CN104169299A - 含抗Ang-2 抗体的稳定化制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含特异结合血管生成素2(Ang-2)的抗体的药物制剂。除了抗Ang-2抗体以外，所述制剂还可含有至少一种氨基酸、至少一种糖或至少一种非离子型表面活性剂。本发明的药物制剂在储存数个月之后以及在历经热应力以及其它物理性应力之后表现相当高程度的抗体稳定性。

Description

含抗Ang-2 抗体的稳定化制剂
技术领域
本发明是有关于治疗性抗体制剂的领域。更具体而言，本发明是有关于包含特异结合至血管生成素-2(Ang-2)的抗体的药物制剂。
序列表
依据37C.F.R§1.821(e)随本说明书同时一起申请的是序列表的ST.25兼容性计算机可读取文字文件。文字文件的内容在此并入做为参考文件。序列表的纸本复印本系依据37C.F.R§1.821(f)与ST.25兼容性计算机可读取文字文件的内容完全相同，其包括作为本说明的一部分且在此并入做为参考文件。
背景技术
血管新生是新血管形成的一个生物过程。异常的血管新生与数种疾病病况有关，该等疾病病况包括，例如增生性视网膜病变、类风湿性关节炎以及牛皮癣。此外，已证实血管新生对于肿瘤生长与维持至关重要。血管生成素-2(Ang-2)是Tie-2受体(Tie-2)的配体且已显示在血管新生中发挥作用。Ang-2在本领域中亦称为Tie-2配体(US 5,643,755；Yancopoulos等人，2000,Nature407:242-248)。
结合至Ang-2的抗体与其它肽抑制剂在一定程度上描述于例如US6,166,185；7,521,053；7,205,275；2006/0018909及2006/0246071中。在本领域中需要能够用来治疗由血管新生所致或因为血管新生而恶化的疾病与病况的新颖Ang-2调节剂(包括Ang-2抗体)。
治疗性抗体必须以不仅使抗体适于投与给患者的方式，还要以在储存以及后续使用期间维持其稳定性的方式来调配。举例而言，例如除非适当地调配溶液，否则液体溶液中的治疗性抗体倾向于分解、团聚或非所欲的化学修饰。抗体在液体制剂中的稳定性不仅取决于制剂中所使用的赋形剂种类，还有赋形剂相对于彼此的数量和比例。此外，除了稳定性以外，在制备液体抗体制剂时必须纳入其它考虑。此等其它考虑的实例包括液体的黏度与特定制剂所能包含的抗体浓度，以及制剂的视觉质量或诉求。因此，在调配治疗性抗体时，必须非常小心以使得制剂维持稳定、含有适当浓度的抗体，以及具有适当黏度与使制剂方便投与给患者的其它特性。
针对血管生成素-2蛋白质(Ang-2)的抗体是需要适当调配的治疗相关大分子的一个实例。尽管已知一些抗Ang-2抗体，但在本领域中对于含有足够稳定且适于投与给患者的抗Ang-2抗体的新颖药物制剂仍存在有需要。
发明概述
本发明藉由提供含有特异结合至人血管生成素-2(Ang-2)的人抗体的药物制剂来满足上述需求。
在一个方面中，提供一种液体药物制剂，其包含：(i)特异结合至血管生成素-2(Ang-2)的抗体；(ii)缓冲剂；(iii)有机共溶剂；以及(iv)稳定剂。
在一个实施方案中，以约5±0.75mg/mL至约150±22.5mg/mL的浓度提供抗体。在另一个实施方案中，以约5mg/ml±0.75mg/mL的浓度提供抗体。在另一个实施方案中，以约25mg/mL±3.75mg/mL的浓度提供抗体。在另一个实施方案中，以约50mg/mL±7.5mg/mL的浓度提供抗体。
在一些实施方案中，本发明的例示性抗Ang-2抗体以及Ang-2抗原结合片段包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3结构域，各自选自由下列组成的组：(i)SEQ ID NO:4、6、8、12、14及16(例如，HIH685)；(ii)SEQ ID NO:28、30、32、36、38及40(例如，HIH690)；(iii)SEQ ID NO:52、54、56、60、62及64(例如，HIH691)；(iv)SEQ IDNO:148、150、152、156、158及160(例如，HIH696)；(v)SEQ ID NO:196、198、200、204、206及208(例如，H1H706)；(vi)SEQ ID NO:268、270、272、276、278及280(例如，H1M724)；以及(vii)SEQ ID NO:436、438、440、444、446及448(例如，H2M744)。
在相关实施方案中，本发明包含特异结合Ang-2的抗Ang-2抗体或抗体的抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包含选自由下列SEQ IDNO所组成的组的重链与轻链可变域序列中所含的重链与轻链CDR域(亦即CDR1、CDR2与CDR3)：SEQ ID NO:2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500，及502/504。在一个实施方案中，该抗体或其片段包含选自由下列SEQ ID NO的组的氨基酸序列对的HCVR与LCVR中所含的CDR序列：SEQ ID NO:18/20、42/44、66/68、162/164、210/212、266/274，及434/442。
在一个实施方案中，液体制剂的pH为约pH6.0±0.5、pH6.0±0.4、pH6.0±0.3、pH6.0±0.2、pH6.0±0.1、pH6.0±0.05、pH6.0±0.01或pH6.0。在一个特定实施方案中，液体制剂的pH为约pH6.0±0.3。在一个实施方案中，液体药物缓冲剂具有一种或多种缓冲剂，其(等)具有约pH5.5至约pH7.4的有效缓冲范围，或pKa为约6.0。
在一个实施方案中，缓冲剂为组氨酸。在一个实施方案中，组氨酸浓度为5mM±0.75mM至50mM±7.5mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为5mM±0.75mM或约5mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为10mM±1.5mM或约10mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为15mM±2.25mM或约15mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为20mM±3mM或约20mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为25mM±3.75mM或约25mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为30mM±4.5mM或约30mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为35mM±5.25mM或约35mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为40mM±6mM或约40mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为45mM±6.75mM或约45mM。在一个实施方案中，组氨酸浓度为50mM±7.5mM或约50mM。
在一个实施方案中，有机共溶剂为含有聚氧乙烯部分的非离子型聚合物。在一些实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20、帕洛沙姆188及聚乙二醇3350中的任一者或多者。在一个特定实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20。
在一个实施方案中，有机共溶剂浓度为约0.005％±0.00075％至约1％±0.15％“重量对体积”或“w/v”，其中，例如0.1g/ml＝10％而0.01g/ml＝1％。在一个实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20，其浓度为约0.2％±0.03％w/v。在另一个实施方案中，有机共溶剂为聚山梨醇酯20，其浓度为0.01％±0.0015％w/v或约0.01％w/v。
在一个实施方案中，稳定剂为糖。在一个实施方案中，糖是选自于由蔗糖、甘露糖醇以及海藻糖组成的组。在一个特定实施方案中，稳定剂为蔗糖。
在一个实施方案中，稳定剂浓度为1％±0.15％w/v至20％±3％w/v。在一个特定实施方案中，稳定剂为浓度5％±0.75％w/v或约5％w/v的蔗糖。在另一个特定实施方案中，稳定剂为浓度7.5％±1.125％w/v或约7.5％w/v的蔗糖。在另一个特定实施方案中，稳定剂为浓度10％±1.5％w/v或约1.5％w/v的蔗糖。在另一个特定实施方案中，稳定剂为浓度12.5％±1.875％w/v或约12.5％w/v的蔗糖。在另一个特定实施方案中，稳定剂为浓度15％±2.25％w/v或约15％w/v的蔗糖。在另一个特定实施方案中，稳定剂为浓度20％±3％w/v或约20％w/v的蔗糖。
在一个实施方案中，制剂的黏度为约1厘泊(cPoise)至约10厘泊。在一个实施方案中，制剂的黏度为1.4厘泊±0.21厘泊，或约1.4厘泊。
在一个实施方案中，制剂的渗透性在生理范围内。在一个实施方案中，制剂具有约300毫渗透性摩耳/kg(mOsm)至约400mOsm的渗透性。在一个实施方案中，制剂的渗透性为363mOsm±54mOsm或约363mOsm。
在一个实施方案中，至少96％于-80℃储存6个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非团聚且未分解的，如藉由大小排阻层析所测定。在一个实施方案中，至少55％于-80℃储存6个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非碱性及非酸性形式(亦即，主峰或主要电荷形式或“区2峰”)，如藉由离子交换层析所测定。
在一个实施方案中，至少96％于-30℃储存6个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非团聚且未分解的，如藉由大小排阻层析所测定。在一个实施方案中，至少55％于-30℃储存6个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是主要电荷形式，如藉由离子交换层析所测定。
在一个实施方案中，至少96％于-20℃储存6个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非团聚且未分解的，如藉由大小排阻层析所测定。在一个实施方案中，至少55％于-20℃储存6个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是主要电荷形式，如藉由离子交换层析所测定。
在一个实施方案中，至少96％于5℃储存9个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非团聚且未分解的形式，如藉由大小排阻层析所测定。在一个实施方案中，至少56％于5℃储存9个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是主要电荷形式，如藉由离子交换层析所测定。
在一个实施方案中，至少98％于25℃储存3个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非团聚且未分解的形式，如藉由大小排阻层析所测定。在一个实施方案中，至少54％于25℃储存3个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是主要电荷形式，如藉由离子交换层析所测定。
在一个实施方案中，至少97％于37℃储存1个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非团聚且未分解的形式，如藉由大小排阻层析所测定。在一个实施方案中，至少47％于37℃储存1个月后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是主要电荷形式，如藉由离子交换层析所测定。
在一个实施方案中，至少95％于45℃储存28天后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是非团聚且未分解的形式，如藉由大小排阻层析所测定。在一个实施方案中，至少32％于45℃储存28天后由该液体药物制剂回收的抗Ang-2抗体是主要电荷形式，如藉由离子交换层析所测定。
在一个方面中，提供一种液体药物制剂，其包含：(i)5±0.75mg/ml至150±22.5mg/ml特异结合至人Ang-2的人抗体；(ii)5mM±0.75mM至50mM±7.5mM组氨酸；(iii)0.005％±.000075％至1％±0.15％(w/v)聚山梨醇酯20；以及(iv)1％±0.15％至20％±3％(w/v)蔗糖，pH为约5.5至约6.5。此方面的抗Ang2抗体含有重链可变区(HCVR)以及轻链可变区(LCVR)，以使得HCVR/LCVR组合含有重链与轻链互补决定区(HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其分别具有SEQ IDNO:4-6-8/SEQ ID NO:12-14-16的氨基酸序列。在一个特定实施方案中，抗Ang-2抗体含有重链可变区(HCVR)以及轻链可变区(LCVR)，其分别具有SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:20的氨基酸序列(美国公开专利案申请号：20110027286的抗体HIH685P，其特别以其整体并入本文做为参考文件)。
在另一个实施方案中，液体制剂包含(i)50±7.5mg/mL的HIH685P；(ii)10±1.5mM组氨酸；(iii)0.2％±0.03％(w/v)聚山梨醇酯20；及(iv)10％±1.5％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.5。
在本方面的一个实施方案中，液体制剂含有(i)25±3.75mg/mL的H1N685P；(ii)10±1.5mM组氨酸；(iii)0.2％±0.03％(w/v)聚山梨醇酯20；及(iv)10％±1.5％(w/v)蔗糖，pH为6.0±0.5。在此特定制剂的一个实施方案中，制剂于45℃储存28天后，≥95％的抗体为天然的且≥32％的抗体为主要电荷形式。在此特定制剂的一个实施方案中，制剂于37℃储存1个月后，≥97％的抗体为天然的且≥47％的抗体为主要电荷形式。在此特定制剂的一个实施方案中，制剂于25℃储存3个月后，≥98％的抗体为天然的且≥54％的抗体为主要电荷形式。在此特定制剂的一个实施方案中，制剂于5℃储存9个月后，≥96％的抗体为天然的且≥56％的抗体为主要电荷形式。在此特定制剂的一个实施方案中，制剂于-20℃储存3个月后，≥9％的抗体为天然的且≥55％的抗体为主要电荷形式。在此特定制剂的一个实施方案中，制剂于-30℃储存6个月后，≥96％的抗体为天然的且≥55％的抗体为主要电荷形式。在此特定制剂的一个实施方案中，制剂于-80℃储存6个月后，≥96％的抗体为天然的且≥55％的抗体为主要电荷形式。
在一个方面中，在容器中提供任一前述方面的液体药物制剂。在一个实施方案中，容器为聚碳酸酯小瓶。在另一个实施方案中，容器为玻璃小瓶。在一个实施方案中，玻璃小瓶为第1型硼硅酸玻璃小瓶，具有涂覆氟碳化物的丁基橡胶瓶塞。在另一个实施方案中，容器为微输注器。在另一个实施方案中，容器为注射器。在一个特定实施方案中，注射器含有一个涂覆氟碳化物的塞盖。在一个特定实施方案中，注射器为1mL长玻璃注射器，含有少于约500ppb钨的27-G针头、涂覆氟碳化物的丁基橡胶瓶塞，以及无乳胶、非细胞毒性橡胶顶盖。在一个更特定的实施方案中，注射器为NUOVA OMPI 1mL长玻璃注射器，配有27-G薄壁针头、涂覆FLUROTEC的4023/50橡胶瓶塞，以及FM27橡胶顶盖。在另一个更特定的实施方案中，注射器为1mL或3mL塑料注射器，装有27-G针头。在一个更特定的实施方案中，塑料注射器是由BECTON DICKINSON所分发。在一个实施方案中，容器为聚氯乙烯IV袋。在另一个实施方案中，容器为聚烯烃IV袋。
在一个方面中，提供一种含有下列的药物制剂：(a)50mg/mL±7.5mg/mL的抗Ang-2抗体、(b)10mM±1.5mM组氨酸，pH6.0±0.5、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，及(d)10％w/v±1.5％蔗糖，其中(a)该抗体含有SEQ ID NO:18的HCVD以及SEQ ID NO:20的LCVD、(b)制剂中超过96％的抗体具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)制剂中至少53％的抗体具有约8.13±0.01的等电点、(d)制剂中约90％至约92％的抗体是岩藻糖基化的，及(e)约2.5％抗体的重链缺少C端赖氨酸。
在一个实施方案中，提供由下列组成的药物制剂：(a)50mg/mL±7.5mg/mL的抗Ang-2抗体、(b)10mM±1.5mM组氨酸，pH6.0±0.5、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，及(d)10％w/v±1.5％蔗糖，其中(a)该抗体含有SEQ ID NO:18的HCVD以及SEQ ID NO:20的LCVD、(b)制剂中超过96％的抗体具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)制剂中至少53％的抗体具有约8.13±0.01的等电点、(d)制剂中约90％至约92％的抗体是岩藻糖基化的，及(e)约2.5％抗体的重链缺少C端赖氨酸。
在一个方面中，提供一种含有下列的药物制剂：(a)25±3.75mg/mL的抗Ang-2抗体、(b)10±1.5mM组氨酸，pH6.0±0.5、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，及(d)10％w/v±1.5％)蔗糖，其中(a)该抗体含有SEQ ID NO:18的HCVD以及SEQ ID NO:20的LCVD、(b)制剂中超过96％的抗体具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)制剂中至少53％的抗体具有约8.13±0.01的等电点、(d)制剂中约90％至约92％的抗体是岩藻糖基化的，及(e)约2.5％抗体的重链缺少C端赖氨酸。
在一个实施方案中，提供由下列组成的药物制剂：(a)25mg/mL±3.75mg/mL的抗Ang-2抗体、(b)10mM±1.5mM组氨酸，pH6±0.5、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，及(d)10％w/v±1.5％蔗糖，其中(a)该抗体含有SEQ ID NO:18的HCVD以及SEQ ID NO:20的LCVD、(b)制剂中超过96％的抗体具有150.9kDa±1kDa的分子量、(c)制剂中至少53％的抗体具有约8.13±0.01的等电点、(d)制剂中约90％至约92％的抗体是岩藻糖基化的，及(e)约2.5％抗体的重链缺少C端赖氨酸。
在一个方面中，提供了试剂盒，其含有前述方面中任一者的药物组合物、容器以及使用说明书。在一个实施方案中，容器为预充填注射器。在一个特定实施方案中，容器为硼硅酸小瓶，配有涂覆FLUROTEC的4023/50的橡胶瓶塞。
本发明的其它实施方案将透过参阅此后的详细说明而清楚明了。
详细说明
在说明本发明前，应了解，本发明不受限于所述的特定方法及实验条件，因为该等方法以及条件是可能改变的。亦应了解，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的，因为本发明的范围将仅受到随附的权利要求所囿限。
除非另有定义，否则本文所用全部技术与科学术语和本发明所属领域中普通技术人员一般所理解的意思相同。如本文所用，术语“约”，当提及特定引用的数值或数值范围时，表示该数值可相对于引用的数值改变不超过2％。例如，如本文所用，表述“约100”包括98与102，以及其间的所有数值(例如98.0、98.01、98.02、98.03、98.04…101.96、101.97、101.98、101.99、102.00)。
尽管任何与本文所述方法和材料类似或等效者可用于实施或测试本发明，现将说明较佳方法与材料。本文提及的全部公开文献以其全文并入本文做为参考文件来说明。
药物制剂
如本文所用，表述“药物制剂”意指至少一种活性成分(例如，小分子、大分子、化合物等，其能够在人类或非人类动物体内展现生物效用)以及至少一种非活性成分(其与活性成分或一种或多种其它非活性成分组合时，适于治疗性投药给人类或非人类动物)的组合。除非另有指明，否则如本文所用的术语“制剂”表示“药物制剂”。本发明提供包含至少一种治疗性多肽的药物制剂。依据本发明的某些实施方案，该治疗性多肽为抗体或其抗原结合片段，其特异结合至人血管生成素-2(Ang-2)蛋白质。更具体而言，本发明包括含有下列的药物制剂：(i)特异结合至人Ang-2的人抗体；(ii)组氨酸缓冲剂；(iii)为非离子型表面活性剂的有机共溶剂；以及(iv)为碳水化合物的热稳定剂。本发明所包括的特定例示性组分与制剂详述于下文。
特异结合至Ang-2的抗体
本发明的药物制剂可包含人抗体或其抗原结合片段，其特异结合至人Ang-2。如本文所用，术语“Ang-2”表示人血管生成素-2，其通常已知为Tie2活化的自体分泌拮抗剂。Ang-2在本领域中通常已知会“引发”血管内皮层接受细胞因子的作用。Ang-2在肿瘤血管中强烈表达，且通常被认为与其它细胞因子(亦即血管内皮生长因子)协同作用以促使血管新生和肿瘤进展。一个例示性人Ang-2氨基酸序列描述于SEQ ID NO:518中。针对人Ang-2的抗体描述于专利申请公开案US 2010/0166768、US2011/0065902、WO 2010/077854及US 2011/0027286中，其并入本文做为参考文件。
术语“抗体”，如本文所用，通常欲意指免疫球蛋白分子，其含有4个多肽链：藉由二硫键交互连结的2个重(H)链以及2个轻(L)链，及其多聚体(例如IgM)；然而，仅由重链所构成的免疫球蛋白分子(亦即缺乏轻链)亦含括在术语“抗体”的定义内。各个重链含有重链可变区(此处缩写为HCVR或VH)以及重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域，为CH1、CH2以及CH3。各个轻链含有轻链可变区(此处缩写为LCVR或VL)以及轻链恒定区。轻链恒定区含有1个结构域(CL1)。VH与VL区可进一步分为具有超变性的区域(命名为互补决定区(complementarity determining regions,CDR))，散布有较为保守的区域(命名为构架区(FR))。各个VH与VL由3个CDR以及4个FR所构成，以下列顺序从氨基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
除非另有特别指明，否则术语“抗体”，如本文所用，应理解为含括完整抗体分子以及其抗原结合片段。术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或仅称为“抗体部分”或“抗体片段”)，如本文所用，意指抗体的一或多个片段，其保有特异结合至人Ang-2或其表位的能力。
术语“经分离抗体”，如本文所用，欲意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异结合人Ang-2的经分离抗体基本上不含特异结合人Ang-2以外的抗原的抗体)。
术语“特异结合”或类似术语，意指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异结合的特征在于解离常数为至少约1x10-6M或更高。用于测定两个分子是否特异结合的方法为本领域中已知的，且包括例如平衡透析、表面等离子体共振及类似方法。但是，特异结合人Ang-2的经分离抗体与其它抗原(诸如其它物种的Ang-2分子(直向同源物))具有交叉反应性。在本发明的上下文中，结合至人Ang-2以及一种或多种其它抗原的多特异性(例如双特异性)抗体被视为“特异结合”人Ang-2。此外，经分离抗体可以基本上不含其它细胞物质或化学品。
可含括在本发明药物制剂中的例示性抗人Ang-2抗体述于专利申请公开案US 2010/0166768、US 2011/0065902、US 2011/0027286及WO2010/077854中，其揭示内容以其整体并入本文做为参考文件。
依据本发明的某些实施方案，抗人Ang-2HIH685P抗体为人IgG1，其含有重链可变区(为IGHV3-13.01亚型)以及轻链可变区(为IGKV3-20.01亚型)(参见Barbie和Lefranc,The Human Immunoglobulin KappaVariable(IGKV)Genes and Joining(IGKJ)Segments,Exp.Clin.Immunogenet.1998；15:171-183；以及Scaviner,D.等人，Protein Displaysof the Human Immunoglobulin Heavy,Kappa and Lambda Variable andJoining Regions,Exp.Clin.Immunogenet.,1999；16:234-240)。本文中出现的生殖系IGHV3-13与IGKV3-20序列，以及氨基酸位置分派数与国际免疫遗传学(IMGT)信息***一致，如Lefranc,M.-P.,等人，theinternational ImMunoGeneTics informationNucl.Acids Res,37,D1006-D1012(2009)中所述。
在一些实施方案中，抗人Ang-2HIH685P相对于正统重链可变区含有至少一个氨基酸置换，造成CDR中的肽链的旋转角度改变，合理预期相对于生殖系IGHV3-13序列改变抗体的暴露表面。在一些实施方案中，氨基酸置换包含在IGHV3-13的CDR2中的位置39处脯氨酸置换异亮氨酸。
在一些实施方案中，抗人Ang-2HIH685P抗体含有至少一个氨基酸置换，其在生殖系IGKV3-20的第三CDR中产生电荷改变。在一些实施方案中，氨基酸置换(等)是选自由下列所组成的组：(a)在IGHV3-20的CDR3中(例如在位置106处)碱性氨基酸置换无带电极性氨基酸，及(b)在IGKV3-20的CDR3中(例如在位置108处)酸性氨基酸置换无带电极性氨基酸。CDR表面的电荷表现变化预期影响抗体与溶剂的交界处，且因而对于维持或增进抗体在溶液中的稳定性来说产生不可预测的情况。
依据本发明的某些实施方案，抗人Ang-2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4的重链互补决定区(HCDR)1、SEQ ID NO:6的HCDR2及SEQ ID NO:8的HCDR3。在某些实施方案中，抗人Ang-2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:18的HCVD。
依据本发明的某些实施方案，抗人Ang-2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:12的轻(κ)链互补决定区(LCDR)1、SEQ ID NO:14的LCDR2及SEQ ID NO:16的LCDR3。在某些实施方案中，抗人Ang-2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:20的LCVD。
本文实施例中所用非限制性例示性抗体意指“HIH685P”，如在US2011/0027286中所述。该抗体包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，其具有SEQ ID NO:18/20，及由SEQ ID NO:4-6–8/SEQ ID NO:12-14-16所表示的HCDR1-HCDR2-HCDR3/LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域。
本发明药物制剂中所包含的抗体或其抗原结合片段的数量可随着制剂所要的特定特性以及特定环境与要使用制剂的目的而改变。在某些实施方案中，药物制剂为液体制剂，其可含有5±0.75mg/mL至150±22.5mg/mL抗体；7.5±1.125mg/mL至140±21mg/mL抗体；10±1.5mg/mL至130±19.5mg/mL抗体；12.5±1.875mg/mL至120±18mg/mL抗体；15±2.25mg/mL至110±16.5mg/mL抗体；17.5±2.625mg/mL至100±15mg/mL抗体；20±3mg/mL至90±13.5mg/mL抗体；22.5±3.375mg/mL至80±12mg/mL抗体；25±3.75mg/mL至70±10.5mg/mL抗体；27.5±4.125mg/mL至60±9mg/mL抗体；30±4.5mg/mL至50±7.5mg/mL抗体；25±3.75mg/mL抗体；或50±7.5mg/ml。例如，本发明制剂可含有约20mg/mL；约25mg/mL；约30mg/mL；约35mg/mL；约40mg/mL；约45mg/mL；约50mg/mL；约55mg/mL，或约60mg/mL抗体或其抗原结合片段，其特异结合至人Ang-2。
赋形剂和pH
本发明药物制剂包含一种或多种赋形剂。术语“赋形剂”，如本文所用，意指任一种被添加至制剂以提供所要稠度、黏度或稳定效用的非治疗性药剂。
在某些实施方案中，本发明药物制剂包含至少一种在剧烈操作或振荡(诸如涡卷)的条件下呈稳定人Ang-2抗体的类型与数量的有机共溶剂。在一些实施方案中，“稳定”表示在剧烈操作过程中预防抗体总数(以摩尔为基准)超过4％团聚抗体形成。在一些实施方案中，剧烈操作为涡卷含有抗体及有机共溶剂的溶液历时约60分钟或约120分钟。
在某些实施方案中，有机共溶剂为非离子型表面活性剂，诸如烷基聚(环氧乙烯)。可包括在本发明制剂中的特定非离子型表面活性剂包括，例如聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯28、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯81及聚山梨醇酯85；帕洛沙姆，诸如帕洛沙姆181、帕洛沙姆188、帕洛沙姆407；或聚乙二醇(PEG)。聚山梨醇酯20亦已知为TWEEN20、山梨醇单月桂酸酯和聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酯。帕洛沙姆188亦已知为普朗尼克(PLURONIC)F68。
本发明药物制剂中所含的非离子型表面活性剂数量可随制剂所需的特定特性，以及特定环境与要使用制剂的目的而改变。在某些实施方案中，制剂可含有0.01％±0.0015％至1％±0.15％表面活性剂。例如，本发明制剂可含有约0.0085％；约0.01％；约0.02％；约0.03％；约0.04％；约0.05％；约0.06％；约0.07％；约0.08％；约0.09％；约0.1％；约0.11％；约0.12％；约0.13％；约0.14％；约0.15％；约0.16％；约0.17％；约0.18％；约0.19％；约0.20％；约0.21％；约0.22％；约0.23％；约0.24％；约0.25％；约0.3％；约0.4％；约0.5％；约0.6％；约0.7％；约0.8％；约0.9％、约1％；约1.1％；约1.15％：或约1.2％聚山梨醇酯20或帕洛沙姆188。
本发明的药物制剂亦可包含一种或多种呈在热应力条件下稳定人Ang-2抗体的类型及数量的稳定剂。在一些实施方案中，“稳定”表示当含有抗体及热稳定剂的溶液在约45℃持续至高约28天时，超过约93％的抗体维持其天然构象。在一些实施方案中，“稳定”表示当含有抗体及热稳定剂的溶液在约45℃持续至高约28天时，其中少于约4％的抗体团聚。在一些实施方案中，“稳定”表示当含有抗体及热稳定剂的溶液在约37℃持续至高约28天时，超过约96％的抗体维持其天然构象。在一些实施方案中，“稳定”表示当含有抗体及热稳定剂的溶液在约37℃持续至高约28天时，其中少于约2％的抗体团聚。如本文所用，“天然”表示依据大小排阻的主要抗体形式，其通常为抗体的完整单体。
在某些实施方案中，热稳定剂为糖或糖醇，选自于蔗糖、山梨糖醇、甘油、海藻糖及甘露糖醇或其任何组合，制剂中所含数量可随着特定环境及要使用制剂的目的而改变。在某些实施方案中，制剂可含有约3％至约20％糖或糖醇；约4％至约19％糖或糖醇；约5％至约18％糖或糖醇；约6％至约17％糖或糖醇；约7％至约16％糖或糖醇；约8％至约15％糖或糖醇；约9％至约16％糖或糖醇；约7％至约13％糖或糖醇；约8％至约12％糖或糖醇；约9％至约11％糖或糖醇；或约10％糖或糖醇。例如，本发明药物制剂可含有4％±0.6％；5％±0.75％；6％±0.9％；7％±1.05％；8％±1.2％；9％±1.35％；10％±1.5％；11％±1.65％；12％±1.8％；13％±1.95％；或约14％±2.1％糖或糖醇(例如，蔗糖、海藻糖或甘露糖醇)。
本发明的药物制剂亦可含有缓冲剂或缓冲***，其作为维持稳定pH并有助于稳定人Ang-2抗体。在一些实施方案中，“稳定”表示当含有抗体及缓冲剂的溶液在45℃维持多达约28天时，少于5％±0.5％或不超过4.3％抗体团聚。在一些实施方案中，“稳定”表示当含有抗体及缓冲剂的溶液在45℃维持多达约28天时，至少92％±0.5％抗体呈其天然构象，如同藉由大小排阻层析所测定。“天然”或“天然构象”表示未团聚或分解的抗体部分。这通常是藉由测量抗体实体的相对大小的分析(诸如大小排阻层析分析)来决定。非团聚及非分解抗体在与天然抗体相同的级分中洗脱出来，且通常是主要洗脱级分。团聚抗体在表示尺寸大于天然抗体的级分中洗脱出来。分解抗体在表示尺寸小于天然抗体的级分洗脱出来。
在一些实施方案中，“稳定”表示当含有抗体及缓冲剂的溶液在45℃维持多达约28天时，至少52％±0.5％抗体呈其主要电荷形式，如同藉由阳离子交换层析所测定。“主要电荷”或“主要电荷形式”表示抗体在主峰中从离子交换树脂洗脱出来的级分，其通常一侧为更“碱性”峰而另一侧为更“酸性”峰。
本发明药物制剂可具有约5.5至约6.5的pH。例如，本发明制剂具有约5.5；约5.6；约5.7；约5.8；约5.9；约6.0；约6.1；约6.2；约6.3；约6.4；或约6.5的pH。在一些实施方案中，pH为6.0±0.4；6.0±0.3；6.0±0.2；6.0±0.1；约6.0；或6.0。
在一些实施方案中，缓冲剂或缓冲***包含至少一种具有完全含括pH5.5-7.4或pH5.5-7.4的一部分的缓冲范围。在一个实施方案中，缓冲剂具有约6.0±0.5的pKa。在某些实施方案中，缓冲剂具有组氨酸缓冲剂。在某些实施方案中，组氨酸以5mM±0.75mM至15mM±2.25mM；6mM±0.9mM至14mM±2.1mM；7mM±1.05mM至13mM±1.95mM；8mM±1.2mM至12mM±1.8mM；9mM±1.35mM至11mM±1.65mM；10mM±1.5mM；或约10mM的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲***包含10mM±1.5mM，pH为6.0±0.3或6.4±0.3的组氨酸。
例示性制剂
依据本发明的一个方面，药物制剂为低黏度(例如具有低于10厘泊或约1.4±0.21厘泊)，大体上生理等张(亦即介于300至400mOsm或约363±54mOsm)的液体制剂，其含有：(i)特异结合至人Ang-2(例如HIH685P)的人抗体，浓度为25mg/mL±3.75mg/mL，或50mg/mL±7.5mg/mL；(ii)缓冲***，在约pH6.0±0.3下提供充分缓冲；(iii)糖，尤其做为热稳定剂；以及(iv)有机共溶剂，若为抗体的话，所述有机共溶剂保护抗体的结构完整性。
依据一个实施方案，药物制剂包含：(i)人IgG1抗体，特异结合至人Ang-2，且其含有经取代IGHV3-13.01型重链可变区及经取代IGKV3-20.01型轻链可变区(例如，HIH685P)，浓度为20±3mg/mL至约60±9mg/mL；(ii)含有组氨酸的缓冲***，其在约pH6.0±0.3有效地缓冲；(iii)蔗糖；及(iv)非离子型去污剂，诸如聚山梨醇酯。
依据一个实施方案，药物制剂包含：(i)人IgG1抗体，其特异结合至人Ang-2，且其具有SEQ ID NO:4的HCDR1、SEQ ID NO:6的HCDR2、SEQ ID NO:8的HCDR3、SEQ ID NO:14的LCDR1、SEQ ID NO:14的LCDR2及SEQ ID NO:16的LCDR3，浓度为约25mg/ml±3.75mg/mL；(ii)10mM±1.5mM的组氨酸，其在pH6.0±0.3下进行缓冲；(iii)10％w/v±1.5％w/v的蔗糖；及(iv)0.2％w/v±0.03％w/v聚山梨醇酯20。
依据一个实施方案，药物制剂包含：(i)人IgG1抗体，其特异结合至人Ang-2，且其具有SEQ ID NO:4的HCDR1、SEQ ID NO:6的HCDR2、SEQ ID NO:8的HCDR3、SEQ ID NO:14的LCDR1、SEQ ID NO:14的LCDR2及SEQ ID NO:16的LCDR3，浓度为约50mg/ml±7.5mg/mL；(ii)10mM±1.5mM的组氨酸，其在pH6.0±0.3下进行缓冲；(iii)10％w/v±1.5％w/v的蔗糖；及(iv)0.2％w/v±0.03％w/v聚山梨醇酯20。
依据一个实施方案，药物制剂包含：(i)人IgG1抗体，其特异结合至人Ang-2，且其具有SEQ ID NO:18的重链可变域，以及SEQ ID NO:20的轻链可变域，浓度为25mg/ml±3.75mg/mL；(ii)10mM±1.5mM的组氨酸，其在pH6.0±0.3下进行缓冲；(iii)10％w/v±1.5％w/v的蔗糖；及(iv)0.2％w/v±0.03％w/v聚山梨醇酯20。
依据一个实施方案，药物制剂包含：(i)人IgG1抗体，其特异结合至人Ang-2，且其具有SEQ ID NO:18的重链可变域，以及SEQ ID NO:20的轻链可变域，浓度为约50mg/ml±7.5mg/mL；(ii)10mM±1.5mM的组氨酸，其在pH6.0±0.3下进行缓冲；(iii)10％w/v±1.5％w/v的蔗糖；及(iv)0.2％w/v±0.03％w/v聚山梨醇酯20。
本发明所含括的药物制剂的其它非限制性实例在本文他处说明，包括如下所示的工作例。
药物制剂的稳定性与黏度
本发明药物制剂通常表现出高度稳定性。术语“稳定”，如本文所用，在提及药物制剂时，表示药物制剂中的抗体在储存于特定条件下之后保有可接受程度的化学结构或生物功能。制剂可以是稳定的，尽管其中所含抗体在储存特定时间数之后并未100％维持其化学结构或生物功能。在某些情况下，在储存特定时间数之后维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能被认为是“稳定”。
稳定性尤其可于特定温度下储存特定时间量之后藉由测定制剂中维持的天然抗体百分比来决定。天然抗体的百分比尤其可以藉由大小排阻层析(例如大小排阻高效液相层析[SE-HPLC])来测定诸如天然平均非团聚者及非分解者。当“可接受程度的稳定性”这个词组用于本文中时，表示至少90％的天然形式抗体可于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中检测到。在某些实施方案中，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的天然形式抗体可于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中检测到。在其后测量稳定性的特定时间量可为至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评估稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为下列的任一温度：约-80℃至约45℃，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃。例如，若在储存于5℃9个月之后，藉由SE-HPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％天然抗体，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于25℃6个月之后，藉由SE-HPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于37℃28天之后，藉由SE-HPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于45℃28天之后，藉由SE-HPLC检测到超过约93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于-20℃6个月之后，藉由SE-HPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于-30℃6个月之后，藉由SE-HPLC检测到超过约96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。在储存于-80℃6个月之后，藉由SE-HPLC检测到超过约97％、97.5％、98％、98.5％、99％或99.5％天然抗体，则药物制剂亦可被视为是稳定的。
稳定性尤其可藉由测定在特定温度下储存特定时间量之后，制剂中抗体形成团聚体的百分比来测量，其中稳定性与形成团聚体的百分比呈反比。团聚抗体百分比尤其可藉由大小排阻层析(例如，大小排阻高效液相层析[SE-HPLC])来测定。当“可接受程度的稳定性”这个词组用于本文中时，表示至多6％的抗体于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中检测到为团聚体形式。在某些实施方案中，可接受程度的稳定性表示至多约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中检测到为团聚体形式。在其后测得稳定性的特定时间量可为至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评估稳定性时，药物制剂储存的特定温度可为约-80℃至约45℃的任一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或约45℃。例如，若在储存于5℃9个月之后，检测到少于约2％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％抗体呈团聚形式，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于25℃6个月之后，检测到少于约2％、1.75％、1.5％、1.25％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或0.1％抗体呈团聚形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于45℃28天之后，检测到少于约4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.5％或0.1％抗体呈团聚形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于-20℃、-30℃或-80℃3个月之后，检测到少于约2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1％、0.5％或0.1％抗体呈团聚形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。
稳定性尤其可藉由测定抗体在离子交换(“酸性形式”)期间移至比抗体主要级分(“主要电荷部分”)更为酸性的级分的百分比来测量，其中稳定性与呈酸性形式的抗体级分呈反比。尽管不希望受到理论所囿限，抗体的去酰胺化可使得抗体变为更加带负电并因而相对于非去酰胺化抗体更为酸性(参见，例如Robinson,N.,Protein Deamidation,PNAS,2002年4月16日,99(8):5283-5288)。“酸化”抗体百分比尤其可藉由离子交换层析(例如，阳离子交换高效液相层析[CEX-HPLC])测定。当“可接受程度的稳定性”这个词组用于本文中时，表示于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中至多52％抗体呈更为酸性的形式。在某些实施方案中，可接受程度的稳定性表示于特定温度下储存特定时间量之后在制剂中至多约52％、50％、45％、40％、35％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈酸性形式。其后测量稳定性的特定时间量可为至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更久。当评估稳定性时，储存药物制剂的温度可为约-80℃至约45℃的任一温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃或约45℃。例如，若在储存于-80℃、-30℃或-20℃3个月之后，少于约29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂可被视为是稳定的。若在储存于5℃9个月之后，少于约28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于25℃28天后，少于约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于37℃28天之后，检测到少于约37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。若在储存于45℃28天之后，检测到少于约52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％抗体呈更为酸性的形式，则药物制剂亦可被视为是稳定的。
测量抗体对其目标的结合亲和力亦可用于评估稳定性。例如，若在储存于例如-80℃、-30℃、-20℃、5℃、25℃、37℃、45℃等温度下特定时间量(例如14天至6个月)之后，制剂中所含抗Ang-2抗体以储存前该抗体结合亲和力的至少84％、90％、95％或更高结合至Ang-2，本发明制剂可被视为是稳定的。结合亲和力可藉由，例如ELISA或等离子体共振来测定。生物活性可藉由Ang-2活性分析(诸如，例如使表达Ang-2的细胞与包含抗Ang-2抗体的制剂接触)来测定。抗体结合至此种细胞可直接藉由诸如，例如经由FACS分析来测定。备选地，可在抗体存在时测量Ang-2***的下游活性，并且与抗体不存在时Ang-2***的活性相比较。在一些实施方案中，Ang-2对细胞来说是内源性的。在其它实施方案中，Ang-2在细胞中异位地表达(即，异源表达)。
用于评估制剂中的抗体稳定性的其它方法在下面所示实例中证实。
容器和投药方法
本发明药物制剂可包含在任一种适于储存或投与药品及其它治疗性组合物的容器中。例如，药物制剂可包含在密封与灭菌的具有预定体积的塑料或玻璃容器中，例如小瓶、安瓿、注射器、药匣、瓶或IV袋中。不同类型的小瓶可用于容纳本发明制剂，包括，例如透明与不透明(例如琥珀色)玻璃或塑料小瓶。同样地，任何类型的注射器可用于容纳或投与本发明的药物制剂。
本发明的药物制剂可包含在“标准钨”注射器或“低钨”注射器中。如本领域技术人员所知，制造玻璃注射器的工艺通常涉及使用高钨杆(其作用为刺穿玻璃)，从而由其产生一个液体可被抽出并排出注射器的孔洞。此工艺使微量钨沉积在注射器的内表面。之后的洗涤与其它加工步骤可用于降低钨在注射器中的量。如本文所用，术语“标准钨”表示注射器含有超过或等于500ppb的钨。术语“低钨”表示注射器含有少于500ppb的钨。例如，依据本发明，低钨注射器可含有少于约490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更低ppb的钨。
注射器中所使用的橡胶塞盖，以及用于密封小瓶开口的橡胶瓶盖可经涂层以防止注射器或小瓶的药物内容物污染，或维持其稳定性。因此，依据某些实施方案，本发明药物制剂可包含在具有经涂覆塞盖的注射器内，或在以经涂覆橡胶瓶盖密封的小瓶内。例如，塞盖或瓶盖可涂覆有氟碳化物膜。适用于与含有本发明药物制剂的小瓶及注射器一起使用的经涂覆塞盖或瓶盖的实例述于，例如美国专利第4,997,423号；第5,908,686号；第6,286,699号；第6,645,635号及第7,226,554号，其内容以其整体并入本文做为参考文件。可用于本发明上下文内的特定例示性经涂覆橡胶瓶盖与塞盖可在商业上以商标名由West Pharmaceutical Services,Inc.(Lionville,PA)取得。是一种用于使药品尽可能不附着于橡胶表面或防止药品附着于橡胶表面的氟碳化物涂层。
依据本发明的某些实施方案，药物制剂可包含于具有经氟碳化物涂覆的塞盖的低钨注射器内。
药物制剂可以藉由非经肠途径投药给患者，诸如注射(例如皮下、静脉内、肌内、腹膜内等)，或经皮、黏膜、鼻、肺或经口投药。许多可重复使用笔型或自动注射递送装置可用于皮下递送本发明的药物制剂。实例包括，但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II与III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM、以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)。应用在皮下递送本发明药物制剂的抛弃式笔型或自动注射递送装置的实例包括，但不限于SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)、以及HUMIRATMPen(Abbott Labs,Abbott Park,IL)。
在本文中亦预期使用微输注器递送本发明的药物制剂。如本文所用，术语“微输注器”表示被设计成在一段长时间内(例如约10、15、20、25、30或更多分钟)缓慢地投与大量(例如多达约2.5mL或更多)治疗制剂的皮下递送装置。参见，例如U.S.6,629,949；US 6,659,982以及Meehan等人，J.Controlled Release46:107-116(1996)。微输注器尤其可用于递送大剂量的治疗性蛋白(具有高浓度)(例如，约100、125、150、175、200或更多mg/mL)或黏性溶液。
在一个实施方案中，药物制剂是经IV滴注投与，使得制剂稀释于含有生理学上可接受溶液中的IV袋中。在一个实施方案中，药物制剂是静脉内输注袋的复合无菌制剂，使得单剂量药品稀释至100mL、250mL(或适于静脉内滴注投递的其它可行量)的生理缓冲液(例如0.9％食盐水)中。在一些实施方案中，输注袋是由聚氯乙烯(例如VIAFLEX,Baxter,Deerfield,Illinois)制成。在一些实施方案中，输注袋是由聚烯烃(EXCEL IV Bags.Braun Medical Inc.,Bethlechem,Pennsylvania)制成。
药物制剂的治疗用途
本发明的药物制剂尤其可用于治疗、预防或改善与Ang-2活性有关的任何疾病或病症，包括由Ang-2所介导的疾病或病症。可经由投与本发明药物制剂而治疗或预防的例示性、非限制性疾病与病症包括各种涉及血管新生的疾病，而血管新生为新血管形成的生物过程。异常血管新生与数种疾病病况有关，包括(例如)增生性视网膜病变、类风湿性关节炎和牛皮癣。另外，已证实血管新生对于肿瘤生长与维持至关重要。
实施例
提出下列实施例以将如何制造与使用本发明方法和组合物的完整揭示内容以及发明说明提供给本领域普通技术人员，且不欲限制发明人就其发明所视为的范畴。已尽力确保所用数字的正确性(例如数量、温度等)，但可能产生某些实验误差与偏差。除非另有指明，否则份为以摩尔计的份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，而压力为大气压或近乎大气压。
初始制剂研发行动涉及以实验为基础的实验和筛选抗Ang-2抗体的液体和冻干制剂中的有机共溶剂、热稳定剂和缓冲剂，以鉴定与蛋白质兼容且增强其稳定性，同时维持相近的生理渗透性与低黏度供静脉内和皮下注射用的赋形剂。亦测试了缓冲条件以确定最高蛋白质稳定性的最佳pH。
实施例1：研发抗Ang-2制剂
制剂研发行动包括筛选抗Ang-2抗体的液体制剂中的缓冲剂、有机共溶剂和热稳定剂，以鉴定会增强蛋白质稳定性的赋形剂。亦测试了缓冲条件以确定最高蛋白质稳定性的最佳pH。由这些研究所产生的结果用于研发稳定的临床用液体制剂。抗Ang-2(例如HIH685P)被调配成25±3.75mg/ml与50±7.5mg/ml。在一个实施方案中，抗Ang-2抗体被调配于10±1.5mM组氨酸(pH6.0±0.3)、0.2％±0.03％聚山梨醇酯20、10％±1.5％蔗糖中。
实施例2：缓冲剂和pH
考虑pH与缓冲剂类型对于抗Ang-2稳定性的影响。在45℃将25mg/mL HIH685P培育于乙酸盐(pH5.0-5.5)、柠檬酸盐(pH5.5-6.0)、琥珀酸盐(pH6.0)、组氨酸(pH5.5-6.5)、磷酸盐(pH6.0-8.0)或Tris(pH8.0)缓冲剂中，以评估缓冲剂与pH对于蛋白质的热稳定性的影响(表1)。就HIH685P的制剂而言，依据大小排阻层析(SE-HPLC)的蛋白质稳定性分析揭示，乙酸盐(pH5.5)、磷酸盐(pH6.0)、组氨酸(pH5.5-6.5)、与琥珀酸盐表现得比其它缓冲***更好。当HIH685P以pH6.0调配于组氨酸缓冲剂中时，观察最高蛋白质稳定性，如同藉由阳离子交换层析(CEX HPLC)所测定。这些分析亦揭示，抗体分解主要形成团聚体、分解产物及电荷变体。HIH685P稳定性的最佳pH在组氨酸缓冲剂中经观察为6.0，尽管在5.5至6.5的pH范围内观察到良好稳定性。根据这些结果，选定在pH6.0时的10mM组氨酸缓冲剂来调配抗体药品(DP)。
表1：在45℃培育28天，缓冲剂与pH对于HIH685P稳定性的影响
就表1中所示的结果而言，在45℃测试具有经涂覆的4432/50丁基橡胶档塞的2mL第1型硼硅酸玻璃小瓶中于10mM测试缓冲剂中的0.35mL25mg/mL HIH685P历时28天。1浊度被报导为在405nm处相较于起始材料在OD上的相对变化。2SE-HPLC与CEX-HPLC起始材料结果为所有14种制剂的起始材料的平均值。OD＝光学密度；RP-HPLC＝逆相高效液相层析；SE-HPLC＝大小排阻高效液相层析；CEX-HPLC＝阳离子交换高效液相层析。
实施例3：筛选对抗振荡应力的保护剂
当历经振荡应力时，HIH685P抗Ang-2抗体(亦即药物物质(DrugSubstance)或“DS”)表现出的稳定性有限。经振荡DS的浊度分析证明，当HIH685P振荡历时120分钟，在405nm处的光学密度(OD)增加(表2，参见无共溶剂数据)。这个在浊度上的增加指出，因为振荡应力而明显形成颗粒。在无共溶剂存在下振荡制剂也会造成团聚形成明显增加。具有所评估的任一种共溶剂的制剂防止振荡依赖性浊度与HIH685P团聚体含量增加(表2)。但是，添加0.2％普朗尼克F68、20％PEG300、10％PEG300以及20％丙二醇至制剂明显降低HIH685P的热稳定性，如藉由SE-HPLC以及CEX-HPLC所测定(表3)。含有聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80以及PEG3350的制剂对于HIH685P的热稳定性没有明显影响，如藉由SE-HPLC以及CEX-HPLC所测定，使得这些共溶剂适用于HIH685P的制剂(表3)。就研发HIH685P制剂而言，因为聚山梨醇酯20相对于聚乙二醇稳定蛋白质对抗振荡应力，不影响其热稳定性，且需要低共溶剂浓度来稳定蛋白质，故其被选作为有机共溶剂。
就表2中所示的抗体稳定性结果，具有经涂覆的4432/50丁基橡胶档塞的2mL第1型硼硅酸玻璃小瓶中于10mM组氨酸、pH6.0至6.1中的0.8mL的5mg/mL HIH685P与有机共溶剂合并并进行120分钟涡旋。1浊度被报导为在405nm处相较于起始材料在OD上的相对变化。2SE-HPLC与CEX-HPLC起始材料结果为所有9种制剂的起始材料的平均值。OD＝光学密度；RP-HPLC＝逆相高效液相层析；SE-HPLC＝大小排阻高效液相层析。
表2：有机共溶剂对于抗体稳定性的影响－振荡
表3：有机共溶剂对于抗体稳定性的影响－热
就表3中所示的抗体稳定性结果而言，具有经涂覆的4432/50丁基橡胶档塞的2mL第1型硼硅酸玻璃小瓶中于10mM组氨酸、pH6.0至6.1中的0.35mL的5mg/mL HIH685P与有机共溶剂合并并在45℃28天。1浊度被报导为在405nm处相较于起始材料在OD上的相对变化。2SE-HPLC与CEX-HPLC起始材料结果为所有9种制剂的起始材料的平均值。OD＝光学密度；RP-HPLC＝逆相高效液相层析；SE＝大小排阻高效液相层析；CEX＝阳离子交换高效液相层析。
实施例4：筛选对抗热应力的保护剂
检验稳定剂(诸如糖、氨基酸及无机盐)增加HIH685P的热稳定性的能力。所检验的热稳定剂的归纳结果呈现于表4中。含有20％蔗糖、10％甘露糖醇以及20％海藻糖的制剂具有最低的HIH685P分解量，如藉由SE-HPLC与CEX-HPLC分析在热应力后所测得。但是，含有甘露糖醇的制剂使得蛋白质对于多次冷冻与解冻循环去稳定。当与蔗糖或海藻糖一起调配时，HIH685P对热应力具有类似的稳定性。就研发液体HIH685P制剂来说，选定蔗糖作为热稳定剂。
当在组氨酸、聚山梨醇酯20以及蔗糖存在下于pH6.0时，HIH685P表现最高稳定性。就HIH685P DP制剂而言，选定10％蔗糖，其接近于等渗透摩尔浓度。在研发HIH685P液体制剂期间所鉴定出的主要分解途径为形成团聚体、裂解产物，及电荷变体，其中当在45℃培育蛋白质时，观察到最高的分解速率(电荷变体增加)。
就表4中所示的抗体稳定性结果，0.35mL的10mM组氨酸(pH6.0至6.2)、0.2％聚山梨醇酯20与25mg/mL HIH685P加上所示的热稳定剂在具有经涂覆的4432/50丁基橡胶档塞的2mL第1型硼硅酸玻璃小瓶中45℃28天。1浊度被报导为在405nm处相较于起始材料在OD上的相对变化。2SE-HPLC与CEX-HPLC起始材料结果表示所有10种制剂的起始材料于45℃培育的平均值。OD＝光学密度；RP＝逆相高效液相层析；SE＝大小排阻高效液相层析；CEX＝阳离子交换高效液相层析。
表4：热稳定剂对于稳定性的影响
实施例5：稳定的液体药物制剂
总结来说，HIH685P DP在含有10mM组氨酸(pH6.0)、0.2％(w/v)聚山梨醇酯20、10％(w/v)蔗糖及25mg/mL HIH685P的经最佳化、水性缓冲制剂中被制造为液体。当历经各种应力条件，25mg/mL的HIH685PDP在物理上与化学上为稳定的(表5)。当DP经涡旋、冷冻并解冻数次，或在25℃培育14天时，对于pH、外观、浊度或HIH685P回收量没有影响。在37℃培育28天后，DP相对于未遭受应力样品的对照多降解0.6％(如藉由SE-HPLC分析所测定)，且多降解10.1％(主峰降低％)(如藉由CEX-HPLC分析所测定)。在45℃培育28天后，DP相较于未遭受应力的对照多降解3.6％(如藉由SE-HPLC分析所测定)以及多降解23.8％(主峰降低％)(如藉由CEX-HPLC分析所测定)。就遭受应力的任一个样品而言，没有观察到明显丧失效力(如使用下面所述HIH685P结合测定法所测定)。
表5：25mg/mL抗Ang-2抗体的应力稳定性
经调配HIH685P的效力是经由竞争夹心ELISA(结合测定法)藉由测量HIH685P阻断人血管生成素-2-His-标记融合蛋白(hAng2-His)结合至涂覆有人类Tie2-鼠科Fc-融合蛋白(hTie2-mFc)的盘上的能力。以不同数量的HIH685P滴定hAng2-His。假设单体分子量为50.1kDa来计算hAng2-His浓度。在转移至涂覆有hTie2-mFc的微量盘的前，于25℃培育配体-抗体复合物1小时。在1小时培育后，洗涤孔并且使用HRP-缀合抗His标记单克隆抗体检测结合的hAng2-His。所计算的IC50值(定义为阻断50％His-标记hAng2结合至Tie2-mFc所需的抗体浓度)，用作为阻断效力的指标。
就表5中所示的抗体稳定性结果，在具有经涂覆的4432/50丁基橡胶档塞的2mL第1型硼硅酸玻璃小瓶中0.35mL的10mM组氨酸(pH6.0至6.1)、0.2％聚山梨醇酯20、10％蔗糖与25mg/mL HIH685P与有机共溶剂合并并历经各种指定应力。4051浊度被报导为在405nm处相较于起始材料在OD上的相对变化。2结合测定法的可接受标准为50-150％参考标准品。OD＝光学密度；RP＝逆相高效液相层析；SE＝大小排阻高效液相层析；CEX＝阳离子交换高效液相层析。
实施例6：经调配的抗Ang-2抗体的稳定性
进行稳定性研究以测定含有25mg/mL抗体、10mM组氨酸(pH6.0±0.3)、0.2％聚山梨醇酯20及10％蔗糖的抗Ang-2抗体制剂的储存与应力稳定性。使用浊度与RP-HPLC分析来评估抗体的物理稳定性。物理稳定性定义为抗Ang-2抗体在溶液中的可溶形式的回收率。蛋白质损失可能是因为蛋白质沉淀或表面吸附。在溶液中存在颗粒可藉由视觉审视或藉由光学密度(OD)在405nm处测量(浊度测量)来检测。在光学密度分析中，OD增加表示浊度因为形成颗粒而增加。如藉由OD测量决定颗粒存在表示样品无法维持稳定性。抗体的回收率是藉由RP-HPLC来测量。在RP-HPLC测定法中，抗Ang-2抗体从逆相管柱中以单峰被洗脱出。各测试样品的浓度是由洗脱抗体峰面积相较于使用限定蛋白质加载量的抗体标准品产生的校正曲线而确定。
化学稳定性意指抗Ang-2抗体在样品中的化学结构完整性。大多数化学不稳定性可能是因为形成抗体的共价修饰形式(例如，共价团聚物、切割产物或电荷变体)，以及抗体的非共价修饰形式(例如非共价团聚物)。迄今，HIH685P已被检测到的仅有分解产物是分子量或电荷皆有所不同的形式。较高与较低分子量分解产物可藉由SE-HPLC从天然抗体被分离。天然物在大小排阻层析法中的百分比是藉由天然峰面积相对于所有抗Ang-2抗体峰的总面积的比例来确定。
抗Ang-2抗体的电荷变体形式是使用阳离子交换层析从天然抗体被分辨出。以比主峰的保留时间更早从CEX-HPLC管柱洗脱出的峰被标记为“酸性峰”，而那些以比主峰的保留时间更晚从CEX-HPLC管柱洗脱出者被标记为“碱性峰”。在阳离子交换层析法中的分解抗Ang-2抗体百分比是藉由主峰、酸性峰与碱性峰面积与所有抗Ang-2抗体峰的总面积相比较的相对百分比变化而确定。
在促进条件下藉由将抗体进行各种应力测试来进行抗体的评估。这些测试表示调配的药物物质在药物物质制造、储存或运输期间可能遭遇到的极端操作条件。经调配的抗Ang-2抗体被充填至5mL聚碳酸酯小瓶用于振荡、冷冻/解冻循环，以及冷冻储存条件。经调配抗体被充填至玻璃小瓶中以检验在高温下的应力稳定性。
实施例7：储存稳定性
当在-80℃、-30℃、-20℃及5℃储存历时6个月，以及在5℃历时9个月，在含有10mM组氨酸(pH6.0±0.3)、0.2％聚山梨醇酯20及10％蔗糖的25mg/mL HIH685P抗体制剂的物理与化学稳定性中观察到没有变化。在-80℃、-30℃及-20℃6个月分别观察到结合活性(上述的ELISA竞争测定法)上些微减少(亦即基线的～86％、～84％与～91％)。参见表6。
实施例8：应力稳定性
在10mM组氨酸(pH6.0±0.3)、0.2％聚山梨醇酯20、10％蔗糖中所调配的25mg/mL抗Ang-2(HIH685P)制剂的应力稳定性是藉由将制剂进行振荡、热应力(45℃、37℃、25℃)，以及冷冻解冻应力来进行识别。将0.35mL制剂充填至具有经FLUROTEC涂覆的4432/50丁基橡胶档塞的2mL第1型硼硅酸玻璃小瓶。结果呈现于表7中。
实施例9：分子量测定
使用一系列分析技术、生物化学与生物物理技术来表征经调配的HIH685P抗体。糖基化与去糖基化HIH685P抗体样品的重链与轻链的分子量是依据毛细电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)分析在还原条件下测定。样品在0.5％w/v十二烷基硫酸钠(SDS)以及40mM二硫苏糖醇中于60℃变性历时10分钟。在变性与还原之后，添加1xG7缓冲液v/v(1％Nonidet40以及50mM磷酸钠pH7.5)至样品中。藉由添加1250单位的肽N-糖基苷酶F(PNGase F)并在37℃培育3小时而达到HIH685P(50μg)的去糖基化。除了在3小时培育时省略PNGase F酶以外，以类似方法制备未经处理的对照样品。在培育之后将样品去盐以移除可能干扰CE-SDS分析的反应缓冲剂成分。去盐的样品在1％w/v SDS与4.5％w/vβ-巯基乙醇中完全变性并在80℃培育10分钟。对各样品添加10kDa分子量标准品(BeckmanCoulter)并用作为内部标准品以确定峰特性并计算蛋白质的迁移率。
表6：25mg/mL HIH685P抗体在10mM组氨酸(pH6.0)、0.2％聚山梨醇酯20、10％蔗糖中的稳定性
在HIH685P未经处理对照样品的电泳图中观察到三个主要峰。峰1表示具有计算分子量为约28kDa的还原轻链(34.0-34.1％总峰面积)。峰2与峰3分别表示非糖基化重链(～51kDa；3.1-3.8％)与糖基化重链(～56kDa；62.2-62.8％总峰面积)。重链与轻链(峰1、2及3)的总和代表≧99％针对HIH685P批次样品藉由此方法所检测到的总峰百分比。
表7：应力稳定性
在经PNGase F处理的样品中，每一电泳图中峰3强度的实质降低与峰2强度的同时增加偶联在一起，表示从糖基化重链移除糖链。在经PNGase F处理的HIH685P批次样品的毛细电泳之后，由电泳图产生的峰2的平均校正峰面积百分比(66％)相等于对照、非PNGase F处理样品的毛细电泳后产生的峰2与3的平均峰面积百分比平均值的总和(66％)，表示重链在PNGase F培育之后完全去糖基化。如预期的那样，轻链的分子量及相对移动时间没有改变。
多角度激光散射(MALLS)是一种分析方法，提供蛋白质或糖蛋白分子量的估算值。藉由将光线散射检测器的流动室连接至凝胶过滤管柱来进行各分离的药物物质成分的分子量分析，以分析天然HIH685P的摩尔质量(SEC-MALLS)。藉由差异性折射率与吸光度检测器监测蛋白质浓度。经调配的HIH685P批次样品被直接注入TSK Gel G3000SWxl(TosohBiosciences,cat08541；管柱尺寸0.78cmx30cm，5μm粒径，和孔隙度为)，在10mM磷酸钠、500mM NaCl、pH6.1缓冲液(SEC缓冲液)中预平衡。藉由Astra软件(Wyatt Technology)使用比折射率增量分析数据，比折射率增量定义为折射率变化除以蛋白质浓度变化(dn/dc)，针对移动相缓冲剂的高离子强度进行校正。依据SEC-MALLS分析，HIH685P的主峰(峰4，洗脱体积为～7.9mL)对应于约151kDa的分子量。针对主峰(峰4)所鉴定的摩尔质量对应于完整抗Ang-2抗体，其为存在于溶液中的主要形式(总蛋白质峰面积的96.1-96.9％)。在测试的所有经调配HIH685P样品中检测到非常小百分比的两个高分子量形式(对应于峰2(洗脱体积为～6.2mL)以及峰3(洗脱体积为6.5mL))与两个小分子量形式(对应于峰5(洗脱体积为～8.4mL)以及峰6(洗脱体积为～9.8mL))。由峰3(洗脱体积为～6.5mL)的计算摩尔质量约为300kDa，与HIH685P抗体的二聚体形式一致，且代表一小部分(1.5-1.9％)的总抗体分子量形式存在于溶液中。峰5的计算分子量(洗脱体积为～8.4mL)约为66kDa，且代表≦1.5％的总分子量形式存在于样品中。峰6代表～0.2-0.3％的总峰面积。HIH685P药物物质的SEC-MALLS分析结果证实，大多数蛋白质以具有平均摩尔质量为约151kDa的完整抗体形式存在。
进一步分析独立批次的经调配HIH685P以通过质量测定来证实完整蛋白质的分子量。将1.5μg的各蛋白质样品注射至与Waters Synapt质谱仪偶接的1.7μm BEH130C18管柱上以供进行质量测定。使用最大熵算法以迭代反卷积完整蛋白质的ESI-TOF质谱。基于HIH685P的重链与轻链cDNA序列，预测完整抗体(其中重链C端Lys被移除)具有144604.4Da的分子量。完整HIH685P批次的反卷积质谱显示类似的模式，其中各个含有多峰的谱在146道尔顿(岩藻糖基)或162道尔顿(半乳糖)有所不同，暗示存在与微不均匀性相关的糖基化。这些聚糖质量是藉由将所观察到的完整质量减去预测分子量144604.4而获得。举例而言，第二个ESI/MS峰具有m/z147493Da，在144604.4Da的完整MAb MW较少，留下2889Da的聚糖质量。因为聚糖被添加至Fc的两侧，一个聚糖质量应为1445Da。
这些聚糖质量被用来分派主要HIH685P聚糖结构形式。分析显示，这些聚糖主要由岩藻糖基基化复合双触结构所组成，其在糖基链末端具有0、1和2个半乳糖。蛋白质氨基酸序列的预测与观察质量的质量差(4道尔顿)在Synapt MS的质量正确性规定范围内。这些结果确认，在一级序列层次证实了HIH685P的身份。
实施例10：等电点测定
藉由一维等电聚焦(IEF)在自然条件下分析HIH685P以测定完整抗体的等电点(pI)。研究中包括一系列的pI标准品，其具有能被胶体蓝(Colloidal blue)染色所看到的蛋白质带。HIH685P的所有样品制备物表现总计8个强度不一的带，其在pI为7.9至8.4之间移动，主要形式的pI为8.2。移动至pI约8.2处的带表现出比完整抗体的预期pI8.6略低的pI。主要带最可能代表缺少C端赖氨酸的完全糖基化完整抗体(预测pI为8.54)。这个解释与在蛋白质水解消化与逆相分离后的重链质谱分析一致。在质谱分析中，HIH685P重链的主要C端肽被观察到缺少末端赖氨酸残基，其被预测由cDNA序列所呈现。观察到三个次要碱性变体(对应于pI范围为8.3-8.4)。在不希望受到理论所囿限的情况下，这些次要形式可能代表抗体的部分形式，诸如仅具有重链二聚体的抗体形式(预测pI为8.9)，或缺少一或两个C端赖氨酸的重链二聚体。备选地，这些形式可能与少量的完整抗体的带电变体形式(含有一或两个C端赖氨酸)相符。这个解释与重链在胰蛋白酶消化与藉由逆相层析分离肽之后的质谱分析一致。约2.5％的HIH685P重链经质谱仪鉴定含有C端赖氨酸。
HIH685P的κ轻链的天然单体形式的pI预测为6.4。在所用条件下没有检测到对应于pI为6.4的带，暗示最低(若有的话)量的游离轻链存在于经调配的HIH685P制备物中。尽管目前尚未被鉴定，但是四个相对于主要带(对应于pI范围为7.9-8.1)移动至更为酸性pH的额外次要带存在于所有测试样品中，且被推测表示具有去酰胺化形式的完整、糖基化抗体、不正确形成的分子间二硫键，或少量的抗体截短形式。
经调配HIH685P的电荷不均匀性亦藉由等电聚焦使用以毛细电泳(cIEF)为基础的方法来进行定量评估。关于这个研究，各HIH685P样品在cIEF凝胶(Beckman Coulter,cat477497)(含有39mM精氨酸、2.3mM亚氨基二乙酸与3-10Pharmalytes(GE Healthcare；12μl))中被稀释至0.4mg/mL(100μg)。在7.77至8.48的范围内观察到总共7个强度不一的峰。因为毛细分辨率增加，由cIEF所观察到的产物相关峰的pI范围略大于以凝胶为基础的等电聚焦法所观察到的pI范围(pI范围为7.9-8.4)。从各测试的DS批次的电泳图观察到高度相似的定量峰型态。有总共4个主要峰(峰4-7)表示约92-93％的总峰面积。在不希望受到理论囿限的情况下，这些峰可能代表缺少C端赖氨酸的完整抗体、抗体的截短或部分形式、抗体的非共价完整形式，或具有不正确形成的二硫键的形式。这些峰中的一些可能在样品制备期间或在所用电泳条件下产生。峰4代表具有pI为约8.1的主要电荷变体形式，且所测试的两种经调配HIH685P样品批次的平均峰面积百分比为57.5％与53.4％。
为进一步检验HIH685P调配抗体的电荷不均匀性，藉由二维凝胶电泳分析数个样品。关于2-D凝胶方法，将蛋白质还原并接着依据电荷在第一维使用等电聚焦予以分离。之后，在第二维中依据分子量使用在还原条件下进行的SDS-PAGE进一步解析经分离的带电形式。各个还原HIH685P样品(2μg)，于Bio-Rad2-D pI标准品存在或不存在下，被加载至pH3-10固定式pH梯度(IPG)条以供在第一维中分析。在等电聚焦之后，IPG条被加载至4-20％Novex Tris甘氨酸凝胶上以供在第二维中分析。第二维于分子量标准品存在下进行。另外，等电聚焦分析中包括一系列具有已知pI的内部标准品。所有蛋白质是藉由考马斯蓝染色来观察。在2-D凝胶电泳与蛋白质点分析之后，所有HIH685P批次样品表现可比较的点型态，具有类似的电荷变体形式存在，可能是因为重链的等价不均匀性。在凝胶中总共观察到3个HIH685P-相关点，对应于约55kDa的质量，其中一个高度丰富的形式表现对应于约8.2的pI。这个点(pI为～8.2)与藉由质谱分析所检测的缺少C端赖氨酸的还原、糖基化重链多肽一致。两个未经鉴定的次要点(在2-D凝胶中检测到)表现出介于约pH7.5-8.0的等电点。在一个理论说法中，这些点包括重链的测定法依赖性去酰胺化蛋白质形式或截短形式。备选地，样品处理或凝胶加工品可能造成点扩散，使得不同等电点的其它次要点出现。
如预期的那样，HIH685P轻链在2D凝胶中移动如同单一主要点，对应于约6.0的pI，具有约25kDa的分子量。亦观察到未经鉴定的次要点(pI为～5.8)具有约25kDa的分子量。这个点可能代表小百分比的去酰胺化轻链，其亦在质谱分析中被检测到。
实施例11：翻译后修饰
与大多数IgG1抗体相同，HIH685P重链末端为预期氨基酸序列Pro-Gly-Lys，其中C端Lys残基倾向藉由未经鉴定的碱性羧肽酶在蛋白质表达期间被移除。末端Lys的部分移除可能造成抗体药物物质内的电荷不均匀性。由还原HIH685P的肽图谱分析，确认胰蛋白酶消化肽段中的大多数C端Lys452残基从重链被移除，使得C端肽具有445SLSLSPG451(SEQ ID NO:532)的序列。仅有非常少百分比的胰蛋白酶消化肽段(含有C端Lys残基(445SLSLSPGK452；SEQ ID NO:533))在胰蛋白酶图谱中被观察到。基于各批次HIH685P的胰蛋白酶消化的两个C端重链肽的积分峰面积，约1.0％与1.5％的HIH685P抗体重链在毒理学与临床批次中分别含有C端Lys452。
天冬酰胺的非酶促去酰胺化是另一种经常在抗体中观察到的常见修饰。经由形成琥珀酰亚胺中间体，接着水解而发生的去酰胺化产生异天冬氨酸与天冬氨酸形成。每一次去酰胺化结果引入一个额外的负电荷至抗体并产生电荷不均匀性。在一级氨基酸序列中天冬酰胺残基接着甘氨酸或丝氨酸就蛋白质内的去酰胺化来说是到目前为止最容易受到影响的位点。在HIH685P中，重链中的两个天冬酰胺残基(Asn320与Asn389)之后直接为甘氨酸残基，且因此是去酰胺化的候选位点。质谱分析指出，在任一HIH685P样品批次中于Asn320发生少许去酰胺化。聚焦质量分析揭示，在如峰53被洗脱出的肽中鉴定出Asn389。含有Asn389去酰胺化形式的肽在峰52中被洗脱出来。因为在峰52中被共洗脱的其它肽，无法依据UV信号得到去酰胺化的相对量的定量分析。但是，从质谱使用离子强度，去酰胺化Asn389在HIH685P的批次中的相对百分比经测定为低于2％。在HIH685P的还原肽图谱中，质谱分析亦鉴定峰49为一个轻链胰蛋白酶消化肽段，其含有天冬酰胺94接着是丝氨酸的一个天然形式。亦鉴定出等价肽(相对于轻链含有去酰胺化形式的Asn94)(峰48)。这两个峰的积分揭示，这个天冬酰胺总量的约4.2％在毒理学与临床批次中以去酰胺化的形式存在。轻链天冬酰胺94被鉴定为仅含有Asn-Ser的肽，其在HIH685P中表现去酰胺化终产物。轻链Asn94位于第三互补决定区(CDR)中。因为用来制备肽图谱样品的结构上***的条件，无法排除在Asn94处所观察到的去酰胺化于胰蛋白酶消化程序期间即已产生。在任何其它天冬酰胺残基处没有观察到任何可检测程度的去酰胺化。结果暗示，天冬酰胺的去酰胺化在HIH685P制造期间不预期会发生至任何可估算程度。
亦检验表面甲硫氨酸残基氧化的可能性(其潜在地影响HIH685P稳定性与活性)。HIH685P在重链中含有三个甲硫氨酸残基。一些甲硫氨酸残基预期位于抗体表面上，使得它们容易遭受氧化。甲硫氨酸侧链氧化成硫化物形式增加侧链质量达16道尔顿，且使得侧链更为具有极性。针对含有甲硫氨酸的肽的大量质量数据分析，揭示于HIH685P所测试的任一批次里在三个甲硫氨酸残基的任一者处无氧化，暗示表达方法和纯化方法以及药物物质的储存条件不会造成蛋白质的化学变化。
实施例12：糖基化模式
糖基化是一种主要的翻译后修饰，可造成抗体的分子质量不均匀性。人IgG1同型抗体含有单一典型天冬酰胺-连结(N-连结)糖基化位点于重链恒定区(Fc域)中。还原HIH685P胰蛋白酶消化肽段图谱分析鉴定出两个糖肽，对应于Fc域的两个胰蛋白酶消化肽段(氨基酸序列为298EEQFNSTYR306(SEQ ID NO:534)与294TKPREEQFNSTYR306(SEQ IDNO:535))。这些糖肽上的主要聚糖形式是依据MS分析来说明，且归纳于表8中。糖肽质量分析揭示，HIH685P N-连结糖主要由复合、双触结构所组成，具有一个核心岩藻糖基以及零、一或二个半乳糖残基在聚糖链末端。这些结构与由哺乳动物细胞表达的重组型抗体上所发现的典型聚糖形式一致。LC/MS分析亦揭示含有Fc糖基化位点(Asn302)但缺少聚糖占据(峰18与峰23)的肽。在UV层析图中的峰面积积分显示，在Fc处分别有4.8％与5.2％的N-连结位点于毒理学与临床批次中不表现聚糖占据。这些结果与毛细电泳分析一致。由胰蛋白酶图谱所产生的各个肽的MS分析揭示，HIH685P在HIH685P抗体分子中没有其它N-连结或O连结糖基化位点。
表8：来自胰蛋白酶图谱的肽分派
a栏1：对应于层析峰数目的峰数目。b栏2：各肽峰的保留时间，以分钟表示。c栏3：肽在HIH685P序列中的位置。H与L分别表示位于HIH685P重链与轻链中的序列。d栏4：经实验由LC/MS与LC/MS/MS分析测定的肽质量。e栏5：由预测HIH685P序列的氨基酸序列中胰蛋白酶消化裂解位点所计算出的理论肽质量。

Claims (43)

1.药物制剂，其包含：(i)特异结合至人血管生成素2(Ang-2)的抗体；(ii)缓冲剂，pH在6.0±0.3；(iii)非离子型去污剂；以及(iv)稳定剂。
2.权利要求1的药物制剂，其中该抗体包含SEQ ID NO:4的HCDR1、SEQ ID NO:6的HCDR2、SEQ ID NO:8的HCDR3、SEQ ID NO:12的LCDR1、SEQ ID NO:14的LCDR2及SEQ ID NO:16的LCDR3。
3.权利要求1或2的药物制剂，其中该抗体包含SEQ ID NO:18的HCVD，以及SEQ ID NO:20的LCVD。
4.权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其中
(a)超过96％的抗体具有151kDa±1kDa的分子量；
(b)至少53％的抗体具有约8.13±0.01的等电点；以及
(c)约90％至约92％的抗体是岩藻糖基化的。
5.权利要求1至4中任一项所述的药物制剂，其中抗体浓度为约25mg/mL±0.375mg/mL，或约50mg/mL±7.5mg/mL。
6.权利要求1至4中任一项所述的药物制剂，其中该缓冲剂为组氨酸。
7.权利要求6的药物制剂，其中组氨酸浓度为10mM±1.5mM。
8.权利要求1至7中任一项所述的药物制剂，其中非离子型去污剂为聚山梨醇酯20。
9.权利要求8的药物制剂，其中聚山梨醇酯20浓度为约0.2％w/v±0.03％。
10.权利要求1至9中任一项所述的药物制剂，其中该稳定剂为蔗糖。
11.权利要求10的药物制剂，其中蔗糖浓度为约10％±1.5％(w/v)。
12.权利要求1至11中任一项所述的药物制剂，其中抗体浓度为25mg/mL±3.75mg/mL，缓冲剂为10mM±1.5mM组氨酸，pH6±0.3、非离子型去污剂为0.2％w/v±0.03％，和稳定剂为10％w/v±1.5％蔗糖。
13.权利要求1至11中任一项所述的药物制剂，其中抗体浓度为50mg/mL±7.5mg/mL，缓冲剂为10mM±1.5mM组氨酸，pH6±0.3、非离子型去污剂为0.2％w/v±0.03％，和稳定剂为10％w/v±1.5％蔗糖。
14.权利要求1至13中任一项所述的药物制剂，其中至少93％的抗体在45℃28天后具有天然构象。
15.权利要求1至14中任一项所述的药物制剂，其中至少32％的抗体在45℃28天后为抗体的主要电荷变体。
16.权利要求1至15中任一项所述的药物制剂，其中至少97％的抗体在25℃28天后具有天然构象。
17.权利要求1至16中任一项所述的药物制剂，其中至少53％的抗体在25℃28天后为抗体的主要电荷变体。
18.权利要求1至17中任一项所述的药物制剂，其中至少96％的抗体在37℃28天后具有天然构象。
19.权利要求1至18中任一项所述的药物制剂，其中至少45％的抗体在37℃28天后为抗体的主要电荷变体。
20.权利要求1至19中任一项所述的药物制剂，其中至少97％的抗体在5℃6个月后具有天然构象。
21.权利要求1至20中任一项所述的药物制剂，其中至少55％的抗体在5℃6个月后为抗体的主要电荷变体。
22.权利要求1至21中任一项所述的药物制剂，其中在5℃6个月后抗体的相对效力百分比为储存前抗体效力的至少100％。
23.权利要求1至22中任一项所述的药物制剂，其中至少97％的抗体在-80℃6个月后具有天然构象。
24.权利要求1至23中任一项所述的药物制剂，其中至少55％的抗体在-80℃6个月后为抗体的主要电荷变体。
25.权利要求1至24中任一项所述的药物制剂，其中在-80℃6个月后抗体的相对效力百分比为储存前抗体效力的至少85％。
26.权利要求1至25中任一项所述的药物制剂，其中至少96％的抗体在-30℃6个月后具有天然构象。
27.权利要求1至26中任一项所述的药物制剂，其中至少55％的抗体在-30℃6个月后为抗体的主要电荷变体。
28.权利要求1至27中任一项所述的药物制剂，其中在-30℃6个月后抗体的相对效力百分比为储存前抗体效力的至少84％。
29.权利要求1至28中任一项所述的药物制剂，其中至少96％的抗体在-20℃6个月后具有天然构象。
30.权利要求1至29中任一项所述的药物制剂，其中至少55％的抗体在-20℃6个月后为抗体的主要电荷变体。
31.权利要求1至30中任一项所述的药物制剂，其中在-20℃6个月后抗体的相对效力百分比为储存前抗体效力的至少90％。
32.药物制剂，其包含(a)25mg/mL±3.75mg/mL的抗Ang-2抗体、(b)10mM±1.5mM组氨酸，pH6±0.3、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，和(d)10％w/v±1.5％蔗糖，其中
(a)该抗体包含SEQ ID NO:18的HCVD以及SEQ ID NO:20的LCVD；
(b)超过96％的抗体具有151kDa±1kDa的分子量；
(c)至少53％的抗体具有约8.13±0.01的等电点；和
(d)约90％至约92％的抗体是岩藻糖基化的。
33.权利要求32的药物制剂，其在水中由下列所组成：(a)25mg/mL±3.75mg/mL的抗体、(b)10mM±3mM组氨酸，pH6±0.3、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，和(d)10％w/v±1.5％蔗糖。
34.药物制剂，其包含(a)50mg/mL±7.5mg/mL的抗Ang-2抗体、(b)10mM±1.5mM组氨酸，pH6±0.3、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，和(d)10％w/v±1.5％蔗糖，其中
(a)该抗体包含SEQ ID NO:18的HCVD以及SEQ ID NO:20的LCVD；
(b)超过96％的抗体具有151kDa±1kDa的分子量；
(c)至少53％的抗体具有约8.13±0.01的等电点；及
(d)约90％至约92％的抗体是岩藻糖基化的。
35.权利要求34的药物制剂，其在水中由下列所组成：(a)50mg/mL±7.5mg/mL的抗体、(b)10mM±1.5mM组氨酸，pH6±0.3、(c)0.2％w/v±0.03％聚山梨醇酯20，和(d)10％w/v±1.5％蔗糖。
36.权利要求1至35中任一项所述的药物组合物，其中该组合物包含在容器中。
37.权利要求36的药物组合物，其中该容器为小瓶。
38.权利要求37的药物组合物，其中该小瓶为玻璃。
39.权利要求36的药物组合物，其中该容器为IV滴注袋。
40.权利要求39的药物组合物，其中该袋是由聚氯乙烯制成。
41.权利要求39的药物组合物，其中该袋是由聚烯烃制成。
42.试剂盒，其包含权利要求1至35中任一项所述的药物组合物、容器以及使用说明。
43.权利要求42的试剂盒，其中该容器为玻璃小瓶，配有涂覆FLUROTEC的4023/50的橡胶瓶塞。
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