CN107603998B - 利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明所提供的制备用于生产乙醇酸的工程菌的方法，包括如下步骤：提高受体菌中乙酰辅酶A合成酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶、乙醛酸还原酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中苹果酸合酶、乙醇酸氧化酶和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产乙醇酸的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌。本发明制备的重组菌能以乙酸为碳源生产乙醇酸，且在摇瓶培养中的乙醇酸的产量和得率能达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。

Description

利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术、基因工程和发酵工程领域，涉及利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

乙醇酸(Glycolic acid)，又名羟基乙酸，是羟基羧酸家族中的最简单成员。乙醇酸是兼具醇和中等强酸功能的一个小分子，是一种重要的有机合成原料。乙醇酸在化工、医药、纺织和冶金等多个领域有广泛应用。例如，2％乙醇酸和1％甲酸的混合酸是一种高效低成本的清洗剂，可用于锅炉、管道、冷凝器和热交换器等的清洗；乙醇酸分子小，能有效渗透毛孔，解决皮肤老化、皱纹和暗疮等问题，常用作化妆品添加剂；纺织行业中常用乙醇酸作为染整羊毛纤维及纤维素织品的交联耦合剂；另外，乙醇酸还可用作杀菌剂、粘接剂、石油破乳剂、焊接剂以及化学助剂等。

在自然界中，乙醇酸存在于甘蔗、甜菜以及未成熟的葡萄汁中，含量低且与多种物质共存，分离纯化较为困难。工业上普遍采用化学合成的方法获得乙醇酸，其制备方法有氯乙酸法、甲醛羰基化法和氰化法等。化学合成法生产乙醇酸工艺较为成熟，是目前普遍应用的工业化制备工艺，但是存在原料毒性大(甲醛、一氧化碳、氰化物等)、生产条件苛刻(强酸或强碱、高温高压)、反应设备要求高、分离纯化复杂和环境污染等问题，不符合当前低碳、环保、可持续的发展理念，迫切需要开发新的绿色合成路线和工艺。

腈水解酶能催化羟基乙腈的水解生成乙醇酸，Acidovorax facilis、Rhodococcusrhodochrous和Brevibacterium casei等微生物中的腈水解酶具有该活性，这使得酶法合成乙醇酸得以实现。酶法合成具有反应条件温和、设备要求较低和所得产品浓度较高等优点，但在原料方面，羟基乙腈来源于甲醛和氢氰酸等石油化工产品，并且属于B类有机剧毒物品，不利于大规模工业化生产。

乙二醇能在乳醛还原酶和乙醇醛脱氢酶的作用下发生两步氧化反应生成乙醇酸。Kataoka等筛选到两株能够氧化乙二醇生成乙醇酸的微生物——Pichia naganishii AKU4267和Rhodotorula sp.3Pr-126，以10％的乙二醇为底物，能分别获得35.3g/L和25.1g/L的乙醇酸(Kataoka,M.,Sasaki,M.,Hidalgo,A.,Nakano,M.,Shimizu,S.,2001.Glycolicacid production using ethylene glycol-oxidizing microorganisms.Biosci.Biotechnol.Biochem.65,2265-2270)。Wei等利用Gluconobacter oxydans静息细胞转化乙二醇合成乙醇酸，48h乙二醇转化率达86.7％，乙醇酸产量为70.2g/L(Wei,G.D.,Yang,X.P.,Gan,T.L.,Zhou,W.Y.,Lin,J.P.,Wei,D.Z.,2009.High cell density fermentation ofGluconobacter oxydans DSM 2003for glycolic acid production.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36,1029-1034)。作为一种化工产品，乙二醇主要来自于不可再生的石油资源，利用其作为底物来合成乙醇酸不完全符合可持续发展的要求。

通过微生物发酵的方法利用可再生生物质资源来获得乙醇酸，能够避免化学法与酶法合成的弊端，符合未来绿色化工发展的要求。目前，已经有研究报道了利用葡萄糖和木糖等为底物的乙醇酸合成途径和生产菌株，但原料成本高等问题依旧有待解决。

寻找来源广泛、成本低廉的原料，通过微生物发酵法生产乙醇酸，具有良好的工业应用前景。乙酸、甲烷、甲醇和合成气等非传统碳源在发酵工业中的应用还不多见，该类碳源与传统的葡萄糖等碳水化合物等相比，成本较低且容易获取，其开发和应用正逐渐成为工业生物技术中有良好应用前景的热点领域。大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和酵母微生物可以利用乙酸作为碳源生长。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用。

本发明所提供的制备用于生产乙醇酸的工程菌的方法，包括如下步骤：提高受体菌中乙酰辅酶A合成酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶、乙醛酸还原酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中苹果酸合酶、乙醇酸氧化酶和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产乙醇酸的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌。

其中，所述乙酰辅酶A合成酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列10或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述磷酸转乙酰酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列11或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述乙酸激酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列12或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述柠檬酸合酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列13或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述异柠檬酸裂解酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列14或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述异柠檬酸脱氢酶激酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列15或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述乙醛酸还原酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列16或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述苹果酸合酶为苹果酸合酶1和/或苹果酸合酶2；所述苹果酸合酶1的氨基酸序列具体可为序列表中序列17或保有功能的随机或/和定点诱变序列；所述苹果酸合酶2的氨基酸序列具体可为序列表中序列18或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述乙醇酸氧化酶的氨基酸序列具体可为序列表中序列19或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的氨基酸序列具体可为序列表中序列20或保有功能的随机或/和定点诱变序列。

在本发明中，所述“提高受体菌中乙酰辅酶A合成酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶、乙醛酸还原酶的表达和/或活性”具体是通过向所述受体菌中导入乙酰辅酶A合成酶的编码基因(acs)、磷酸转乙酰酶的编码基因(pta)、乙酸激酶的编码基因(ackA)、柠檬酸合酶的编码基因(gltA)、异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)、异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因(aceK)和乙醛酸还原酶的编码基因(ycdW)来实现的。所述“降低所述受体菌中苹果酸合酶、乙醇酸氧化酶和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的表达和/或活性”是通过敲除所述受体菌中苹果酸合酶的编码基因(aceB、glcB)、乙醇酸氧化酶的编码基因(glcD)和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因(iclR)的编码基因来实现的。

在本发明中，所述乙酰辅酶A合成酶的编码基因(acs)的核苷酸序列具体为序列表中序列2的第70-2028位或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述磷酸转乙酰酶的编码基因(pta)的核苷酸序列为序列表中序列3的第1347-3491位或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述乙酸激酶的编码基因(ackA)的核苷酸序列为序列表中序列3的第70-1272位或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述柠檬酸合酶的编码基因(gltA)的核苷酸序列为序列表中序列1的第70-1353位或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)的核苷酸序列为序列表中序列5的第70-1374位或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因(aceK)的核苷酸序列为序列表中序列5的第1557-3293位或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述乙醛酸还原酶的编码基因(ycdW)的核苷酸序列为序列表中序列4的第70-1008位或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述苹果酸合酶1的编码基因(aceB)的核苷酸序列为序列表中序列21或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述苹果酸合酶2的编码基因(glcB)的核苷酸序列为序列表中序列22或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述乙醇酸氧化酶的编码基因(glcD)的核苷酸序列为序列表中序列23或保有功能的随机或/和定点诱变序列。所述异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因(iclR)的核苷酸序列为序列表中序列24或保有功能的随机或/和定点诱变序列。

进一步，在本发明中，所述乙酰辅酶A合成酶的编码基因(acs)是通过含有“启动子-乙酰辅酶A合成酶的编码基因”结构的DNA分子导入到所述受体菌中的；所述含有“启动子-乙酰辅酶A合成酶的编码基因”结构的DNA分子如序列表中序列2所示。所述磷酸转乙酰酶的编码基因(pta)和所述乙酸激酶的编码基因(ackA)是通过含有“启动子-乙酸激酶的编码基因-磷酸转乙酰酶的编码基因”结构的DNA分子导入到所述受体菌中的；所述含有“启动子-乙酸激酶的编码基因-磷酸转乙酰酶的编码基因”结构的DNA分子如序列表中序列3所示。所述柠檬酸合酶的编码基因(gltA)是通过含有“启动子-柠檬酸合酶的编码基因”结构的DNA分子导入到所述受体菌中的；所述含有“启动子-柠檬酸合酶的编码基因”结构的DNA分子如序列表中序列1所示。所述异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)和所述异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因(aceK)是通过含有“启动子-异柠檬酸裂解酶的编码基因-异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因”结构的DNA分子导入到所述受体菌中的；所述含有“启动子-异柠檬酸裂解酶的编码基因-异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因”结构的DNA分子如序列表中序列5所示。所述乙醛酸还原酶的编码基因(ycdW)是通过含有“启动子-乙醛酸还原酶的编码基因”结构的DNA分子导入到所述受体菌中的；所述含有“启动子-乙醛酸还原酶的编码基因”结构的DNA分子如序列表中序列4所示。所述苹果酸合酶1的编码基因(aceB)是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列6。所述苹果酸合酶2的编码基因(glcB)是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列7。所述乙醇酸氧化酶的编码基因(glcD)是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列8。所述异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因(iclR)是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列9。

更加具体的，在本发明中，所述乙酰辅酶A合成酶的编码基因(acs)、所述磷酸转乙酰酶的编码基因(pta)、所述乙酸激酶的编码基因(ackA)和所述柠檬酸合酶的编码基因(gltA)是通过重组表达载体1导入到所述受体菌中的；所述异柠檬酸裂解酶的编码基因(aceA)、所述异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因(aceK)和所述乙醛酸还原酶的编码基因(ycdW)是通过重组表达载体2导入到所述受体菌中的。所述重组表达载体1为将序列表中序列2的第9-2028位所示DNA片段替换pUC19质粒的酶切位点KpnI和XbaI之间的小片段，同时将序列表中序列3的第9-3491所示DNA片段替换pUC19质粒的酶切位点XbaI和HindIII之间的小片段，同时将序列表中序列1的第9-1353所示DNA片段替换pUC19质粒的酶切位点SacI和KpnI之间的小片段后得到的重组质粒。所述重组表达载体2为将序列表中序列5的第9-3293位所示DNA片段替换pBBR1MCS-2质粒的酶切位点EcoRI和BamHI之间的小片段，同时序列表中序列4的第9-1008位所示DNA片段替换pBBR1MCS-2质粒的酶切位点XhoI和EcoRI之间的小片段后得到的重组质粒。

在所述方法中，所述受体菌具体可为大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌或酵母菌。

在本发明的一个实施例中，所述受体菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌E.coliMG1655。

由前文所述方法制备得到的用于生产乙醇酸的工程菌也属于本发明的保护范围。

所述工程菌在以乙酸作为底物生产乙醇酸中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的生产乙醇酸的方法，具体包括如下步骤：以乙酸作为碳源，发酵培养所述工程菌，收集发酵产物，从中获得乙醇酸。

其中，所述发酵培养的条件可为：37℃瓶震荡培养24-72h(如48h)。摇瓶的转速具体可为200rpm。所采用的培养基可为MM液体培养基。

所述MM液体培养基的组成如下：每升培养基含10g乙酸、2g NH₄Cl、5.0g(NH₄)₂SO₄、6.0g KH₂PO₄、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素、0.05g卡那霉素、2g酵母粉，余量为水。

所述微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl₂·4H₂O、5gCaCl₂·2H₂O、1.3g MnCl₂·2H₂O、0.38g CuCl₂·2H₂O、0.5g CoCl₂·6H₂O、0.94g ZnCl₂、0.0311g H₃BO₃、0.4g Na₂EDTA·2H₂O、1.01g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。

本发明的有益效果：本发明通过在大肠杆菌中表达7个代谢途径相关的基因和敲除4个内源基因，获得了能够以乙酸为碳源，发酵获得乙醇酸的工程菌株，并且重组菌在摇瓶培养中的乙醇酸的产量和得率能达到较高的水平，具有较好的工业化应用前景。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中涉及分子生物学操作所用的酶，均购于NEB(New England Biolabs，http://www.neb-china.com/)公司；质粒提取和DNA片段回收所用的试剂盒，均购于北京博迈德基因技术有限公司(http://www.biomed168.com/)；实施例中涉及的DNA合成和测序工作，由北京博迈德基因技术有限公司完成。

E.coli MG1655：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，TheColi Genetic Stock Center(http://cgsc2.biology.yale.edu/)获得，编号CGSC#6300。

E.coli NEB 5-alpha：公众可以从NEB(New England Biolabs)公司获得，货号C2987I。

质粒pKD13：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center获得，编号CGSC#7633。

质粒pKD46：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center获得，编号CGSC#7739。

质粒pCP20：公众可以从E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The ColiGenetic Stock Center获得，编号CGSC#7637。

质粒pBBR1MCS-2：公众可根据NCBI accession number U23751.1的序列自行提交基因合成公司获得，该质粒记载在如下文献中：Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistancecassettes,1995,Gene,166:175-176。

质粒pUC19：公众可以从NEB(New England Biolabs)公司获得，货号N3041S。

MM液体培养基的组成如下：每升培养基含10g乙酸、2g NH₄Cl、5.0g(NH₄)₂SO₄、6.0gKH₂PO₄、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨苄青霉素、0.05g卡那霉素、2g酵母粉，余量为水。

其中，微量元素溶液的组成如下：每升微量元素溶液含3.6g FeCl₂·4H₂O、5gCaCl₂·2H₂O、1.3g MnCl₂·2H₂O、0.38g CuCl₂·2H₂O、0.5g CoCl₂·6H₂O、0.94g ZnCl₂、0.0311g H₃BO₃、0.4g Na₂EDTA·2H₂O、1.01g thiamine-HCl，其余为0.5M HCl。

实施例1、构建重组菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)

一、重组表达载体pUC19-gltA-acs-pta-ackA的构建

1、人工合成序列表中序列1所示的DNA，含有gltA基因，上游为SacI位点，下游为KpnI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1353位核苷酸为gltA基因序列。

2、人工合成序列表中序列2所示的DNA，含有acs基因，上游为KpnI位点，下游为XbaI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-2028位核苷酸为acs基因序列。

3、人工合成序列表中序列3所示的DNA，含有pta-ackA基因，上游为XbaI位点，下游为HindIII位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1272位核苷酸为ackA基因序列，第1347-3491位核苷酸为pta基因序列。

4、用SacI和KpnI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为1351bp的DNA片段；用SacI和KpnI双酶切载体pUC19，回收大小为2680bp的DNA片段；将上述1351bp和2680bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用SacI和KpnI进行酶切验证，酶切产物大小为1351bp和2680bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-gltA。将得到的重组质粒pUC19-gltA进行测序验证，结果表明：在质粒pUC19-gltA的SacI和KpnI酶切位点间***了如序列表中序列1的第9-1353位所示的DNA序列，表明质粒正确。

5、用KpnI和XbaI双酶切步骤2中合成的DNA序列，回收大小为2026bp的DNA片段；用KpnI和XbaI双酶切载体pUC19，回收大小为2671bp的DNA片段；将上述2026bp和2671bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用KpnI和XbaI进行酶切验证，酶切产物大小约为2026bp和2671bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-acs。将得到的重组质粒pUC19-acs进行测序验证，结果表明：在质粒pUC19-acs的KpnI和XbaI酶切位点间***了如序列表中序列2的第9-2028位所示的DNA序列，表明质粒正确。

6、用XbaI和HindIII双酶切步骤3中合成的DNA序列，回收大小为3489bp的DNA片段；用XbaI和HindIII双酶切载体pUC19，回收大小为2662bp的DNA片段；将上述3489bp和2662bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和HindIII进行酶切验证，酶切产物大小为3489bp和2662bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-pta-ackA。将得到的重组质粒pUC19-pta-ackA进行测序验证，结果表明：在质粒pUC19-pta-ackA的XbaI和HindIII酶切位点间***了如序列表中序列3的第9-3491位所示的DNA序列，表明质粒正确。

7、用KpnI和XbaI双酶切步骤4中得到的DNA序列pUC19-gltA，回收大小为4020bp的DNA片段；用KpnI和XbaI双酶切步骤5中得到的DNA序列pUC19-acs，回收大小为2022bp的DNA片段；将上述4020bp和2022bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用KpnI和XbaI进行酶切验证，酶切产物大小为4020bp和2022bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-gltA-acs。将得到的重组质粒pUC19-gltA-acs进行测序验证，结果表明：在质粒pUC19-gltA-acs的KpnI和XbaI酶切位点间***了acs的DNA序列，表明质粒正确。

8、用XbaI和HindIII双酶切步骤4中得到的DNA序列pUC19-gltA，回收大小为4007bp的DNA片段；用XbaI和HindIII双酶切步骤6中得到的DNA序列pUC19-pta-ackA，回收大小为3489bp的DNA片段；将上述4007bp和3489bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用EcoRI和XhoI进行酶切验证，酶切产物大小为4007bp和3489bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-gltA-pta-ackA。将得到的重组质粒pUC19-gltA-pta-ackA进行测序验证，结果表明：在质粒pUC19-gltA-pta-ackA的XbaI和HindIII酶切位点间***了pta-ackA片段，表明质粒正确。

9、用XbaI和HindIII双酶切步骤7中得到的DNA序列pUC19-gltA-acs，回收大小为6018bp的DNA片段；用XbaI和HindIII双酶切步骤6中得到的DNA序列pUC19-pta-ackA，回收大小为3489bp的DNA片段；将上述6018bp和3489bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有氨苄霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XbaI和HindIII进行酶切验证，酶切产物大小为6018bp和3489bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pUC19-gltA-acs-pta-ackA。将得到的重组质粒pUC19-gltA-acs-pta-ackA进行测序验证，结果表明：在质粒pUC19-gltA-acs-pta-ackA的XbaI和HindIII酶切位点间***了pta-ackA片段，表明质粒正确。

质粒pUC19-gltA-acs-pta-ackA的结构描述为：将序列表中序列2的第9-2028位所示DNA片段替换pUC19质粒的酶切位点KpnI和XbaI之间的小片段，同时将序列表中序列3的第9-3491所示DNA片段替换pUC19质粒的酶切位点XbaI和HindIII之间的小片段，同时将序列表中序列1的第9-1353所示DNA片段替换pUC19质粒的酶切位点SacI和KpnI之间的小片段后得到的重组质粒。

二、重组表达载体pMCS-ycdW-aceAK的构建

1、人工合成序列表中序列4所示的DNA，含有ycdW基因，上游为XhoI位点，下游为EcoRI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1008位核苷酸为ycdW基因序列。

2、人工合成序列表中序列5所示的DNA，含有aceA-aceK基因，上游为EcoRI位点，下游为BamHI位点，其中第9-51位核苷酸为启动子序列，第70-1374位核苷酸为aceA基因序列，第1557-3293位核苷酸为aceK基因序列。

3、用XhoI和EcoRI双酶切步骤1中合成的DNA序列，回收大小为1006bp的DNA片段；用XhoI和EcoRI双酶切载体pBBR1MCS-2，回收大小为5111bp的DNA片段；将上述1006bp和5111bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用XhoI和EcoRI进行酶切验证，酶切产物大小为1006bp和5111bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-ycdW。将得到的重组质粒pMCS-ycdW进行测序验证，结果表明：在质粒pBBR1MCS-2的XhoI和EcoRI酶切位点间***了如序列表中序列4的第9-1008位所示的DNA序列，表明质粒正确。

4、用EcoRI和BamHI双酶切步骤2中合成的DNA序列，回收大小为3291bp的DNA片段；用EcoRI和BamHI双酶切步骤3中得到的DNA序列pMCS-ycdW，回收大小为6099bp的DNA片段；将上述3291bp和6099bp的两个DNA片段连接，得到连接产物通过化学转化的方法导入到E.coli NEB 5-alpha中，并涂布于含有卡那青霉素的LB固体培养基，37℃培养16h，得到转化子。提取转化子的质粒，用EcoRI和BamHI进行酶切验证，酶切产物大小为3291bp和6099bp的质粒为阳性质粒，将此重组质粒命名为pMCS-ycdW-aceAK。将得到的重组质粒pMCS-ycdW-aceAK进行测序验证，结果表明：在质粒pMCS-ycdW-aceAK的EcoRI和BamHI酶切位点间***了如序列表中序列5的第9-3293位所示的DNA序列，表明质粒正确。

质粒pMCS-ycdW-aceAK的结构描述为：将序列表中序列4的第9-1008位所示DNA片段替换pBBR1MCS-2质粒的酶切位点XhoI和EcoRI之间的小片段，同时序列表中序列5的第9-3293位所示DNA片段替换pBBR1MCS-2质粒的酶切位点EcoRI和BamHI之间的小片段后得到的重组质粒。

三、大肠杆菌E.coliΔGA4的构建

1、敲除aceB基因

1)合成aceB基因敲除所用的引物aceBF和aceBR，序列如下：

aceBF：

5’-ATGACTGAACAGGCAACAACAACCGATGAACTGGCTTTCACAAGGCCGTATGGCGAGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

aceBR：

5’-TTTAATCAACAGGCGTGAGTAAGCATTCAGGAATGGTTTATCCATCGTCACTGCCTGTCTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。

2)以质粒pKD13为模板，采用引物aceBF和aceBR，PCR扩增得到1500bp左右的DNA片段，命名为aceB同源重组片段，琼脂糖凝胶电泳对得到的DNA片段进行纯化。

经过测序，aceB同源重组片段的核苷酸序列为序列6，其中，第1-60位为aceB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为aceB基因下游同源臂。

3)利用电转化的方法将pKD46转化至受体菌株E.coli MG1655中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养24h，得到转化子，提质粒验证，获得E.coli MG1655(pKD46)。

4)将E.coli MG1655(pKD46)接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养1h，加入***糖至终浓度5g/L，继续培养1.5h，接下来制备E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞，将步骤2)中获得的DNA片段转入E.coli MG1655(pKD46)的感受态细胞中，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h，得到转化子。

5)利用菌落PCR的方法，以aceBF和aceBR为引物，将PCR产物纯化之后测序，筛选正确的aceB基因已经被替换为Kan抗性基因的克隆，得到E.coli MG1655aceB-K(pKD46)。

6)将E.coli MG1655aceB-K(pKD46)接种于LB液体培养基中，42℃培养传代三次，除去pKD46质粒，得到E.coli MG1655aceB-K；E.coli MG1655aceB-K是aceB基因被Kan基因替换了的E.coli MG1655。

7)将E.coli MG1655aceB-K接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h，制备E.coli MG1655aceB-K感受态细胞。

8)利用电转化的方法将pCP20转化到E.coli MG1655aceB-K感受态细胞中，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，30℃培养48h，得到转化子。

利用菌落PCR的方法验证转化子，以aceBF和aceBR为引物，得到202bp片段的为阳性克隆。

将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coli MG1655基因组上的aceB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，命名为突变体E.coliΔGA1。

2、敲除glcB基因

与上述1的方法基本相同，不同的是如下：

glcB敲除引物序列如下：

glcBF：

5’-ATGAGTCAAACCATAACCCAGAGCCGTTTACGCATTGACGCCAATTTTAAACGTTTTGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

glcBR：

5’-TTAATGACTTTC TTTTTC GCGTAAACGCCA GGCGTGTAATAACGGTTCGGTATAGCCGTTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

glcB同源重组片段的核苷酸序列为序列7，其中，第1-60位为glcB基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为glcB基因下游同源臂。

转化受体菌株为上述1得到的突变体E.coliΔGA1。

利用菌落PCR的方法验证转化子，以glcBF和glcBR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。

将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔGA1基因组上的glcB基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，命名为突变体E.coliΔGA2。

3、敲除glcD基因

与上述1的方法基本相同，不同的是如下：

glcD敲除引物序列如下：

glcDF：

5’-ATGAGCATCTTGTACGAAGAGCGTCTTGATGGCGCTTTACCCGATGTCGACCGCACATCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

glcDR：

5’-ACGTCAGACTCCACGCCGTCCAGCTCGCATAACAAAATCGCTTCGGCGTCGACGGGATAAATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

glcD同源重组片段的核苷酸序列为序列8，其中，第1-60位为glcD基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为glcD基因下游同源臂。

转化受体菌株为上述2得到的突变体E.coliΔGA2。

利用菌落PCR的方法验证转化子，以glcDF和glcDR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。

将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔGA2基因组上的glcD基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，命名为突变体E.coliΔGA3。

4、敲除iclR基因

与上述1的方法基本相同，不同的是如下：

iclR敲除引物序列如下：

iclRF：

5’-ATGGTCGCACCCATTCCCGCGAAACGCGGCAGAAAACCCGCCGTTGCCACCGCACCAGCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

iclRR：

5’-TCAGCGCATTCCACCGTACGCCAGCGTCACTTCCTTCGCCGCTTTAATCACCATCGCGCCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

iclR同源重组片段的核苷酸序列为序列9，其中，第1-60位为iclR基因上游同源臂，第61-1364位为FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位为iclR基因下游同源臂。

转化受体菌株为上述3得到的突变体E.coliΔGA3。

利用菌落PCR的方法验证转化子，以iclRF和iclRR为引物，得到202bp的片段阳性克隆。

将该阳性克隆送去测序，其为敲除E.coliΔGA3基因组上的iclR基因得到的菌，将该菌接种到LB液体培养基中，42℃传代三次，除去pCP20，命名为突变体E.coliΔGA4。

四、重组菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)的构建

1、将上述一得到的重组质粒pUC19-gltA-acs-pta-ackA和上述二得到的重组质粒pMCS-ycdW-aceAK通过电转化的方法转化到上述三得到的大肠杆菌E.coliΔGA4，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。

2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。

3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)。

E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)为将gltA、acs、pta、ackA、ycdW、aceA、aceK转入大肠杆菌E.coli MG1655中，且将敲除E.coli MG1655的基因组中的苹果酸合酶基因(aceB、glcB)、乙醇酸氧化酶基因(glcD)和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白基因(iclR)得到的重组菌。

五、对照菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA)的构建

1、将上述一得到的重组质粒pUC19-gltA-acs-pta-ackA通过电转化的方法转化到上述三得到的大肠杆菌E.coliΔGA4，并涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。

2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。

3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒的重组菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA)。

E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA)为将gltA、acs、pta、ackA转入大肠杆菌E.coliMG1655中，且将敲除E.coli MG1655的基因组中的苹果酸合酶基因(aceB、glcB)、乙醇酸氧化酶基因(glcD)和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白基因(iclR)得到的重组菌。

六、对照菌E.coliΔGA4(pMCS-ycdW-aceAK)的构建

1、将上述二得到的重组质粒pMCS-ycdW-aceAK通过电转化的方法转化到上述三得到的大肠杆菌E.coliΔGA4，并涂布于含有卡那青霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。

2、挑取单克隆于含有卡那青霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。

3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有质粒的重组菌E.coliΔGA4(pMCS-ycdW-aceAK)。

E.coliΔGA4(pMCS-ycdW-aceAK)为将ycdW、aceA、aceK转入大肠杆菌E.coliMG1655中，且将敲除E.coli MG1655的基因组中的苹果酸合酶基因(aceB、glcB)、乙醇酸氧化酶基因(glcD)和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白基因(iclR)得到的重组菌。

七、对照菌E.coli MG1655(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)的构建

1、将上述一得到的重组质粒pUC19-gltA-acs-pta-ackA和上述二得到的重组质粒pMCS-ycdW-aceAK通过电转化的方法转化到大肠杆菌E.coli MG1655，并涂布于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养24h。

2、挑取单克隆于含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养24h。

3、提取转化子的质粒，验证转化的正确性，得到含有两个质粒的重组菌E.coliMG1655(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)。

E.coli MG1655(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)为将gltA、acs、pta、ackA、ycdW、aceA、aceK转入大肠杆菌E.coli MG1655中得到的重组菌。

实施例2、重组菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)在生产乙醇酸中的应用

一、重组菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)摇瓶培养实验

1、将实施例1中四制备的E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。

2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MM液体培养基中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养48h，期间收集发酵液。

3、通过高效液相色谱对基因工程菌产生的乙醇酸和消耗的乙酸进行定量检测。具体条件如下：

仪器：岛津公司Essentia LC系列HPLC仪，配有DGU-20A脱气机，LC-16送液泵，SIL-16型自动进样器，RID-20A检测器。

色谱条件：Bio-Rad

HPX-87H(7.8×300mm)；流速0.50mL/min；柱温37℃；流动相为5mM硫酸水溶液。

检测方法：

取0、1、2、3、4、5g/L的乙醇酸标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号79141)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的乙醇酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同浓度浓度为横坐标，绘制标准曲线。乙醇酸的出峰时间为12.914min。取0、2、4、6、8、10g/L的乙酸标准品水溶液(Sigma-Aldrich，产品编号64197)，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测，用不同浓度的乙酸标准溶液的色谱峰面积为纵坐标，不同浓度为横坐标，绘制标准曲线。乙酸的出峰时间为15.690min。

取2mL的发酵液，于12000rpm离心10min，将其发酵上清液转移到新的离心管内，用0.22μm微孔滤膜过滤，进样10μL，进行HPLC检测。

将待测样品发酵上清液的乙醇酸色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的乙醇酸含量。将待测样品发酵上清液的乙酸色谱峰面积代入上述标准曲线中，计算得到待测样品发酵上清液的残留乙酸含量，将接种后初始的乙酸含量减去发酵上清液中的残留乙酸含量得到重组菌消耗的乙酸量。

E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)在摇瓶培养中的乙醇酸产量和乙酸消耗如表1所示：

表1E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)在摇瓶培养中的乙醇酸产量和乙酸消耗

注：表中数据为三次以上重复实验所得的均值。

由表1中的结果可以看出，本发明构建的重组菌株能够在添加乙酸为碳源的培养基中，发酵获得乙醇酸，最终乙醇酸产量为4.30g/L，得率为0.76g/g，约为理论得率的60％。

二、对照菌E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA)的摇瓶培养实验

1、将实施例1中五制备的E.coliΔGA4(pUC19-gltA-acs-pta-ackA)在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。

2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MM液体培养基(含氨苄青霉素，不含卡那霉素)中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养48h，期间收集发酵液。

3、经过HPLC检测，具体条件上述一中3所述，发现48h乙醇酸的积累量为0.16g/L，表明将gltA、acs、pta、ackA转入大肠杆菌中，同时敲除aceB、glcB、glcD和iclR得到的重组菌，所得到的重组菌以乙酸为底物，虽然能合成乙醇酸，但是产量很低。

三、对照菌E.coliΔGA4(pMCS-ycdW-aceAK)的摇瓶培养实验

1、将实施例1中六制备的E.coliΔGA4(pMCS-ycdW-aceAK)在含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。

2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MM液体培养基(含卡那霉素，不含氨苄青霉素)中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养48h，期间收集发酵液。

3、经过HPLC检测，具体条件上述一中3所述，发现乙醇酸的积累为3.33g/L，表明将ycdW、aceA、aceK转入大肠杆菌E.coli MG1655中，同时敲除aceB、glcB、glcD和iclR得到的重组菌，所得到的重组菌以乙酸为底物，可以合成较多的乙醇酸，但与实施例1中四制备的重组菌还有一定差距。

四、对照菌E.coli MG1655(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)的摇瓶培养实验

1、将实施例1中七制备的E.coli MG1655(pUC19-gltA-acs-pta-ackA+pMCS-ycdW-aceAK)在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、转速200rpm条件下培养16h，作为种子液。

2、按体积比4％的接种量，将种子液接种到MM液体培养基(含氨苄青霉素和卡那霉素)中，500ml摇瓶中装液量为50ml，于37℃、转速200rpm条件下培养72h，期间收集发酵液。

3、经过HPLC检测，具体条件上述一的3所述，发现乙醇酸的积累量为1.6g/L，表明将gltA、acs、pta、ackA、ycdW、aceA、aceK转入大肠杆菌E.coli MG1655中，所得到的重组菌以乙酸为底物，虽然能合成乙醇酸，但是产量较低。

<110> 北京化工大学

<120> 利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用

<130> GNCLN171814

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1361

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aagagctctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tggctgatac aaaagcaaaa ctcaccctca acggggatac agctgttgaa 120

ctggatgtgc tgaaaggcac gctgggtcaa gatgttattg atatccgtac tctcggttca 180

aaaggtgtgt tcacctttga cccaggcttc acttcaaccg catcctgcga atctaaaatt 240

acttttattg atggtgatga aggtattttg ctgcaccgcg gtttcccgat cgatcagctg 300

gcgaccgatt ctaactacct ggaagtttgt tacatcctgc tgaatggtga aaaaccgact 360

caggaacagt atgacgaatt taaaactacg gtgacccgtc ataccatgat ccacgagcag 420

attacccgtc tgttccatgc tttccgtcgc gactcgcatc caatggcagt catgtgtggt 480

attaccggcg cgctggcggc gttctatcac gactcgctgg atgttaacaa tcctcgtcac 540

cgtgaaattg ccgcgttccg cctgctgtcg aaaatgccga ccatggccgc gatgtgttac 600

aagtattcca ttggtcagcc atttgtttac ccgcgcaacg atctctccta cgccggtaac 660

ttcctgaata tgatgttctc cacgccgtgc gaaccgtatg aagttaatcc gattctggaa 720

cgtgctatgg accgtattct gatcctgcac gctgaccatg aacagaacgc ctctacctcc 780

accgtgcgta ccgctggctc ttcgggtgcg aacccgtttg cctgtatcgc agcaggtatt 840

gcttcactgt ggggacctgc gcacggcggt gctaacgaag cggcgctgaa aatgctggaa 900

gaaatcagct ccgttaaaca cattccggaa tttgttcgtc gtgcgaaaga caaaaatgat 960

tctttccgcc tgatgggctt cggtcaccgc gtgtacaaaa attacgaccc gcgcgccacc 1020

gtaatgcgtg aaacctgcca tgaagtgctg aaagagctgg gcacgaagga tgacctgctg 1080

gaagtggcta tggagctgga aaacatcgcg ctgaacgacc cgtactttat cgagaagaaa 1140

ctgtacccga acgtcgattt ctactctggt atcatcctga aagcgatggg tattccgtct 1200

tccatgttca ccgtcatttt cgcaatggca cgtaccgttg gctggatcgc ccactggagc 1260

gaaatgcaca gtgacggtat gaagattgcc cgtccgcgtc agctgtatac aggatatgaa 1320

aaacgcgact ttaaaagcga tatcaagcgt taaggtacca a 1361

<210> 2

<211> 2036

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

aaggtacctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tgagccaaat tcacaaacac accattcctg ccaacatcgc agaccgttgc 120

ctgataaacc ctcagcagta cgaggcgatg tatcaacaat ctattaacgt acctgatacc 180

ttctggggcg aacagggaaa aattcttgac tggatcaaac cttaccagaa ggtgaaaaac 240

acctcctttg cccccggtaa tgtgtccatt aaatggtacg aggacggcac gctgaatctg 300

gcggcaaact gccttgaccg ccatctgcaa gaaaacggcg atcgtaccgc catcatctgg 360

gaaggcgacg acgccagcca gagcaaacat atcagctata aagagctgca ccgcgacgtc 420

tgccgcttcg ccaataccct gctcgagctg ggcattaaaa aaggtgatgt ggtggcgatt 480

tatatgccga tggtgccgga agccgcggtt gcgatgctgg cctgcgcccg cattggcgcg 540

gtgcattcgg tgattttcgg cggcttctcg ccggaagccg ttgccgggcg cattattgat 600

tccaactcac gactggtgat cacttccgac gaaggtgtgc gtgccgggcg cagtattccg 660

ctgaagaaaa acgttgatga cgcgctgaaa aacccgaacg tcaccagcgt agagcatgtg 720

gtggtactga agcgtactgg cgggaaaatt gactggcagg aagggcgcga cctgtggtgg 780

cacgacctgg ttgagcaagc gagcgatcag caccaggcgg aagagatgaa cgccgaagat 840

ccgctgttta ttctctacac ctccggttct accggtaagc caaaaggtgt gctgcatact 900

accggcggtt atctggtgta cgcggcgctg acctttaaat atgtctttga ttatcatccg 960

ggtgatatct actggtgcac cgccgatgtg ggctgggtga ccggacacag ttacttgctg 1020

tacggcccgc tggcctgcgg tgcgaccacg ctgatgtttg aaggcgtacc caactggccg 1080

acgcctgccc gtatggcgca ggtggtggac aagcatcagg tcaatattct ctataccgca 1140

cccacggcga tccgcgcgct gatggcggaa ggcgataaag cgatcgaagg caccgaccgt 1200

tcgtcgctgc gcattctcgg ttccgtgggc gagccaatta acccggaagc gtgggagtgg 1260

tactggaaaa aaatcggcaa cgagaaatgt ccggtggtcg atacctggtg gcagaccgaa 1320

accggcggtt tcatgatcac cccgctgcct ggcgctaccg agctgaaagc cggttcggca 1380

acacgtccgt tcttcggcgt gcaaccggcg ctggtcgata acgaaggtaa cccgctggag 1440

ggggccaccg aaggtagcct ggtaatcacc gactcctggc cgggtcaggc gcgtacgctg 1500

tttggcgatc acgaacgttt tgaacagacc tacttctcca ccttcaaaaa tatgtatttc 1560

agcggcgacg gcgcgcgtcg cgatgaagat ggctattact ggataaccgg gcgtgtggac 1620

gacgtgctga acgtctccgg tcaccgtctg gggacggcag agattgagtc ggcgctggtg 1680

gcgcatccga agattgccga agccgccgta gtaggtattc cgcacaatat taaaggtcag 1740

gcgatctacg cctacgtcac gcttaatcac ggggaggaac cgtcaccaga actgtacgca 1800

gaagtccgca actgggtgcg taaagagatt ggcccgctgg cgacgccaga cgtgctgcac 1860

tggaccgact ccctgcctaa aacccgctcc ggcaaaatta tgcgccgtat tctgcgcaaa 1920

attgcggcgg gcgataccag caacctgggc gatacctcga cgcttgccga tcctggcgta 1980

gtcgagaagc tgcttgaaga gaagcaggct atcgcgatgc catcgtaatc tagaaa 2036

<210> 3

<211> 3499

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

aatctagatt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tgtcgagtaa gttagtactg gttctgaact gcggtagttc ttcactgaaa 120

tttgccatca tcgatgcagt aaatggtgaa gagtaccttt ctggtttagc cgaatgtttc 180

cacctgcccg aagcacgtat caaatggaaa atggacggca ataaacagga agcggcttta 240

ggtgcaggcg ccgctcacag cgaagcgctc aactttatcg ttaatactat tctggcacaa 300

aaaccagaac tgtctgcgca gctgactgct atcggtcacc gtatcgtaca cggcggcgaa 360

aagtatacca gctccgtagt gatcgatgag tctgttattc agggtatcaa agatgcagct 420

tcttttgcac cgctgcacaa cccggctcac ctgatcggta tcgaagaagc tctgaaatct 480

ttcccacagc tgaaagacaa aaacgttgct gtatttgaca ccgcgttcca ccagactatg 540

ccggaagagt cttacctcta cgccctgcct tacaacctgt acaaagagca cggcatccgt 600

cgttacggcg cgcacggcac cagccacttc tatgtaaccc aggaagcggc aaaaatgctg 660

aacaaaccgg tagaagaact gaacatcatc acctgccacc tgggcaacgg tggttccgtt 720

tctgctatcc gcaacggtaa atgcgttgac acctctatgg gcctgacccc gctggaaggt 780

ctggtcatgg gtacccgttc tggtgatatc gatccggcga tcatcttcca cctgcacgac 840

accctgggca tgagcgttga cgcaatcaac aaactgctga ccaaagagtc tggcctgctg 900

ggtctgaccg aagtgaccag cgactgccgc tatgttgaag acaactacgc gacgaaagaa 960

gacgcgaagc gcgcaatgga cgtttactgc caccgcctgg cgaaatacat cggtgcctac 1020

actgcgctga tggatggtcg tctggacgct gttgtattca ctggtggtat cggtgaaaat 1080

gccgcaatgg ttcgtgaact gtctctgggc aaactgggcg tgctgggctt tgaagttgat 1140

catgaacgca acctggctgc acgtttcggc aaatctggtt tcatcaacaa agaaggtacc 1200

cgtcctgcgg tggttatccc aaccaacgaa gaactggtta tcgcgcaaga cgcgagccgc 1260

ctgactgcct gatttcacac cgccagctca gctggcggtg ctgttttgta acccgccaaa 1320

tcggcggtaa cgaaagagga taaaccatgt cccgtattat tatgctgatc cctaccggaa 1380

ccagcgtcgg tctgaccagc gtcagccttg gcgtgatccg tgcaatggaa cgcaaaggcg 1440

ttcgtctgag cgttttcaaa cctatcgctc agccgcgtac cggtggcgat gcgcccgatc 1500

agactacgac tatcgtgcgt gcgaactctt ccaccacgac ggccgctgaa ccgctgaaaa 1560

tgagctacgt tgaaggtctg ctttccagca atcagaaaga tgtgctgatg gaagagatcg 1620

tcgcaaacta ccacgctaac accaaagacg ctgaagtcgt tctggttgaa ggtctggtcc 1680

cgacacgtaa gcaccagttt gcccagtctc tgaactacga aatcgctaaa acgctgaatg 1740

cggaaatcgt cttcgttatg tctcagggca ctgacacccc ggaacagctg aaagagcgta 1800

tcgaactgac ccgcaacagc ttcggcggtg ccaaaaacac caacatcacc ggcgttatcg 1860

ttaacaaact gaacgcaccg gttgatgaac agggtcgtac tcgcccggat ctgtccgaga 1920

ttttcgacga ctcttccaaa gctaaagtaa acaatgttga tccggcgaag ctgcaagaat 1980

ccagcccgct gccggttctc ggcgctgtgc cgtggagctt tgacctgatc gcgactcgtg 2040

cgatcgatat ggctcgccac ctgaatgcga ccatcatcaa cgaaggcgac atcaatactc 2100

gccgcgttaa atccgtcact ttctgcgcac gcagcattcc gcacatgctg gagcacttcc 2160

gtgccggttc tctgctggtg acttccgcag accgtcctga cgtgctggtg gccgcttgcc 2220

tggcagccat gaacggcgta gaaatcggtg ccctgctgct gactggcggt tacgaaatgg 2280

acgcgcgcat ttctaaactg tgcgaacgtg ctttcgctac cggcctgccg gtatttatgg 2340

tgaacaccaa cacctggcag acctctctga gcctgcagag cttcaacctg gaagttccgg 2400

ttgacgatca cgaacgtatc gagaaagttc aggaatacgt tgctaactac atcaacgctg 2460

actggatcga atctctgact gccacttctg agcgcagccg tcgtctgtct ccgcctgcgt 2520

tccgttatca gctgactgaa cttgcgcgca aagcgggcaa acgtatcgta ctgccggaag 2580

gtgacgaacc gcgtaccgtt aaagcagccg ctatctgtgc tgaacgtggt atcgcaactt 2640

gcgtactgct gggtaatccg gcagagatca accgtgttgc agcgtctcag ggtgtagaac 2700

tgggtgcagg gattgaaatc gttgatccag aagtggttcg cgaaagctat gttggtcgtc 2760

tggtcgaact gcgtaagaac aaaggcatga ccgaaaccgt tgcccgcgaa cagctggaag 2820

acaacgtggt gctcggtacg ctgatgctgg aacaggatga agttgatggt ctggtttccg 2880

gtgctgttca cactaccgca aacaccatcc gtccgccgct gcagctgatc aaaactgcac 2940

cgggcagctc cctggtatct tccgtgttct tcatgctgct gccggaacag gtttacgttt 3000

acggtgactg tgcgatcaac ccggatccga ccgctgaaca gctggcagaa atcgcgattc 3060

agtccgctga ttccgctgcg gccttcggta tcgaaccgcg cgttgctatg ctctcctact 3120

ccaccggtac ttctggtgca ggtagcgacg tagaaaaagt tcgcgaagca actcgtctgg 3180

cgcaggaaaa acgtcctgac ctgatgatcg acggtccgct gcagtacgac gctgcggtaa 3240

tggctgacgt tgcgaaatcc aaagcgccga actctccggt tgcaggtcgc gctaccgtgt 3300

tcatcttccc ggatctgaac accggtaaca ccacctacaa agcggtacag cgttctgccg 3360

acctgatctc catcgggccg atgctgcagg gtatgcgcaa gccggttaac gacctgtccc 3420

gtggcgcact ggttgacgat atcgtctaca ccatcgcgct gactgcgatt cagtctgcac 3480

agcagcagta aaagcttaa 3499

<210> 4

<211> 1016

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

aactcgagtt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tggatatcat cttttatcac ccaacgttcg atacccaatg gtggattgag 120

gcactgcgca aagctattcc tcaggcaaga gtcagagcat ggaaaagcgg agataatgac 180

tctgctgatt atgctttagt ctggcatcct cctgttgaaa tgctggcagg gcgcgatctt 240

aaagcggtgt tcgcactcgg ggccggtgtt gattctattt tgagcaagct acaggcacac 300

cctgaaatgc tgaacccttc tgttccactt tttcgcctgg aagataccgg tatgggcgag 360

caaatgcagg aatatgctgt cagtcaggtg ctgcattggt ttcgacgttt tgacgattat 420

cgcatccagc aaaatagttc gcattggcaa ccgctgcctg aatatcatcg ggaagatttt 480

accatcggca ttttgggcgc aggcgtactg ggcagtaaag ttgctcagag tctgcaaacc 540

tggcgctttc cgctgcgttg ctggagtcga acccgtaaat cgtggcctgg cgtgcaaagc 600

tttgccggac gggaagaact gtctgcattt ctgagccaat gtcgggtatt gattaatttg 660

ttaccgaata cccctgaaac cgtcggcatt attaatcaac aattactcga aaaattaccg 720

gatggcgcgt atctcctcaa cctggcgcgt ggtgttcatg ttgtggaaga tgacctgctc 780

gcggcgctgg atagcggcaa agttaaaggc gcaatgttgg atgtttttaa tcgtgaaccc 840

ttaccgcctg aaagtccgct ctggcaacat ccacgcgtga cgataacacc acatgtcgcc 900

gcgattaccc gtcccgctga agctgtggag tacatttctc gcaccattgc ccagctcgaa 960

aaaggggaga gggtctgcgg gcaagtcgac cgcgcacgcg gctactaaga attcaa 1016

<210> 5

<211> 3301

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

aagaattctt gacagctagc tcagtcctag gtataatgct agctactaga gaaagaggag 60

aaatatacca tgaaaacccg tacacaacaa attgaagaat tacagaaaga gtggactcaa 120

ccgcgttggg aaggcattac tcgcccatac agtgcggaag atgtggtgaa attacgcggt 180

tcagtcaatc ctgaatgcac gctggcgcaa ctgggcgcag cgaaaatgtg gcgtctgctg 240

cacggtgagt cgaaaaaagg ctacatcaac agcctcggcg cactgactgg cggtcaggcg 300

ctgcaacagg cgaaagcggg tattgaagca gtctatctgt cgggatggca ggtagcggcg 360

gacgctaacc tggcggccag catgtatccg gatcagtcgc tctatccggc aaactcggtg 420

ccagctgtgg tggagcggat caacaacacc ttccgtcgtg ccgatcagat ccaatggtcc 480

gcgggcattg agccgggcga tccgcgctat gtcgattact tcctgccgat cgttgccgat 540

gcggaagccg gttttggcgg tgtcctgaat gcctttgaac tgatgaaagc gatgattgaa 600

gccggtgcag cggcagttca cttcgaagat cagctggcgt cagtgaagaa atgcggtcac 660

atgggcggca aagttttagt gccaactcag gaagctattc agaaactggt cgcggcgcgt 720

ctggcagctg acgtgacggg cgttccaacc ctgctggttg cccgtaccga tgctgatgcg 780

gcggatctga tcacctccga ttgcgacccg tatgacagcg aatttattac cggcgagcgt 840

accagtgaag gcttcttccg tactcatgcg ggcattgagc aagcgatcag ccgtggcctg 900

gcgtatgcgc catatgctga cctggtctgg tgtgaaacct ccacgccgga tctggaactg 960

gcgcgtcgct ttgcacaagc tatccacgcg aaatatccgg gcaaactgct ggcttataac 1020

tgctcgccgt cgttcaactg gcagaaaaac ctcgacgaca aaactattgc cagcttccag 1080

cagcagctgt cggatatggg ctacaagttc cagttcatca ccctggcagg tatccacagc 1140

atgtggttca acatgtttga cctggcaaac gcctatgccc agggcgaggg tatgaagcac 1200

tacgttgaga aagtgcagca gccggaattt gccgccgcga aagatggcta taccttcgta 1260

tctcaccagc aggaagtggg tacaggttac ttcgataaag tgacgactat tattcagggc 1320

ggcacgtctt cagtcaccgc gctgaccggc tccactgaag aatcgcagtt ctaagcaaca 1380

acaaccgttg ctgactgtag gccggataag gcgttcacgc cgcatccggc aatcggtgca 1440

cgatgcctga tgcgacgctt gcgcgtctta tcatgcctac agccgttgcc gaacgtaggc 1500

tggataaggc gtttacgccg catccggcaa ttctctgctc ctgatgaggg cgctaaatgc 1560

cgcgtggcct ggaattattg attgctcaaa ccattttgca aggcttcgat gctcagtatg 1620

gtcgattcct cgaagtgacc tccggtgcgc agcagcgttt cgaacaggcc gactggcatg 1680

ctgtccagca ggcgatgaaa aaccgtatcc atctttacga tcatcacgtt ggtctggtcg 1740

tggagcaact gcgctgcatt actaacggcc aaagtacgga cgcggcattt ttactacgtg 1800

ttaaagagca ttacacccgg ctgttgccgg attacccgcg cttcgagatt gcggagagct 1860

tttttaactc cgtgtactgt cggttatttg accaccgctc gcttactccc gagcggcttt 1920

ttatctttag ctctcagcca gagcgccgct ttcgtaccat tccccgcccg ctggcgaaag 1980

actttcaccc cgatcacggc tgggaatctc tactgatgcg cgttatcagc gacctaccgc 2040

tgcgcctgcg ctggcagaat aaaagccgtg acatccatta cattattcgc catctgacgg 2100

aaacgctggg gacagacaac ctcgcggaaa gtcatttaca ggtggcgaac gaactgtttt 2160

accgcaataa agccgcctgg ctggtaggca aactgatcac accttccggc acattgccat 2220

ttttgctgcc gatccaccag acggacgacg gcgagttatt tattgatacc tgcctgacga 2280

cgaccgccga agcgagcatt gtttttggct ttgcgcgttc ttattttatg gtttatgcgc 2340

cgctgcccgc agcgctggtc gagtggctac gggaaattct gccaggtaaa accaccgctg 2400

aattgtatat ggctatcggc tgccagaagc acgccaaaac cgaaagctac cgcgaatatc 2460

tcgtttatct acagggctgt aatgagcagt tcattgaagc gccgggtatt cgtggaatgg 2520

tgatgttggt gtttacgctg ccgggctttg atcgggtatt caaagtcatc aaagacaggt 2580

tcgcgccgca gaaagagatg tctgccgctc acgttcgtgc ctgctatcaa ctggtgaaag 2640

agcacgatcg cgtgggccga atggcggaca cccaggagtt tgaaaacttt gtgctggaga 2700

agcggcatat ttccccggca ttaatggaat tactgcttca ggaagcagcg gaaaaaatca 2760

ccgatctcgg cgaacaaatt gtgattcgcc atctttatat tgagcggcgg atggtgccgc 2820

tcaatatctg gctggaacaa gtggaaggtc agcagttgcg cgacgccatt gaagaatacg 2880

gtaacgctat tcgccagctt gccgctgcta acattttccc tggcgacatg ctgtttaaaa 2940

acttcggtgt cacccgtcac gggcgtgtgg ttttttatga ttacgatgaa atttgctaca 3000

tgacggaagt gaatttccgc gacatcccgc cgccgcgcta tccggaagac gaacttgcca 3060

gcgaaccgtg gtacagcgtc tcgccgggcg atgttttccc ggaagagttt cgccactggc 3120

tatgcgccga cccgcgtatt ggtccgctgt ttgaagagat gcacgccgac ctgttccgcg 3180

ctgattactg gcgcgcacta caaaaccgca tacgtgaagg gcatgtggaa gatgtttatg 3240

cgtatcggcg caggcaaaga tttagcgtac ggtatgggga gatgcttttt tgaggatcca 3300

a 3301

<210> 6

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

atgactgaac aggcaacaac aaccgatgaa ctggctttca caaggccgta tggcgagcag 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960

tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080

gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320

agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatagacag gcagtgacga 1380

tggataaacc attcctgaat gcttactcac gcctgttgat taaa 1424

<210> 7

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

atgagtcaaa ccataaccca gagccgttta cgcattgacg ccaattttaa acgttttgtg 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960

tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080

gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320

agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaataacggc tataccgaac 1380

cgttattaca cgcctggcgt ttacgcgaaa aagaaagtca ttaa 1424

<210> 8

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

atgagcatct tgtacgaaga gcgtcttgat ggcgctttac ccgatgtcga ccgcacatcg 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960

tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080

gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320

agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatttatcc cgtcgacgcc 1380

gaagcgattt tgttatgcga gctggacggc gtggagtctg acgt 1424

<210> 9

<211> 1424

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

atggtcgcac ccattcccgc gaaacgcggc agaaaacccg ccgttgccac cgcaccagcg 60

gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 120

ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc 180

tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca 240

agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc 300

agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag 360

caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg 420

gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca 480

agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat 540

gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact 600

ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc 660

agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc 720

gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg 780

tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca 840

gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc 900

ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct 960

tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt 1020

actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt 1080

gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc 1140

tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc agtagctgac attcatccgg 1200

ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc gcttccttta gcagcccttg 1260

cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct ctgaagttcc tatactttct 1320

agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg gaatggcgcg atggtgatta 1380

aagcggcgaa ggaagtgacg ctggcgtacg gtggaatgcg ctga 1424

<210> 10

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

Met Ser Gln Ile His Lys His Thr Ile Pro Ala Asn Ile Ala Asp Arg

1 5 10 15

Cys Leu Ile Asn Pro Gln Gln Tyr Glu Ala Met Tyr Gln Gln Ser Ile

20 25 30

Asn Val Pro Asp Thr Phe Trp Gly Glu Gln Gly Lys Ile Leu Asp Trp

35 40 45

Ile Lys Pro Tyr Gln Lys Val Lys Asn Thr Ser Phe Ala Pro Gly Asn

50 55 60

Val Ser Ile Lys Trp Tyr Glu Asp Gly Thr Leu Asn Leu Ala Ala Asn

65 70 75 80

Cys Leu Asp Arg His Leu Gln Glu Asn Gly Asp Arg Thr Ala Ile Ile

85 90 95

Trp Glu Gly Asp Asp Ala Ser Gln Ser Lys His Ile Ser Tyr Lys Glu

100 105 110

Leu His Arg Asp Val Cys Arg Phe Ala Asn Thr Leu Leu Glu Leu Gly

115 120 125

Ile Lys Lys Gly Asp Val Val Ala Ile Tyr Met Pro Met Val Pro Glu

130 135 140

Ala Ala Val Ala Met Leu Ala Cys Ala Arg Ile Gly Ala Val His Ser

145 150 155 160

Val Ile Phe Gly Gly Phe Ser Pro Glu Ala Val Ala Gly Arg Ile Ile

165 170 175

Asp Ser Asn Ser Arg Leu Val Ile Thr Ser Asp Glu Gly Val Arg Ala

180 185 190

Gly Arg Ser Ile Pro Leu Lys Lys Asn Val Asp Asp Ala Leu Lys Asn

195 200 205

Pro Asn Val Thr Ser Val Glu His Val Val Val Leu Lys Arg Thr Gly

210 215 220

Gly Lys Ile Asp Trp Gln Glu Gly Arg Asp Leu Trp Trp His Asp Leu

225 230 235 240

Val Glu Gln Ala Ser Asp Gln His Gln Ala Glu Glu Met Asn Ala Glu

245 250 255

Asp Pro Leu Phe Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys

260 265 270

Gly Val Leu His Thr Thr Gly Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Ala Leu Thr

275 280 285

Phe Lys Tyr Val Phe Asp Tyr His Pro Gly Asp Ile Tyr Trp Cys Thr

290 295 300

Ala Asp Val Gly Trp Val Thr Gly His Ser Tyr Leu Leu Tyr Gly Pro

305 310 315 320

Leu Ala Cys Gly Ala Thr Thr Leu Met Phe Glu Gly Val Pro Asn Trp

325 330 335

Pro Thr Pro Ala Arg Met Ala Gln Val Val Asp Lys His Gln Val Asn

340 345 350

Ile Leu Tyr Thr Ala Pro Thr Ala Ile Arg Ala Leu Met Ala Glu Gly

355 360 365

Asp Lys Ala Ile Glu Gly Thr Asp Arg Ser Ser Leu Arg Ile Leu Gly

370 375 380

Ser Val Gly Glu Pro Ile Asn Pro Glu Ala Trp Glu Trp Tyr Trp Lys

385 390 395 400

Lys Ile Gly Asn Glu Lys Cys Pro Val Val Asp Thr Trp Trp Gln Thr

405 410 415

Glu Thr Gly Gly Phe Met Ile Thr Pro Leu Pro Gly Ala Thr Glu Leu

420 425 430

Lys Ala Gly Ser Ala Thr Arg Pro Phe Phe Gly Val Gln Pro Ala Leu

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<220>

<223>

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<213> 人工序列

<220>

<223>

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Gln Phe

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<220>

<223>

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Leu Phe

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<220>

<223>

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<213> 人工序列

<220>

<223>

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Ser Leu Pro Leu Glu Asn Gly Ser Tyr Gln Asp Val Val Ala Phe Lys

180 185 190

Val Val Asp Lys Gln Leu Arg Ile Gln Leu Lys Asn Gly Lys Glu Thr

195 200 205

Thr Leu Arg Thr Pro Ala Gln Phe Val Gly Tyr Arg Gly Asp Ala Ala

210 215 220

Ala Pro Thr Cys Ile Leu Leu Lys Asn Asn Gly Leu His Ile Glu Leu

225 230 235 240

Gln Ile Asp Ala Asn Gly Arg Ile Gly Lys Asp Asp Pro Ala His Ile

245 250 255

Asn Asp Val Ile Val Glu Ala Ala Ile Ser Thr Ile Leu Asp Cys Glu

260 265 270

Asp Ser Val Ala Ala Val Asp Ala Glu Asp Lys Ile Leu Leu Tyr Arg

275 280 285

Asn Leu Leu Gly Leu Met Gln Gly Thr Leu Gln Glu Lys Met Glu Lys

290 295 300

Asn Gly Arg Gln Ile Val Arg Lys Leu Asn Asp Asp Arg His Tyr Thr

305 310 315 320

Ala Ala Asp Gly Ser Glu Ile Ser Leu His Gly Arg Ser Leu Leu Phe

325 330 335

Ile Arg Asn Val Gly His Leu Met Thr Ile Pro Val Ile Trp Asp Ser

340 345 350

Glu Gly Asn Glu Ile Pro Glu Gly Ile Leu Asp Gly Val Met Thr Gly

355 360 365

Ala Ile Ala Leu Tyr Asp Leu Lys Val Gln Lys Asn Ser Arg Thr Gly

370 375 380

Ser Val Tyr Ile Val Lys Pro Lys Met His Gly Pro Gln Glu Val Ala

385 390 395 400

Phe Ala Asn Lys Leu Phe Thr Arg Ile Glu Thr Met Leu Gly Met Ala

405 410 415

Pro Asn Thr Leu Lys Met Gly Ile Met Asp Glu Glu Arg Arg Thr Ser

420 425 430

Leu Asn Leu Arg Ser Cys Ile Ala Gln Ala Arg Asn Arg Val Ala Phe

435 440 445

Ile Asn Thr Gly Phe Leu Asp Arg Thr Gly Asp Glu Met His Ser Val

450 455 460

Met Glu Ala Gly Pro Met Leu Arg Lys Asn Gln Met Lys Ser Thr Pro

465 470 475 480

Trp Ile Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Asn Val Leu Ser Gly Leu Phe Cys

485 490 495

Gly Leu Arg Gly Lys Ala Gln Ile Gly Lys Gly Met Trp Ala Met Pro

500 505 510

Asp Leu Met Ala Asp Met Tyr Ser Gln Lys Gly Asp Gln Leu Arg Ala

515 520 525

Gly Ala Asn Thr Ala Trp Val Pro Ser Pro Thr Ala Ala Thr Leu His

530 535 540

Ala Leu His Tyr His Gln Thr Asn Val Gln Ser Val Gln Ala Asn Ile

545 550 555 560

Ala Gln Thr Glu Phe Asn Ala Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asp Asp Leu

565 570 575

Leu Thr Ile Pro Val Ala Glu Asn Ala Asn Trp Ser Ala Gln Glu Ile

580 585 590

Gln Gln Glu Leu Asp Asn Asn Val Gln Gly Ile Leu Gly Tyr Val Val

595 600 605

Arg Trp Val Glu Gln Gly Ile Gly Cys Ser Lys Val Pro Asp Ile His

610 615 620

Asn Val Ala Leu Met Glu Asp Arg Ala Thr Leu Arg Ile Ser Ser Gln

625 630 635 640

His Ile Ala Asn Trp Leu Arg His Gly Ile Leu Thr Lys Glu Gln Val

645 650 655

Gln Ala Ser Leu Glu Asn Met Ala Lys Val Val Asp Gln Gln Asn Ala

660 665 670

Gly Asp Pro Ala Tyr Arg Pro Met Ala Gly Asn Phe Ala Asn Ser Cys

675 680 685

Ala Phe Lys Ala Ala Ser Asp Leu Ile Phe Leu Gly Val Lys Gln Pro

690 695 700

Asn Gly Tyr Thr Glu Pro Leu Leu His Ala Trp Arg Leu Arg Glu Lys

705 710 715 720

Glu Ser His

<210> 19

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

Met Ser Ile Leu Tyr Glu Glu Arg Leu Asp Gly Ala Leu Pro Asp Val

1 5 10 15

Asp Arg Thr Ser Val Leu Met Ala Leu Arg Glu His Val Pro Gly Leu

20 25 30

Glu Ile Leu His Thr Asp Glu Glu Ile Ile Pro Tyr Glu Cys Asp Gly

35 40 45

Leu Ser Ala Tyr Arg Thr Arg Pro Leu Leu Val Val Leu Pro Lys Gln

50 55 60

Met Glu Gln Val Thr Ala Ile Leu Ala Val Cys His Arg Leu Arg Val

65 70 75 80

Pro Val Val Thr Arg Gly Ala Gly Thr Gly Leu Ser Gly Gly Ala Leu

85 90 95

Pro Leu Glu Lys Gly Val Leu Leu Val Met Ala Arg Phe Lys Glu Ile

100 105 110

Leu Asp Ile Asn Pro Val Gly Arg Arg Ala Arg Val Gln Pro Gly Val

115 120 125

Arg Asn Leu Ala Ile Ser Gln Ala Val Ala Pro His Asn Leu Tyr Tyr

130 135 140

Ala Pro Asp Pro Ser Ser Gln Ile Ala Cys Ser Ile Gly Gly Asn Val

145 150 155 160

Ala Glu Asn Ala Gly Gly Val His Cys Leu Lys Tyr Gly Leu Thr Val

165 170 175

His Asn Leu Leu Lys Ile Glu Val Gln Thr Leu Asp Gly Glu Ala Leu

180 185 190

Thr Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Ser Pro Gly Phe Asp Leu Leu Ala

195 200 205

Leu Phe Thr Gly Ser Glu Gly Met Leu Gly Val Thr Thr Glu Val Thr

210 215 220

Val Lys Leu Leu Pro Lys Pro Pro Val Ala Arg Val Leu Leu Ala Ser

225 230 235 240

Phe Asp Ser Val Glu Lys Ala Gly Leu Ala Val Gly Asp Ile Ile Ala

245 250 255

Asn Gly Ile Ile Pro Gly Gly Leu Glu Met Met Asp Asn Leu Ser Ile

260 265 270

Arg Ala Ala Glu Asp Phe Ile His Ala Gly Tyr Pro Val Asp Ala Glu

275 280 285

Ala Ile Leu Leu Cys Glu Leu Asp Gly Val Glu Ser Asp Val Gln Glu

290 295 300

Asp Cys Glu Arg Val Asn Asp Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Thr Asp

305 310 315 320

Val Arg Leu Ala Gln Asp Glu Ala Glu Arg Val Arg Phe Trp Ala Gly

325 330 335

Arg Lys Asn Ala Phe Pro Ala Val Gly Arg Ile Ser Pro Asp Tyr Tyr

340 345 350

Cys Met Asp Gly Thr Ile Pro Arg Arg Ala Leu Pro Gly Val Leu Glu

355 360 365

Gly Ile Ala Arg Leu Ser Gln Gln Tyr Asp Leu Arg Val Ala Asn Val

370 375 380

Phe His Ala Gly Asp Gly Asn Met His Pro Leu Ile Leu Phe Asp Ala

385 390 395 400

Asn Glu Pro Gly Glu Phe Ala Arg Ala Glu Glu Leu Gly Gly Lys Ile

405 410 415

Leu Glu Leu Cys Val Glu Val Gly Gly Ser Ile Ser Gly Glu His Gly

420 425 430

Ile Gly Arg Glu Lys Ile Asn Gln Met Cys Ala Gln Phe Asn Ser Asp

435 440 445

Glu Ile Thr Thr Phe His Ala Val Lys Ala Ala Phe Asp Pro Asp Gly

450 455 460

Leu Leu Asn Pro Gly Lys Asn Ile Pro Thr Leu His Arg Cys Ala Glu

465 470 475 480

Phe Gly Ala Met His Val His His Gly His Leu Pro Phe Pro Glu Leu

485 490 495

Glu Arg Phe

<210> 20

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

Met Val Ala Pro Ile Pro Ala Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala Val Ala

1 5 10 15

Thr Ala Pro Ala Thr Gly Gln Val Gln Ser Leu Thr Arg Gly Leu Lys

20 25 30

Leu Leu Glu Trp Ile Ala Glu Ser Asn Gly Ser Val Ala Leu Thr Glu

35 40 45

Leu Ala Gln Gln Ala Gly Leu Pro Asn Ser Thr Thr His Arg Leu Leu

50 55 60

Thr Thr Met Gln Gln Gln Gly Phe Val Arg Gln Val Gly Glu Leu Gly

65 70 75 80

His Trp Ala Ile Gly Ala His Ala Phe Met Val Gly Ser Ser Phe Leu

85 90 95

Gln Ser Arg Asn Leu Leu Ala Ile Val His Pro Ile Leu Arg Asn Leu

100 105 110

Met Glu Glu Ser Gly Glu Thr Val Asn Met Ala Val Leu Asp Gln Ser

115 120 125

Asp His Glu Ala Ile Ile Ile Asp Gln Val Gln Cys Thr His Leu Met

130 135 140

Arg Met Ser Ala Pro Ile Gly Gly Lys Leu Pro Met His Ala Ser Gly

145 150 155 160

Ala Gly Lys Ala Phe Leu Ala Gln Leu Ser Glu Glu Gln Val Thr Lys

165 170 175

Leu Leu His Arg Lys Gly Leu His Ala Tyr Thr His Ala Thr Leu Val

180 185 190

Ser Pro Val His Leu Lys Glu Asp Leu Ala Gln Thr Arg Lys Arg Gly

195 200 205

Tyr Ser Phe Asp Asp Glu Glu His Ala Leu Gly Leu Arg Cys Leu Ala

210 215 220

Ala Cys Ile Phe Asp Glu His Arg Glu Pro Phe Ala Ala Ile Ser Ile

225 230 235 240

Ser Gly Pro Ile Ser Arg Ile Thr Asp Asp Arg Val Thr Glu Phe Gly

245 250 255

Ala Met Val Ile Lys Ala Ala Lys Glu Val Thr Leu Ala Tyr Gly Gly

260 265 270

Met Arg

<210> 21

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

atgactgaac aggcaacaac aaccgatgaa ctggctttca caaggccgta tggcgagcag 60

gagaagcaaa ttcttactgc cgaagcggta gaatttctga ctgagctggt gacgcatttt 120

acgccacaac gcaataaact tctggcagcg cgcattcagc agcagcaaga tattgataac 180

ggaacgttgc ctgattttat ttcggaaaca gcttccattc gcgatgctga ttggaaaatt 240

cgcgggattc ctgcggactt agaagaccgc cgcgtagaga taactggccc ggtagagcgc 300

aagatggtga tcaacgcgct caacgccaat gtgaaagtct ttatggccga tttcgaagat 360

tcactggcac cagactggaa caaagtgatc gacgggcaaa ttaacctgcg tgatgcggtt 420

aacggcacca tcagttacac caatgaagca ggcaaaattt accagctcaa gcccaatcca 480

gcggttttga tttgtcgggt acgcggtctg cacttgccgg aaaaacatgt cacctggcgt 540

ggtgaggcaa tccccggcag cctgtttgat tttgcgctct atttcttcca caactatcag 600

gcactgttgg caaagggcag tggtccctat ttctatctgc cgaaaaccca gtcctggcag 660

gaagcggcct ggtggagcga agtcttcagc tatgcagaag atcgctttaa tctgccgcgc 720

ggcaccatca aggcgacgtt gctgattgaa acgctgcccg ccgtgttcca gatggatgaa 780

atccttcacg cgctgcgtga ccatattgtt ggtctgaact gcggtcgttg ggattacatc 840

ttcagctata tcaaaacgtt gaaaaactat cccgatcgcg tcctgccaga cagacaggca 900

gtgacgatgg ataaaccatt cctgaatgct tactcacgcc tgttgattaa aacctgccat 960

aaacgcggtg cttttgcgat gggcggcatg gcggcgttta ttccgagcaa agatgaagag 1020

cacaataacc aggtgctcaa caaagtaaaa gcggataaat cgctggaagc caataacggt 1080

cacgatggca catggatcgc tcacccaggc cttgcggaca cggcaatggc ggtattcaac 1140

gacattctcg gctcccgtaa aaatcagctt gaagtgatgc gcgaacaaga cgcgccgatt 1200

actgccgatc agctgctggc accttgtgat ggtgaacgca ccgaagaagg tatgcgcgcc 1260

aacattcgcg tggctgtgca gtacatcgaa gcgtggatct ctggcaacgg ctgtgtgccg 1320

atttatggcc tgatggaaga tgcggcgacg gctgaaattt cccgtacctc gatctggcag 1380

tggatccatc atcaaaaaac gttgagcaat ggcaaaccgg tgaccaaagc cttgttccgc 1440

cagatgctgg gcgaagagat gaaagtcatt gccagcgaac tgggcgaaga acgtttctcc 1500

caggggcgtt ttgacgatgc cgcacgcttg atggaacaga tcaccacttc cgatgagtta 1560

attgatttcc tgaccctgcc aggctaccgc ctgttagcgt aa 1602

<210> 22

<211> 2172

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

atgagtcaaa ccataaccca gagccgttta cgcattgacg ccaattttaa acgttttgtg 60

gatgaagaag ttttaccggg aacagggctg gacgctgcgg cgttctggcg caattttgat 120

gagatcgttc atgatctggc accagaaaat cgtcagttgc tggcagaacg cgatcgcatt 180

caggcagcgc ttgatgagtg gcatcgcagc aatccggggc cggtaaaaga taaagcggcc 240

tataaatctt tcctgcgtga actgggctac ctggtgccgc aaccggagcg cgtgacggtg 300

gaaaccacgg gcattgacag cgaaatcacc agccaggcgg ggccgcagct ggtggttccg 360

gcaatgaacg cccgctacgc gctgaacgcg gcgaacgctc gctggggctc actgtacgat 420

gcgttatacg gcagcgacat catcccgcag gaaggggcga tggtcagcgg ctacgatccg 480

caacgcggtg agcaggttat cgcctgggtt cggcgtttcc tcgatgaatc tctaccgctg 540

gaaaacggca gctatcagga tgtggtggcg tttaaggtgg ttgataaaca attacgcatc 600

cagttgaaaa atggtaaaga aaccacgtta cgtactccag cacagtttgt cggttaccgt 660

ggcgatgccg ctgcgccgac ctgcattttg ctgaaaaata acggcctgca tattgagctg 720

caaatcgatg ccaatgggcg gattggcaaa gacgatccgg cgcacatcaa cgatgttatc 780

gtcgaagctg ctatcagtac cattctcgac tgcgaagatt cggtcgcggc ggttgatgcg 840

gaagataaaa tcctgctgta ccgcaacctg ctgggcctga tgcaggggac tctgcaagag 900

aaaatggaga aaaacggtcg gcaaatcgtg cgtaaactga atgacgatcg tcattacacc 960

gccgccgatg gctctgaaat ttctctgcac ggacgctcgc tgctgtttat ccgcaacgtg 1020

ggtcatttga tgaccattcc tgtgatttgg gacagcgaag gcaatgaaat cccggaaggc 1080

attcttgatg gcgtcatgac tggcgcgatt gccctctatg atttaaaagt gcagaaaaac 1140

tcgcgcactg gcagcgtcta tattgtgaaa ccgaaaatgc acggtccgca ggaagtggcg 1200

ttcgccaaca aactgtttac ccgcattgag acaatgctcg gtatggcacc gaataccctg 1260

aaaatgggca ttatggatga agaacgtcgg acctcgctga acttgcgtag ctgtatcgct 1320

caggcgcgca accgcgtggc gttcatcaat accggtttcc tcgaccgtac cggcgatgaa 1380

atgcattcgg tgatggaagc tggcccgatg ctgcgtaaaa atcagatgaa atcgacgcct 1440

tggatcaaag cctacgagcg taataacgtg ctttccggtc tgttctgtgg gctgcgcggt 1500

aaagcgcaaa ttggtaaagg catgtgggca atgccggacc tgatggcaga catgtacagc 1560

cagaagggcg accaactgcg tgccggggca aacacagcct gggttccgtc accaaccgct 1620

gctacgctcc atgcgctgca ctaccaccaa accaacgtac agagcgtaca agccaacatt 1680

gcccagaccg agttcaatgc tgaatttgaa ccgctgctgg acgatctgct gactattccg 1740

gttgctgaaa acgctaactg gtcggcgcaa gagatccaac aagagctgga taacaacgtg 1800

caggggattc tggggtacgt ggtgcgctgg gtggagcagg ggattggttg ttcaaaagtg 1860

ccggatattc acaatgtggc gttgatggaa gaccgcgcaa cgctgcgtat ctccagccag 1920

catatcgcca actggttacg tcacggtatt ctgaccaaag aacaggtgca ggcgtcgctg 1980

gagaatatgg cgaaagtggt tgatcagcaa aacgctggcg atccggctta tcgtccgatg 2040

gcggggaatt tcgctaactc gtgtgctttt aaagctgcca gcgatttaat cttcctcggc 2100

gtgaaacagc caaacggcta taccgaaccg ttattacacg cctggcgttt acgcgaaaaa 2160

gaaagtcatt aa 2172

<210> 23

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

atgagcatct tgtacgaaga gcgtcttgat ggcgctttac ccgatgtcga ccgcacatcg 60

gtactgatgg cactgcgtga gcatgtccct ggacttgaga tcctgcatac cgatgaggag 120

atcattcctt acgagtgtga cgggttgagc gcgtatcgca cgcgtccatt actggttgtt 180

ctgcctaagc aaatggaaca ggtgacagcg attctggctg tctgccatcg cctgcgtgta 240

ccggtggtga cccgtggtgc aggcaccggg ctttctggtg gcgcgctgcc gctggaaaaa 300

ggtgtgttgt tggtgatggc gcgctttaaa gagatcctcg acattaaccc cgttggtcgc 360

cgcgcgcgcg tgcagccagg cgtgcgtaac ctggcgatct cccaggccgt tgcaccgcat 420

aatctctact acgcaccgga cccttcctca caaatcgcct gttccattgg cggcaatgtg 480

gctgaaaatg ccggcggcgt ccactgcctg aaatatggtc tgaccgtaca taacctgctg 540

aaaattgaag tgcaaacgct ggacggcgag gcactgacgc ttggatcgga cgcgctggat 600

tcacctggtt ttgacctgct ggcgctgttc accggatcgg aaggtatgct cggcgtgacc 660

accgaagtga cggtaaaact gctgccgaag ccgcccgtgg cgcgggttct gttagccagc 720

tttgactcgg tagaaaaagc cggacttgcg gttggtgaca tcatcgccaa tggcattatc 780

cccggcgggc tggagatgat ggataacctg tcgatccgcg cggcggaaga ttttattcat 840

gccggttatc ccgtcgacgc cgaagcgatt ttgttatgcg agctggacgg cgtggagtct 900

gacgtacagg aagactgcga gcgggttaac gacatcttgt tgaaagcggg cgcgactgac 960

gtccgtctgg cacaggacga agcagagcgc gtacgtttct gggccggtcg caaaaatgcg 1020

ttcccggcgg taggacgtat ctccccggat tactactgca tggatggcac catcccgcgt 1080

cgcgccctgc ctggcgtact ggaaggcatt gcccgtttat cgcagcaata tgatttacgt 1140

gttgccaacg tctttcatgc cggagatggc aacatgcacc cgttaatcct tttcgatgcc 1200

aacgaacccg gtgaatttgc ccgcgcggaa gagctgggcg ggaagatcct cgaactctgc 1260

gttgaagttg gcggcagcat cagtggcgaa catggcatcg ggcgagaaaa aatcaatcaa 1320

atgtgcgccc agttcaacag cgatgaaatc acgaccttcc atgcggtcaa ggcggcgttt 1380

gaccccgatg gtttgctgaa ccctgggaaa aacattccca cgctacaccg ctgtgctgaa 1440

tttggtgcca tgcatgtgca tcacggtcat ttacctttcc ctgaactgga gcgtttctga 1500

<210> 24

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

atggtcgcac ccattcccgc gaaacgcggc agaaaacccg ccgttgccac cgcaccagcg 60

actggacagg ttcagtcttt aacgcgtggc ctgaaattac tggagtggat tgccgaatcc 120

aatggcagtg tggcactcac ggaactggcg caacaagccg ggttacccaa ttccacgacc 180

caccgcctgc taaccacgat gcaacagcag ggtttcgtgc gtcaggttgg cgaactggga 240

cattgggcaa tcggcgcaca tgcctttatg gtcggcagca gctttctcca gagccgtaat 300

ttgttagcga ttgttcaccc tatcctgcgc aatctaatgg aagagtctgg cgaaacggtc 360

aatatggcgg tgcttgatca aagcgatcac gaagcgatta ttatcgacca ggtacagtgt 420

acgcatctga tgcgaatgtc cgcgcctatc ggcggtaaat tgccgatgca cgcttccggt 480

gcgggtaaag cctttttagc ccaactgagc gaagaacagg tgacgaagct gctgcaccgc 540

aaagggttac atgcctatac ccacgcaacg ctggtgtctc ctgtgcattt aaaagaagat 600

ctcgcccaaa cgcgcaaacg gggttattca tttgacgatg aggaacatgc actggggcta 660

cgttgccttg cagcgtgtat tttcgatgag caccgtgaac cgtttgccgc aatttctatt 720

tccggaccga tttcacgtat taccgatgac cgcgtgaccg agtttggcgc gatggtgatt 780

aaagcggcga aggaagtgac gctggcgtac ggtggaatgc gctga 825

Claims (4)

1.制备用于生产乙醇酸的工程菌的方法，包括如下步骤：提高受体菌中乙酰辅酶A合成酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶、乙醛酸还原酶的表达和/或活性，且降低所述受体菌中苹果酸合酶、乙醇酸氧化酶和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产乙醇酸的工程菌；所述受体菌为能够以乙酸作为碳源生长的菌；

所述受体菌为大肠杆菌；

所述“提高受体菌中乙酰辅酶A合成酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶激酶、乙醛酸还原酶的表达和/或活性”是通过向所述受体菌中导入乙酰辅酶A合成酶的编码基因、磷酸转乙酰酶的编码基因、乙酸激酶的编码基因、柠檬酸合酶的编码基因、异柠檬酸裂解酶的编码基因、异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因和乙醛酸还原酶的编码基因来实现的；

所述“降低所述受体菌中苹果酸合酶、乙醇酸氧化酶和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的表达和/或活性”是通过敲除所述受体菌中苹果酸合酶的编码基因、乙醇酸氧化酶的编码基因和异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因来实现的；

所述乙酰辅酶A合成酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2的第70-2028位；

所述磷酸转乙酰酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3的第1347-3491位；

所述乙酸激酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3的第70-1272位；

所述柠檬酸合酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1的第70-1353位；

所述异柠檬酸裂解酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5的第70-1374位；

所述异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5的第1557-3293位；

所述乙醛酸还原酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4的第70-1008位；

所述苹果酸合酶为苹果酸合酶1和/或苹果酸合酶2；所述苹果酸合酶1的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列21；所述苹果酸合酶2的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列22；

所述乙醇酸氧化酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列23；

所述异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列24；

所述乙酰辅酶A合成酶的编码基因是通过序列表中序列2所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述磷酸转乙酰酶的编码基因和所述乙酸激酶的编码基因是通过序列表中序列3所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述柠檬酸合酶的编码基因是通过序列表中序列1所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述异柠檬酸裂解酶的编码基因和所述异柠檬酸脱氢酶激酶的编码基因是通过序列表中序列5所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述乙醛酸还原酶的编码基因是通过序列表中序列4所示的DNA分子导入所述受体菌中的；

所述苹果酸合酶1的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列6；

所述苹果酸合酶2的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列7；

所述乙醇酸氧化酶的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列8；

所述异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白的编码基因是通过λ-red同源重组的方式进行敲除的，其中同源重组片段的核苷酸序列为序列表中序列9。

2.由权利要求1所述的方法制备得到的用于生产乙醇酸的工程菌。

3.权利要求2中所述工程菌在以乙酸作为底物生产乙醇酸中的应用。

4.一种生产乙醇酸的方法，包括如下步骤：以乙酸作为碳源，发酵培养权利要求2中所述工程菌，收集发酵产物，从中获得乙醇酸。