CN104120141A - 一种微生物催化合成β-石竹烯的方法及能够合成β-石竹烯的重组细胞 - Google Patents
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Abstract
一种微生物催化合成β-石竹烯的方法以及能够合成β-石竹烯的重组细胞，其中所用的乙酰辅酶A是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得的，所述方法包括下述步骤：A)构建能够从乙酰辅酶A合成β-石竹烯的重组细胞，所述重组细胞包含下述基因片段：乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯基焦磷酸合酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶；B)利用A)中所述重组细胞在包含葡萄糖的培养基中进行培养，用适当的诱导剂诱导，经过分离纯化后即可获得β-石竹烯。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用生物法制备萜烯类化合物的方法，具体地，涉及一种微生物催化合成β-石竹烯的方法以及能够合成β-石竹烯的重组细胞，其中所用的乙酰辅酶A是从诸如葡萄糖的简单起始材料获得的。
背景技术
萜烯类化合物——β-石竹烯,是一种双环倍半萜型的重要平台化合物，是医药、食品、化妆品及高密度燃料工业的重要原料。β-石竹烯作为香料，已被应用于化妆品和食品添加剂中；在医药行业，β-石竹烯具有局麻、抗炎、驱蚊虫、抗焦虑、抗抑郁等作用，其衍生物β-石竹烯醇还可应用于镇咳祛痰药物中，β-石竹烯氧化物具有镇痛和抗炎、抗真菌、抗细胞毒性等作用；同时β-石竹烯加氢的产物还可作为高密度燃料的原料。
目前，β-石竹烯的制备主要包括从天然植物中采用一系列化学反应提取或利用相关原料在适当的条件下进行合成两种方法，由于天然植物中β-石竹烯的含量较低，造成其提取成本很高；同时由于β-石竹烯的结构较复杂，使化学合成的工艺繁琐，产率低，能耗大。因此寻找一种替代可持续制备β-石竹烯的工艺路线具有重要意义。
利用微生物催化合成化学品及材料的工艺路线，因其具有原料可再生、绿色环保、反应条件温和等优点，而逐渐被科学家所重视。生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行萜烯类化合物的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体、细菌和藻类中，这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate，DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)，之后经过香叶酯二磷酸合成酶、法呢基焦磷酸合酶及萜烯合成酶催化DMAPP和IPP至萜烯类化合物。此前，还没有利用微生物发酵获得β-石竹烯的相关报道。本发明首次介绍了利用微生物发酵制备β-石竹烯的新方法。
发明内容
本发明公开了一种微生物催化合成β-石竹烯的方法及能够合成β-石竹烯的重组细胞，利用可再生资源葡萄糖为原料，通过生物催化剂制备萜烯类化合物——β-石竹烯，建立可持续发展的β-石竹烯合成工艺路线。
本发明主要通过基因工程手段对MVA途径合成萜烯类化合物——β-石竹烯相关酶基因在大肠杆菌等通过基因工程技术构建而成的重组细胞中进行外源表达，最终在重组细胞内成功建立了一种萜烯类化合物——β-石竹烯的生物合成途径。
本发明采用如下技术方案：
一种微生物催化合成β-石竹烯的方法，所述方法包括下述步骤：
A)构建能够从乙酰辅酶A合成β-石竹烯的重组细胞，所述重组细胞包含下述基因片段：乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯基焦磷酸合酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶；
B)利用A)中所述重组细胞在包含葡萄糖的培养基中进行培养，通过诱导剂诱导，经过分离纯化后即可获得β-石竹烯。
其中所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(GenBank:BK006949.2)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:AAG02438.2)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:AIA26811.1)褐杆菌(Phaeobacter inhibens)(GenBank:AFO90074.1)，钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(GenBank:AEI82514.1)，大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank:ADX49537.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:NP_607695.1)；或3)来源于其它生物体，和乙酰辅酶A酰基转移酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:YM4987.09C)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:EEU26497.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:YP_501316.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:AAG02443.1)，魏氏利斯特菌(Listeriawelshimeri)(GenBank:YP_849629.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:AAL97584.1)；或3)来源于其它生物体，和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(GenBank:YLR450W)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:ESU74184.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:AAG02423.1)，屎肠球菌(Enterococcusfaecium)(GenBank:AGS75052.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:AAL97583.1)；或3)来源于其它生物体，和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。所述甲羟戊酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:NP_013935.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:EPI38248.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:ABR51486.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:EFS06266.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:AFV37808.1)；或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:NP_013947.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(GenBank:WP_016626966.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(GenBank:AIA27148.1),屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:WP_016629841.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:WP_023613167.1)；或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:AY757921.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:YP_005707688.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:EPI24610.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:AAL97580.1)；或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
所述异戊烯焦磷酸异构酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:NP_015208.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(GenBank:NP_814639.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:YP_501084.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:ERK34722.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:YP_001128672.1)；或3)来源于其它生物体，和异戊烯焦磷酸异构酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
所述香叶酯二磷酸合成酶基因来源于：1)大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank:AHY68945.1)，或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(GenBank:BAN86603.1)；或2)来源于北美冷杉(Abies grandis)(GenBank:AAN01134.1)，芒果(Mangifera indica)(GenBank:AFJ52722.1),丹参(SalviaMiltiorrhiza)(GenBank:AEZ55677.1),或葡萄(Vitis vinifera)(GenBank:AAR08151.1)；或3)来源于其它生物体，和香叶酯二磷酸合成酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
所述法呢基焦磷酸合酶基因来源于：1)大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank:AHY68945.1)，或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(GenBank:CAA65645.1)；或2)春兰(Cymbidium goeringii)(GenBank:AFP19446.1)，芒果(Mangifera indica)(GenBank:AFJ52720.1)，芦笋(Asparagus officinalis)(GenBank:AGH33733.1)，或长囊水云(Ectocarpus siliculosus)(GenBank:CBN75787.1)；或3)来源于其它生物体，和法呢基焦磷酸合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
所述β-石竹烯合酶基因来源于：1)小花蔓泽兰(Mikania micrantha)(GenBank:FJ767894.1)；或2)新克里多尼亚檀香(Santalum austrocaledonicum)(GenBank:ADO87005.1)；或3)黄花蒿(Artemisia annua)(GenBank:AF472361.1)；或4)玉米(Zea mays)(GenBank:ABY79213.1)，苦艾(Artemisiaabsinthium)(GenBank:BAN81914.1)，或苹果(Malus domestica)(GenBank:AGB14624.1)；或5)来源于其它生物体，和β-石竹烯合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
本发明还涉及一种能够从乙酰辅酶A合成β-石竹烯的重组细胞，所述重组细胞包含下述基因片段：乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶。其中，重组细胞是由细菌细胞，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或真菌细胞(如酿酒酵母)，或微藻等通过基因工程技术构建而成的。关于能够从乙酰辅酶A合成β-石竹烯的的重组细胞的构建可以参见前面的描述。
本领域技术人员应该理解，为在重组细胞中更好地表达，上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根据所用的宿主细胞的密码子偏好性进行密码子优化。
本领域技术人员还应该理解，上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常规分子克隆技术克隆到宿主细胞中。另外，这些核苷酸片段还可以与适当的表达控制元件(例如，启动子，增强子等)可操作地连接。这些都在本领域技术人员的能力范围之内，不需要付出创造性的劳动。这些核苷酸片段可操作性连接可以借助于接头也可以不用接头，这可以由本领域技术人员根据实际需要进行适当的选择。
本领域技术人员应该理解，在选择适当的宿主细胞构建好能够从乙酰辅酶A合成β-石竹烯的重组细胞后，本领域技术人员能够根据技术常识或经过有限次实验确定合适的培养条件(例如，发酵培养的温度、搅拌速度、pH值、溶氧率、发酵时间等参数)，也能够选择合适的诱导剂，确定加入诱导剂的时机，等等。这不需要付出创造性的劳动。
本发明的有益效果：
与传统的制备工艺相比，利用微生物催化合成β-石竹烯的路线具有如下的优势：(1)由于有专一性的β-石竹烯合成酶，所以生成的产物具有高选择性，工业上可以大大降低分离成本；(2)使用的原料为木质纤维素降解获得的葡萄糖是可再生资源；(3)整个过程是在常温常压下进行，能耗低。因此，利用生物催化手段制备β-石竹烯将成为今后β-石竹烯工业发展的必然趋势。此外，微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1是利用乙酰辅酶A生物合成萜烯类化合物——β-石竹烯代谢途径示意图；
图2是pYJM50质粒图谱；
图3是pYJM51质粒图谱；
图4是pYJM14质粒图谱；
图5是发酵产物β-石竹烯结构的GC分析图谱；
图6显示工程菌YJM51产β-石竹烯的时间曲线；其中工程菌YJM51的β-石竹烯产量(▲)和细胞生长(■)，当工程菌细胞生长12h开始进行诱导培养；
图7显示诱导温度对工程菌β-石竹烯的影响：当工程菌YJM51的细胞OD600达0.6-0.9时，向培养基中添加终浓度为1mM的IPTG，分别在不同的温度下进行诱导培养29h：25℃(白色)，30℃(浅灰色)，34℃(灰色)，37℃(深灰色)；上述试验数据为重复三次的平均值；
图8显示IPTG浓度对工程菌产β-石竹烯的影响：当工程菌YJM51的细胞OD600达0.6-0.9时，在诱导温度为30℃，不同终浓度IPTG的条件下诱导66h：0.1mM(■)，0.25mM(◆)，0.5mM(▲)，1mM(●)；上述试验数据为重复三次的平均值。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
实施例1
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉(Abiesgrandis)的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)；来源于粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)的法呢基焦磷酸合酶基因(FPPS)和来源于黄花蒿(Artemisia annua)的β-石竹烯合酶基因(QHS1),利用葡萄糖降解中间产物乙酰辅酶A生物合成异戊二烯衍生物——β-石竹烯。
1.1外源基因的克隆和表达载体的构建
1.1.1外源基因的克隆
1.1.1.1粪肠球菌MVA上游代谢途径基因的克隆
来自于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的mvaS基因(GenBank：EEU26497.1)，mvaE基因(GenBank：AAG02438.2)由上海捷瑞公司通过化学合成方法获得。之后分别与载体pGH(购自上海捷瑞生物工程有限公司)连接获得pGH/mvaS,pGH/mvaE。
1.1.1.2GPPS2,ispA和QHS1基因的克隆
分别对来自于Abies grandis GPPS2基因(GenBank：AAN01134.1)和Artemisiaannua QHS1基因(GenBank：AF543530.1)序列进行稀有密码子分析(http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis)，并将其稀有密码子优化为E.coli偏好的密码子(http://www.jcat.de/)。优化后的GPP合成酶基因(GPPS2)和β-石竹烯合酶基因(QHS1)送上海捷瑞公司进行化学合成，并连入pGH载体上分别形成pGH-GPPS2和pGH-QHS1载体。
以E.coli基因组为模板，利用引物ispA-F(5’-CATGGACGTCATGGACTTTCCGCAGCAACTC-3’)和ispA-R(5’-TTATTTATTACGCTGGATGATGTCTCGAGCGG-3’)PCR扩增ispA基因(GenBank：AHY68945.1)。
1.1.2表达载体的构建
1.1.2.1pYJM24载体构建
将pGH-GPPS2载体与pACYCDuet-1载体(Novagen)分别用NdeI和BglII进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM24(pACY-GPPS2)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.2pYJM26载体构建
将pACY-mvaE-mvaS-ispSPa载体(pYJM20)与pACY-GPPS2(pYJM24)载体分别用NcoI和PstI进行双酶切，载体pACY-GPPS2与外源片段mvaE-mvaS按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM26(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.3pYJM50载体构建
将pGH-QHS1载体与pYJM26(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2)载体分别用BglII和Fse I进行双酶切，载体pACY-mvaE-mvaS-GPPS2与外源片段QHS1按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM50(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHS1)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.4pYJM51载体构建
将ispA基因片段与pYJM50(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHS1)载体分别用AatII和Xho I进行双酶切，载体pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHS1与ispA基因片段按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM51(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHS1-ispA)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
1.1.2.5pYJM14(pTrc-low)载体构建
根据实验室建立的DNA组装(Lego DNA assembling)方法构建pTrc-low载体：该方法是一种多个DNA片段在体外通过变性解链，退火组装成重组质粒的快速方法，连接过程中无需任何限制性酶。在构建的过程中，通过PCR(simplePCR，overlap extension PCR，long tailed primer PCR)的方法扩增出一系列连续的片段(successive substrate fragments,SFs)，设计扩增这些片段时，需要在这些相邻片段之间存在一段比较长的重叠部分，将这些片段按等摩尔比例混合后，变性，退火。由于片段和片段之间的重叠区较长，占整个片段长度的1/3-2/3，使得变性后的单链很容易与相邻片段形成的单链进行杂交，最终形成环状，将退火后的产物转化大肠杆菌后，最终可以形成重组质粒。pTrc-low载体构建过程如下：
分别以pTrchis2B骨架(来自Invitrogen公司)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组为模板，扩增出质粒pTrchis2B的部分片段SFIBhB，SFB12hB，以及酿酒酵母MVA途径的下游4个基因的片段ERG12(SF128h12，SFB12h12)；ERG8(SF128h8，SF819h8)；ERG19(SF819h19，SF19IhI)；IDI(SF19IhI，SFIBhI)，然后以这些片段或pTrchis2B骨架为模板，通过普通PCR或者重叠PCR扩增出组装质粒的6个SFs片段SF128，SF819，SF19I，SFIB，SFB12，SFB。4个基因ERG12，ERG8，ERG19，IDI之间的3个RBS序列是在PCR扩增时，通过设计引物时引入，使得4个基因由单一的trc(trp-lac promoter)启动子作用下进行表达。
表1为pTrc-low质粒构建的过程中片段扩增的引物及模板，表2为所用到的引物序列汇总。
表1 片段扩增的引物与模板
Table1PCR templates and primers for fragment construction
表2pTrc-low构建引物序列汇总
Table2Primer sequences used to construct pTrc-low
1.1.2.6pTrc-low质粒的构建及鉴定
将扩增的6个SFs片段SF128，SF819，SF19I，SFIB，SFB12，SFB按等摩尔比例在1.5mLEP管中混匀，密封后(淹没)于装有蒸馏水的烧杯中煮沸使其变性，然后置于室温下让其自然冷却(退火)。取适量体积连接产物转化E.coliDH5α，然后涂布加有氨苄霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYJM14(pTrc-low)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
实施例2
将构建好的质粒转化到感受态细胞中，通过摇瓶发酵和发酵罐发酵两种方法对重组菌进行发酵培养，利用气象色谱技术对发酵产物进行定性和定量的检测。
2.1E.coli重组菌株的构建
将pYJM51(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHS1-ispA)和pYJM14(pTrc-low)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pYJM51和pYJM14的工程大肠杆菌。
2.2工程大肠杆菌的培养
将活化后的工程大肠杆菌按1:100的比例接种到含有氯霉素和氨苄霉素的LB液体培养液中，37℃,180rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol·L-1，然后转入在30℃，180rpm条件下，继续培养。当工程菌株诱导24h后，取顶空气体1ml，利用GC定性检测。
2.3工程菌发酵试验
挑取单克隆到50ml M9种子培养基(1L M9salts：20g Glucose，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5g NaCl，0.24g MgSO4，121℃高压蒸汽灭菌15min。)中，37℃，180rpm活化过夜(18-24h)。将种子按10％的接种量接种至含有2L发酵培养基(19.6g K2HPO4.3H2O；4.2g citric acid.H2O；0.6g柠檬酸铁铵；0.8ml浓硫酸；40g葡萄糖,(NH4)6Mo7O24.4H2O0.123mg；ZnSO4.7H2O0.097mg；H3BO40.823mg；CuSO4.5H2O0.083mg；MnCl2·4H2O0.527mg,4ml1M MgSO4，1900ml蒸馏水)的5L小型发酵罐中，通气量1.3VVM，转速400rpm，37℃培养至OD600约为12时，0.5mM IPTG，37℃诱导表达，以氨水调pH，控制pH在7.0，每隔8h补加一次IPTG。得到的β-石竹烯产物通过GC对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中残余葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓度为800g/L的糖液，维持残糖浓度在0.5g/L以下。每4h取发酵液5ml，测定细胞OD600、葡萄糖浓度；每15min取尾气1ml,利用气相色谱检测产物异戊二烯浓度。直到OD不再变化，产物不再产生为止。
检测条件：GC***采用山东鲁南瑞虹SP-6890型气相色谱仪，色谱柱为HP-INNOWAX column(25m×250μm×0.2μm)，检测器为FID检测器；气化室温度200℃，检测器温度230℃，载气流速：1ml/min.
柱升温程序为：50℃保温0.5min，
4℃/min升至100℃,
25℃/min升至250℃，保温5min。
由图可知：发酵目标产物累计含量最高达0.97g/L。
实施例3
不同的发酵条件，如诱导温度，转速，诱导剂浓度，氮源，底物浓度，培养基pH值及成分配比等，会影响发酵产物蒎烯的产量。本专利检测了不同的诱导温度，诱导剂浓度和氮源对β-石竹烯产量的影响。
3.1E.coli重组菌株的构建
将pYJM51(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHS1-ispA)和pYJM14(pTrc-low)重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pYJM27和pYJM14的工程大肠杆菌。
3.2研究不同诱导温度对β-石竹烯产量的影响
挑取单克隆于5mlLB小瓶中培养活化过夜，按1％接种于100ml含有Cm+Amp抗生素的液体发酵培养基中，37℃,180rpm条件下振荡培养，当OD600nm为0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol·L-1，然后转入不同温度下(25℃，30℃，34℃，37℃)进行诱导培养。在不同的时间点取1ml顶空气体进行GC测定。
3.3研究不同IPTG浓度对β-石竹烯产量的影响
挑取单克隆于5ml LB小瓶中培养活化过夜，按1％接种于100ml含有Cm+Amp抗生素的液体发酵培养基中，37℃振荡培养4h，当OD600＝0.6-1.0左右，加入不同浓度IPTG(0.1mM，0.25mM，0.5mM，1mM)在30℃条件下进行诱导培养。在不同的时间点取1ml顶空气体进行GC测定。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (10)
1.一种微生物催化合成β-石竹烯的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
A)构建能够从乙酰辅酶A合成β-石竹烯的重组细胞，所述重组细胞包含下述基因片段：乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯基焦磷酸合酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶；
B)利用A)中所述重组细胞在包含葡萄糖的培养基中进行培养，通过诱导剂诱导，经过分离纯化后即可获得β-石竹烯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:BK006949.2)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:AAG02438.2)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:AIA26811.1)，褐杆菌(Phaeobacter inhibens)(GenBank:AFO90074.1)，钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(GenBank:AEI82514.1)，大肠杆菌(Escherichiacoli)(GenBank:ADX49537.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:NP_607695.1)；或3)来源于其它生物体，和乙酰辅酶A酰基转移酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:YM4987.09C)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)(GenBank:EEU26497.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:YP_501316.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:AAG02443.1)，魏氏利斯特菌(Listeria welshimeri)(GenBank:YP_849629.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:AAL97584.1)；或3)来源于其它生物体，和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:YLR450W)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:ESU74184.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:AAG02423.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:AGS75052.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:AAL97583.1)；或3)来源于其它生物体，和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列；所述甲羟戊酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:NP_013935.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:EPI38248.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:ABR51486.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:EFS06266.1)，或酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(GenBank:AFV37808.1)；或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:NP_013947.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:WP_016626966.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:AIA27148.1),屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:WP_016629841.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:WP_023613167.1)；或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:AY757921.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:YP_005707688.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:EPI24610.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:AAL97580.1)；或3)来源于其它生物体，和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述异戊烯焦磷酸异构酶基因来源于：1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(GenBank:NP_015208.1)；或2)来源于其它细菌，优选粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(GenBank:NP_814639.1)，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(GenBank:YP_501084.1)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:ERK34722.1)，或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(GenBank:YP_001128672.1)；或3)来源于其它生物体，和异戊烯焦磷酸异构酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述香叶酯二磷酸合成酶基因来源于：1)大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank:AHY68945.1)，或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(GenBank:BAN86603.1)；或2)来源于北美冷杉(Abies grandis)(GenBank:AAN01134.1，)芒果(Mangifera indica)(GenBank:AFJ52722.1),丹参(Salvia Miltiorrhiza)(GenBank:AEZ55677.1),或葡萄(Vitisvinifera)(GenBank:AAR08151.1)；或3)来源于其它生物体，和香叶酯二磷酸合成酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述法呢基焦磷酸合酶基因来源于：1)大肠杆菌(Escherichia coli)(GenBank:AHY68945.1)，或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(GenBank:CAA65645.1)；或2)春兰(Cymbidiumgoeringii)(GenBank:AFP19446.1)，芒果(Mangifera indica)(GenBank:AFJ52720.1)，芦笋(Asparagus officinalis)(GenBank:AGH33733.1)，或长囊水云(Ectocarpus siliculosus)(GenBank:CBN75787.1)；或3)来源于其它生物体，和法呢基焦磷酸合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述β-石竹烯合酶基因来源于：1)小花蔓泽兰(Mikania micrantha)(GenBank:FJ767894.1)；或2)新克里多尼亚檀香(Santalum austrocaledonicum)(GenBank:ADO87005.1)；或3)黄花蒿(Artemisia annua)(GenBank:AF472361.1)；或4)玉米(Zea mays)(GenBank:ABY79213.1)，苦艾(Artemisia absinthium)(GenBank:BAN81914.1)，或苹果(Malus domestica)(GenBank:AGB14624.1)；或5)来源于其它生物体，和β-石竹烯合酶基因没有明显的同源性，但编码具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
9.一种能够从乙酰辅酶A合成β-石竹烯的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含下述基因片段：乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶。
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，是由细菌细胞，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或真菌细胞(如酿酒酵母)，或微藻等通过基因工程技术构建而成的。
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