thr Ala Arg Gly
50 55 60
Asn Leu Val Ala Val Ile Ser Asn Gly Thr Ala Val Leu Gly Leu Gly
65 70 75 80
Asn Ile Gly Ala Leu Ala Gly Lys Pro Val Met Glu Gly Lys Gly Val
85 90 95
Leu Phe Lys Lys Phe Ala Gly Ile Asp Val Phe Asp Ile Glu Val Asp
100 105 110
Glu Leu Asp Pro Asp Lys Phe Ile Glu Val Val Ala Ala Leu Glu Pro
115 120 125
Thr Phe Gly Gly Ile Asn Leu Glu Asp Ile Lys Ala Pro Glu Cys Phe
130 135 140
Tyr Ile Glu Gln Lys Leu Arg Glu Arg Met Asn Ile Pro Val Phe His
145 150 155 160
Asp Asp Gln His Gly Thr Ala Ile Ile Ser Thr Ala Ala Ile Leu Asn
165 170 175
Gly Leu Arg Val Val Glu Lys Asn Ile Ser Asp Val Arg Met Val Val
180 185 190
Ser Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ile Ala Cys Met Asn Leu Leu Val Ala
195 200 205
Leu Gly Leu Gln Lys His Asn Ile Val Val Cys Asp Ser Lys Gly Val
210 215 220
Ile Tyr Gln Gly Arg Glu Pro Asn Met Ala Glu Thr Lys Ala Ala Tyr
225 230 235 240
Ala Val Val Asp Asp Gly Lys Arg Thr Leu Asp Asp Val Ile Glu Gly
245 250 255
Ala Asp Ile Phe Leu Gly Cys Ser Gly Pro Lys Val Leu Thr Gln Glu
260 265 270
Met Val Lys Lys Met Ala Arg Ala Pro Met Ile Leu Ala Leu Ala Asn
275 280 285
Pro Glu Pro Glu Ile Leu Pro Pro Leu Ala Lys Glu Val Arg Pro Asp
290 295 300
Ala Ile Ile Cys Thr Gly Arg Ser Asp Tyr Pro Asn Gln Val Asn Asn
305 310 315 320
Val Leu Cys Phe Pro Phe Ile Phe Arg Gly Ala Leu Asp Val Gly Ala
325 330 335
Thr Ala Ile Asn Glu Glu Met Lys Leu Ala Ala Val Arg Ala Ile Ala
340 345 350
Glu Leu Ala His Ala Glu Gln Ser Glu Val Val Ala Ser Ala Tyr Gly
355 360 365
Asp Gln Asp Leu Ser Phe Gly Pro Glu Tyr Ile Ile Pro Lys Pro Phe
370 375 380
Asp Pro Arg Leu Ile Val Lys Ile Ala Pro Ala Val Ala Lys Ala Ala
385 390 395 400
Met Glu Ser Gly Val Ala Thr Arg Pro Ile Ala Asp Phe Asp Val Tyr
405 410 415
Ile Asp Lys Leu Thr Glu Phe Val Tyr Lys Thr Asn Leu Phe Met Lys
420 425 430
Pro Ile Phe Ser Gln Ala Arg Lys Ala Pro Lys Arg Val Val Leu Pro
435 440 445
Glu Gly Glu Glu Ala Arg Val Leu His Ala Thr Gln Glu Leu Val Thr
450 455 460
Leu Gly Leu Ala Lys Pro Ile Leu Ile Gly Arg Pro Asn Val Ile Glu
465 470 475 480
Met Arg Ile Gln Lys Leu Gly Leu Gln Ile Lys Ala Gly Val Asp Phe
485 490 495
Glu Ile Val Asn Asn Glu Ser Asp Pro Arg Phe Lys Glu Tyr Trp Thr
500 505 510
Glu Tyr Phe Gln Ile Met Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Glu Gln Ala
515 520 525
Gln Arg Ala Leu Ile Ser Asn Pro Thr Val Ile Gly Ala Ile Met Val
530 535 540
Gln Arg Gly Glu Ala Asp Ala Met Ile Cys Gly Thr Val Gly Asp Tyr
545 550 555 560
His Glu His Phe Ser Val Val Lys Asn Val Phe Gly Tyr Arg Asp Gly
565 570 575
Val His Thr Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Leu Leu Pro Ser Gly Asn
580 585 590
Thr Phe Ile Ala Asp Thr Tyr Val Asn Asp Glu Pro Asp Ala Glu Glu
595 600 605
Leu Ala Glu Ile Thr Leu Met Ala Ala Glu Thr Val Arg Arg Phe Gly
610 615 620
Ile Glu Pro Arg Val Ala Leu Leu Ser His Ser Asn Phe Gly Ser Ser
625 630 635 640
Asp Cys Pro Ser Ser Ser Lys Met Arg Gln Ala Leu Glu Leu Val Arg
645 650 655
Glu Arg Ala Pro Glu Leu Met Ile Asp Gly Glu Met His Gly Asp Ala
660 665 670
Ala Leu Val Glu Ala Ile Arg Asn Asp Arg Met Pro Asp Ser Ser Leu
675 680 685
Lys Gly Ser Ala Asn Ile Leu Val Met Pro Asn Met Glu Ala Ala Arg
690 695 700
Ile Ser Tyr Asn Leu Leu Arg Val Ser Ser Ser Glu Gly Val Thr Val
705 710 715 720
Gly Pro Val Leu Met Gly Val Ala Lys Pro Val His Val Leu Thr Pro
725 730 735
Ile Ala Ser Val Arg Arg Ile Val Asn Met Val Ala Leu Ala Val Val
740 745 750
Glu Ala Gln Thr Gln Pro Leu
755
<210> 20
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Met Ala Ser Ile Thr Asp Lys Asp His Gln Lys Val Ile Leu Val Gly
1 5 10 15
Asp Gly Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Tyr Ala Met Val Leu Gln Gly
20 25 30
Ile Ala Gln Glu Ile Gly Ile Val Asp Ile Phe Lys Asp Lys Thr Lys
35 40 45
Gly Asp Ala Ile Asp Leu Ser Asn Ala Leu Pro Phe Thr Ser Pro Lys
50 55 60
Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Leu Val
65 70 75 80
Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp
85 90 95
Leu Val Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ile
100 105 110
Val Asp Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val
115 120 125
Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Ser
130 135 140
Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln
145 150 155 160
Ser Ile Ala Glu Met Val Asn Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr
165 170 175
Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala
180 185 190
Asn Ile Gly Gly Val Thr Ile Ala Glu Trp Val Lys Ala His Pro Glu
195 200 205
Ile Lys Glu Asp Lys Leu Val Lys Met Phe Glu Asp Val Arg Asp Ala
210 215 220
Ala Tyr Glu Ile Ile Lys Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala
225 230 235 240
Thr Ala Leu Ala Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala
245 250 255
Val Leu Pro Leu Ser Val Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp
260 265 270
Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Gln Asn
275 280 285
Ile Leu Glu Ile Pro Leu Thr Asp His Glu Glu Glu Ser Met Gln Lys
290 295 300
Ser Ala Ser Gln Leu Lys Lys Val Leu Thr Asp Ala Phe Ala Lys Asn
305 310 315 320
Asp Ile Glu Thr Arg Gln
325
Claims (7)
1.重组菌的构建方法,包括对大肠杆菌进行下述A1-A14的改造,得到所述重组菌;
A1、敲除所述大肠杆菌的poxB基因或抑制所述poxB基因的表达或抑制所述poxB基因编码的蛋白质的活性;
A2、敲除所述大肠杆菌的pflB基因或抑制所述pflB基因的表达或抑制所述pflB基因编码的蛋白质的活性;
A3、敲除所述大肠杆菌的aceEF基因或抑制所述aceEF基因的表达或抑制所述aceEF基因编码的蛋白质的活性;
A4、敲除所述大肠杆菌的ldhA基因或抑制所述ldhA基因的表达或抑制所述ldhA基因编码的蛋白质的活性;
A5、敲除所述大肠杆菌的lldD基因或抑制所述lldD基因的表达或抑制所述lldD基因编码的蛋白质的活性;
A6、增加所述大肠杆菌中acs基因编码蛋白质的含量;所述acs基因编码蛋白质为序列表中序列12所示的蛋白质;
A7、增加所述大肠杆菌中pta基因编码蛋白质的含量;所述pta基因编码蛋白质为序列表中序列14所示的蛋白质;
A8、增加所述大肠杆菌中ackA基因编码蛋白质的含量;所述ackA基因编码蛋白质为序列表中序列13所示的蛋白质;
A9、增加所述大肠杆菌中aceA基因编码蛋白质的含量;所述aceA基因编码蛋白质为序列表中序列15所示的蛋白质;
A10、增加所述大肠杆菌中aceK基因编码蛋白质的含量;所述aceK基因编码蛋白质为序列表中序列16所示的蛋白质;
A11、增加所述大肠杆菌中aceB基因编码蛋白质的含量;所述aceB基因编码蛋白质为序列表中序列17所示的蛋白质;
A12、增加所述大肠杆菌中maeA基因编码蛋白质的含量;所述maeA基因编码蛋白质为序列表中序列18所示的蛋白质;
A13、增加所述大肠杆菌中maeB基因编码蛋白质的含量;所述maeB基因编码蛋白质为序列表中序列19所示的蛋白质;
A14、增加所述大肠杆菌中ldh2基因编码蛋白质的含量;所述ldh2基因编码蛋白质为序列表中序列20所示的蛋白质;
所述大肠杆菌为含有所述poxB基因、所述pflB基因、所述aceEF基因、所述ldhA基因和所述lldD基因的大肠杆菌MG1655。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
A1通过向所述大肠杆菌中导入含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A2通过向所述大肠杆菌中导入含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A3通过向所述大肠杆菌中导入含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A4通过向所述大肠杆菌中导入含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A5通过向所述大肠杆菌中导入含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段实现;
和/或,A6通过向所述大肠杆菌中导入含有所述acs基因的acs基因表达盒实现;
和/或,A7通过向所述大肠杆菌中导入含有所述pta基因的pta基因表达盒实现;
和/或,A8通过向所述大肠杆菌中导入含有所述ackA基因的ackA基因表达盒实现;
和/或,A9通过向所述大肠杆菌中导入含有所述aceA基因的aceA基因表达盒实现;
和/或,A10通过向所述大肠杆菌中导入含有所述aceK基因的aceK基因表达盒实现;
和/或,A11通过向所述大肠杆菌中导入含有所述aceB基因的aceB基因表达盒实现;
和/或,A12通过向所述大肠杆菌中导入含有所述maeA基因的maeA基因表达盒实现;
和/或,A13通过向所述大肠杆菌中导入含有所述maeB基因的maeB基因表达盒实现;
和/或,A14通过向所述大肠杆菌中导入含有所述ldh2基因的ldh2基因表达盒实现。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:
所述含有所述poxB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列8所示的DNA分子;
所述含有所述pflB基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列9所示的DNA分子;
所述含有所述aceEF基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列7所示的DNA分子;
所述含有所述ldhA基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列10所示的DNA分子;
所述含有所述lldD基因上下游同源臂的DNA片段为序列表中序列11所示的DNA分子;
和/或,所述acs基因表达盒、所述pta基因表达盒、所述ackA基因表达盒、所述aceA基因表达盒、所述aceK基因表达盒、所述aceB基因表达盒、所述maeA基因表达盒、所述maeB基因表达盒和所述ldh2基因表达盒中启动子为序列表中序列1的第9-51位所示的DNA分子;
和/或,所述acs基因表达盒中所述acs基因为序列表中序列1的第70-2028位所示的DNA分子;
和/或,所述pta基因表达盒中所述pta基因为序列表中序列2的第1347-3491位所示的DNA分子;
和/或,所述ackA基因表达盒中所述ackA基因为序列表中序列2的第70-1272位所示的DNA分子;
和/或,所述aceA基因表达盒中所述aceA基因为序列表中序列3的第70-1374位所示的DNA分子;
和/或,所述aceK基因表达盒中所述aceK基因为序列表中序列3的第1436-3172位所示的DNA分子;
和/或,所述aceB基因表达盒中所述aceB基因为序列表中序列4的第70-1671位所示的DNA分子;
和/或,所述maeA基因表达盒中所述maeA基因为序列表中序列5的第70-1767位所示的DNA分子;
和/或,所述maeB基因表达盒中所述maeB基因为序列表中序列5的第1791-4070位所示的DNA分子;
和/或,所述ldh2基因表达盒中所述ldh2基因为序列表中序列6的第70-1050位所示的DNA分子。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:
所述acs基因表达盒为序列表中序列1的第9-2028位所示的DNA分子;
所述pta基因表达盒和所述ackA基因表达盒为序列中序列2的第9-3491位所示的DNA分子;
所述aceA基因表达盒和所述aceK基因表达盒为序列表中序列3的第9-3172位所示的DNA分子;
所述aceB基因表达盒为序列表中序列4的第9-1671位所示的DNA分子;
所述maeA基因表达盒和所述maeB基因表达盒为序列表中序列5的第9-4070位所示的DNA分子;
所述ldh2基因表达盒为序列表中序列6的第9-1050位所示的DNA分子。
5.利用权利要求1-4中任一所述方法制备的重组菌。
6.利用权利要求1-4中任一所述方法制备的重组菌的下述任一应用:
X1、生产L-乳酸;
X2、制备生产L-乳酸产品;
X3、降解乙酸;
X4、制备降解乙酸产品。
7.L-乳酸的制备方法,包括:以乙酸为碳源,利用权利要求1-4中任一所述的方法制备的重组菌进行生物转化,制备得到L-乳酸。
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