CN103243065A - 一种生产法尼烯的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产法尼烯的菌株及其应用，属于合成生物学领域。生产法尼烯的菌株含有甲羟戊酸途径和经过密码子优化的法尼烯合成的相关基因；经密码子优化的法尼烯合成基因afs序列如SEQIDNO.1所示。该菌株可用于生产法尼烯，将其种子液接入含碳源的培养基中进行原核表达得到法尼烯。对法尼烯合成的基因进行密码子优化或使甲羟戊酸途径合成法尼烯各蛋白更加接近AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2可以进一步促进生产法尼烯。本发明使法尼烯产量大幅提高达到1g/L以上。

Description

一种生产法尼烯的菌株及其应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产法尼烯的菌株及其应用。

背景技术

法尼烯最早从苹果树中分离得到，在植物防御方面起到重要作用。由于其是一种重要的化工原料，例如可用于人工合成橡胶，更重要的是法尼烯是一种优良生物能源法尼烷的前体，具有广阔的市场价值，近年来受到了人们的广泛关注。

法尼烯在植物中的含量非常低，无法以提取天然产物的方式来用于化工市场，因而利用微生物生产法尼烯似乎成为人们利用这一化合物的最佳方式。微生物发酵最大的瓶颈在于如何实现工业化，而工业化的必要条件是其产量需要满足可以工业化的水平。但是现在仅克隆到了少数几种法尼烯合酶，而且其在微生物中的蛋白表达情况都不理想，利用微生物生产法尼烯一直缓慢前行，未能实行工业化生产。现有报道（Wang,C.,et al.,2011.Metabolicengineering of Escherichia coli forα-farnesene production.Metabolic Engineering.13,648-655）法尼烯的最高产量仅为0.38g/L。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产法尼烯的菌株。

本发明的另一目的在于提供上述生产法尼烯的菌株的应用。

本发明的再一目的在于提供一种利用上述菌株生产法尼烯的方法。

本发明的目的还在于提供一种提高原核生物生产法尼烯能力的方法。

一种生产法尼烯的菌株，含有甲羟戊酸途径（MVA途径）和部分或全部经过密码子优化的法尼烯合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括（1）将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB、（2）将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因erg13、（3）将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1、（4）将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12、（5）将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、（6）将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1和（7）将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi；所述的法尼烯合成的相关基因包括（1）将异戊烯焦磷酸分子和二甲基烯丙基焦磷酸分子组合以形成法尼基焦磷酸的基因ispA和（2）将法尼基焦磷酸转化为法尼烯的基因afs。

所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌BL21（DE3）的atoB（CP001509.3:2216470-2217654）、idi（CP001509.3:2863926-2864474）和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（329138949:19060-20535）、tHMG1（329138949:115734-117239）、erg12（329138949:684467-685798）、erg8（329138949:712316-713671）、mvd1（329138953:701895-703085）。

所述的ispA基因优选为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的ispA（CP001509.3:405603-406502）

所述的afs基因优选为以来源于苹果属的Malus x domestica(apple)的afs基因(Q84LB2)为基础进行密码子优化得到，其序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述的生产法尼烯的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ38的大肠杆菌；所述的质粒pMH1以pBBR1MCS为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子替换为p15A复制子，包含atoB、erg13和thmg1基因，pMH1的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.2所示；所述的质粒pFZ81以pBBR1MCS-2为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为质粒自带的pBBR1MCS复制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pFZ81的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.3所示；所述的质粒pFZ38以pET21a(+)为骨架载体、启动子为T7启动子、复制子pBBR322高拷贝复制子，包含afs和ispA基因，pFZ38的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.4所示。

更优选的，所述的生产法尼烯的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ71的大肠杆菌；所述的质粒pFZ71以pET21a(+)为骨架载体、启动子为T7启动子、复制子pBBR322高拷贝复制子，包含afs、ispA和idi基因，pFZ71的序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.5所示。

上述生产法尼烯的菌株在生产法尼烯中的应用。

利用上述生产法尼烯的菌株生产法尼烯的方法，包含如下步骤：将上述生产法尼烯的菌株种子液接入含碳源的的培养基中进行原核表达得到法尼烯。

原核表达时，加入诱导剂IPTG2-4小时后再加入正癸烷进行双相发酵。

原核表达时MVA途径合成法尼烯各蛋白的比例优选为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1-56∶2-16∶2-30∶1-5∶1-5∶2-20∶4-600∶20-40∶2-11；更优选的，AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2。

一种提高原核生物生产法尼烯能力的方法，通过对法尼烯合成的相关基因进行密码子优化，包括afs，erg8，erg12和erg13等基因；或使通过MVA途径合成法尼烯各蛋白的比例更加接近优化比例AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2的进一步改造；或过表达idi、erg8、mvd1、erg13、erg12和thmg1中的任一或多个基因可以实现。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

代谢通路中各个蛋白并不是按照等摩尔情况才是最高效的，而是应该按照一定比例来最大化反应速率，本发明利用体外重建体系研究确定了MVA途径合成法尼烯各蛋白的最佳比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2，然后通过更加理性的合成生物学手段改造通过MVA途径生产法尼烯的各蛋白的比例，通过控制这些蛋白的比例，在最短时间内能快速的提高法尼烯的产量，该方法比传统基因工程利用随机改变代谢通路上的蛋白表达量更具有目标性，因而实验更加理性、快速、有效。同时本发明通过密码子优化合成法尼烯合成相关基因afs，使得这些基因能够更容易在异源宿主内进行表达。通过这些技术使法尼烯摇瓶产量达到1g/L以上，具有很好的工业运用前景。

附图说明

图1是甲羟戊酸途径示意图。

图2是法尼烯合成途径示意图。

图3是Idi利于萜类化合物生产示意图。

图4是MVA途径合成法尼烯各蛋白优化比例对反应速率的影响图。

图5是质粒pMH1示意图。

图6是质粒pFZ81示意图。

图7是质粒pFZ35示意图。

图8是质粒pFZ38示意图。

图9是质粒pFZ71示意图。

图10是本发明法尼烯产生菌株（F0、F1和F5）示意图，F0通过MEP途径生产法尼烯，F1和F5通过MEP和MVA途径生产法尼烯。

图11是本发明法尼烯产生菌株（F0、F1和F5）摇瓶发酵生产法尼烯结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

通过从大肠杆菌和酿酒酵母基因组DNA中扩增相应基因构建了用于大肠杆菌表达的甲羟戊酸途径。随后经密码子优化和基因合成构建了从异戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）生产法尼烯的通路，并实现了重组大肠杆菌高效生产法尼烯。相关反应途径见图1和图2。

实施例中所用到的引物如表1所示：

表1引物列表

实施例1体外重建体系优化甲羟戊酸途径

体外重建体系实验方法同2011年Yu等人建立的方法（Yu,X.,et al.,2011.In vitroreconstitution and steady-state analysis of the fatty acid synthase from Escherichia coli.Proceedingsof the National Academy of Sciences.108,18643-18648.），通过对甲羟戊酸途径的各个蛋白的研究表明增加ERG13，ERG8，IspA和Idi对萜类化合物生产有促进作用，特别是增加Idi的效果更加明显（图3），体外重建实验获得的MVA途径合成法尼烯各个蛋白的优化比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2，与等摩尔的各个蛋白相比，反应速率有明显提高（图4）。

实施例2甲羟戊酸途径质粒构建

用Qiagen公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit纯化获得大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA和酿酒酵母INVSC1基因组DNA。

质粒pMH1含有甲羟戊酸途径前三个基因：来源于大肠杆菌BL21(DE3)的atoB基因（乙酰乙酰辅酶A硫酯酶），来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（HMG-CoA合酶，3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A合酶）和thmg1（HMG-CoA还原酶，3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶，删除了HMG1的跨膜区域）。质粒pFZ81含有甲羟戊酸途径后四个基因：来源于酿酒酵母INVSC1的erg12（甲羟戊酸激酶），erg8（甲羟戊酸-5-磷酸激酶）和mvd1（甲羟戊酸-5-焦磷酸激酶），来源于大肠杆菌BL21(DE3)的idi（异戊烯焦磷酸异构酶）基因。所有基因均通过PCR扩增获得，所用引物见表1。

具体构建方法如下：

（1）质粒pMH1的构建

首先利用simple cloning方法（You,C.,et al.,2012.Simple Cloning via Direct Transformationof PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis.Applied andenvironmental microbiology.78,1593-1595.），将pBBR1MCS质粒的复制子替换为来源于pMSD15质粒的p15A复制子。以质粒pBBR1MCS为模板用引物pBBR1MCS1-p15A-f和pBBR1MCS1-p15A-r进行扩增获得pBBR1MCS片段，同时p15A复制子用引物p15A-f和p15A-r扩增（引物序列见表1）获得p15A片段，经PCR产物纯化后用Nanodrop测定DNA浓度，然后将20ng PCR扩增的p15A片段和等摩尔的pBBR1MCS片段混合，经过一轮PCR扩增，扩增条件为：98℃，2min预变性，然后30个PCR循环98℃，20s；60℃，20s；72℃，6min，最后72℃充分延伸10min。随后转化大肠杆菌XL1-blue获得质粒pBBR1MCS/p15A。

用引物pBBR1MCS1-f和pBBR1MCS1-r以pBBR1MCS/p15A为模板扩增pMH1质粒骨架，同时用AtoB-f，AtoB-r；ERG13-f，ERG13-r；tHMG1-f，tHMG1-r为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pMH1质粒骨架和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液（Gibson,D.G.,2011.Enzymaticassembly of overlapping DNA fragments.Methods Enzymol.498,349-361.）中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pMH1，该质粒示意图如图5所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.2所示。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒复制子为p15A复制子。

（2）质粒pFZ81的构建

用引物pBBR1MCS2-f和pBBR1MCS2-r以pBBR1MCS-2为模板扩增pFZ81质粒骨架，同时用ERG12-f，ERG12-r；ERG8-f，ERG8-r；MVD1-f，MVD1-r；Idi-f，Idi-r为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pFZ81质粒骨架和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pFZ81，该质粒示意图如图6所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.3所示。该质粒控制基因表达的为中等强度的lac启动子，质粒复制子为pBBR1MCS复制子。

实施例3法尼烯产生代谢途径质粒构建

来源于苹果属Malus x domestica的afs基因经南京金斯瑞生物科技有限公司密码子优化后进行基因合成（序列如SEQ ID NO.1所示），随后通过NdeI和XhoI酶切位点***到质粒pET21a(+)中，获得可以生产法尼烯的质粒pFZ35（图7）。

IspA基因用引物IspA-BamHI和IspA-EcoRI-SpeI从大肠杆菌基因组DNA中扩增后，经BamHI和EcoRI酶切后***到质粒pET28a(+)中获得pFZ32。然后将来源于pFZ32含有ispA的XbaI-XhoI片段***到pFZ35的SpeI-XhoI片段中获得质粒pFZ38，该质粒示意图如图8所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.4所示。

Idi基因以BL21(DE3)基因组DNA为模板通过PCR扩增（引物Idi-NdeI，Idi-XhoI见表1），然后通过NdeI，XhoI酶切后***到经相同酶切的pET28a（+）质粒上，获得质粒pET28-Idi。将来源于pET28-Idi质粒上含Idi基因的XbaI-XhoI片段***到pFZ38中获得质粒pFZ71，该质粒示意图如图9所示，序列（不含骨架载体序列）如SEQ ID NO.5所示。pFZ35，pFZ38，pFZ71均以pET21a（+）为质粒骨架，启动子均为T7强启动子、复制子为pBBR322高拷贝复制子。

实施例4法尼烯产生菌的构建

直接将质粒pFZ35转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pFZ35，命名为菌株F0。

利用菌株本底MEP途径（非甲羟戊酸途径）产生法尼烯将甲羟戊酸途径的两个质粒pMH1和pFZ81同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得BL21(DE3)/pMH1/pFZ81，命名为PS（parentstrain）。将pFZ38和pFZ71分别转化进入菌株PS中，获得菌株F1和F5。菌株F0、F1和F5的示意图如图10所示。

实施例5摇瓶发酵生产法尼烯

分别挑取十个F0、F1和F5菌株的单菌落到含2%（v/v）甘油的2×TY培养基中（同时含有100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素），于30℃，220rpm过夜培养，随后按1%（v/v）接种量接种到新鲜的同一培养基中30℃，220rpm继续培养至OD₆₀₀约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，加入诱导剂3小时后，加入1/5培养基体积的正癸烷进行双相发酵。诱导表达后根据设定的时间点进行取样，每次取样为正癸烷相1mL，培养基5mL，正癸烷相8000g离心3min后收集上清进行GC-MS分析，同时以β-法尼烯（sigma）计算萃取率。GC-MS分析条件如下：GC-MS为安捷伦7890A气相色谱配备5975MS，气相色谱柱为HP-5柱（30m*0.32mm*25μm），每次分析进样1μL，GC条件为80℃维持1分钟，10℃/分钟的速率升温到160℃，再以20℃/分钟的速率升温到260℃。以β-法尼烯作为标准品绘制标准曲线进行定量，结果如图11所示：菌株F0发酵液中能检测到法尼烯的产生，但是产量不足1mg/L，而F1和F5产量明显提高，诱导后48小时法尼烯产量分别为0.2g/L，1.1g/L后续仍持续增加。

结论：

（1）四株菌均可产生法尼烯，证明我们构建的利用甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸途径（MEP途径）生产法尼烯的重组菌株是可行的。

（2）F1菌株产量是F0菌株产量的400倍以上，证明我们构建的甲羟戊酸途径是相对高效的。

（3）F5菌株产量是F1菌株产量的50倍，证明过量表达Idi蛋白能够显著提高法尼烯的量。

实施例6摇瓶发酵通过MVA途径生产法尼烯的各蛋白定量

F1和F5培养诱导条件同上，IPTG诱导20小时候取100mL菌液，离心收集菌体，菌体重悬于100mM NH₄HCO₃溶液中，用超声破碎仪破碎细胞（脉冲5s，停8s，超声时间为8min）。破碎液4℃10000g离心30min，吸取上清4℃，200000g超速离心2h，小心吸取上清至新的1.5mL离心管中，每管分装100μL，液氮速冻后-80℃保存备用。随后用Keasling组报道的利用质谱进行蛋白定量方法（Redding-Johanson,A.M.,et al.,2011.Targeted proteomics formetabolic pathway optimization:application to terpene production.Metabolic Engineering.13,194-203.）对MVA途径中各蛋白定量。

蛋白定量结果表明MVA途径合成法尼烯中各蛋白比例为：

F1菌株中AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=10∶16∶2∶1.6∶1∶19∶4∶25∶11；

F5菌株中AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=56∶2∶30∶2∶1∶2∶600∶40∶3；

这与体外重建体系获得的优化比例AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2还有一定距离，说明构建的菌株还未达到理想状态，还有很大的生产潜能有待开发，可通过进一步改造朝着蛋白优化比例改造。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉大学

 

<120>  一种生产法尼烯的菌株及其应用

 

<130>  1

 

<160>  31   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1745

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  AFS（opti）序列

 

<400>  1

catatggaat ttcgtgtcca cctgcaagcc gataatgaac aaaaaatctt tcaaaaccaa       60

atgaagccgg aaccggaagc ctcctacctg attaatcaac gtcgctccgc gaactacaag      120

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aacctgtttg aaaaagaaat caaggaagct ctggattcga ttgcggccat cgaaagcgac      360

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tcgag                                                                 1745

 

<210>  2

<211>  4515

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pMH1序列（不含骨架载体序列）

 

<400>  2

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gaactagtgg atccttagga tttaatgcag gtgacggacc catctttcaa acgatttata      120

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<210>  3

<211>  4667

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pFZ81序列（不含骨架载体序列）

 

<400>  3

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ctcccgggct gcagttattc ctttggtaga ccagtctttg cgtcaatcaa agattcgttt      720

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atatcgctga caactaggac acaagctttc atctgaggcc agtcagagct gtctgcgatt     1320

tgtactgcca tggaatcatg accatcttca gcttttccca tttcccaggc cacgtatccg     1380

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gtctcgtaac taaaatcatc ttgcaatttc tttttgaaac tgtcaatttg ctcttgagta     3480

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ccgattgaga caagcagtcc atgatttatt cttatcaatt ccaatagttg ttcatacagt     3660

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atctctaagc cttgtagggc acattcaccc atggcatcta gaattggctt cataacttca     3780

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attctagtat aggttaggat cattggaatg gctgggaaat catctaagaa cttaaaattg     3900

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tgttgagcct tggccaattt ttgggagttt acttgatcct cggtgatggc attgaaatca     4380

ttgatggacc acttatgatt aaagctaatg tccgggaagt ccaattcaat agtatctggt     4440

gcagatgact cgcttattag caggtaggtt ctcaacgcag acacactagc agcgacggca     4500

ggcttgttgt acacagcaga gtgttcacca aaaataataa cctttcccgg tgcagaagtt     4560

aagaacggta atgacatggt taattcctcc tactgcagga attcgatatc aagcttatcg     4620

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<210>  4

<211>  2773

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<220>

<223>  质粒pFZ38序列（不含骨架载体序列）

 

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ggtccgcgta cccacatcct gagcctgctg ttccaaccgc tggtcaacta actagaaata     1740

attttgttta actttaagaa ggagatatac catgggcagc agccatcatc atcatcatca     1800

cagcagcggc ctggtgccgc gcggcagcca tatggctagc atgactggtg gacagcaaat     1860

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tttacaaacg ctggcgttct cgattttaag cgatgccgat atgccggaag tgtcggaccg     2280

cgacagaatt tcgatgattt ctgaactggc gagcgccagt ggtattgccg gaatgtgcgg     2340

tggtcaggca ttagatttag acgcggaagg caaacacgta cctctggacg cgcttgagcg     2400

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cgccggagat aaaggacgtc gtgctctgcc ggtactcgac aagtatgcag agagcatcgg     2520

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aaaacgccag ggtgccgacc agcaacttgg taaaagtacc taccctgcac ttctgggtct     2640

tgagcaagcc cggaagaaag cccgggatct gatcgacgat gcccgtcagt cgctgaaaca     2700

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gcgtaataaa taa                                                        2773

 

<210>  5

<211>  3422

<212>  DNA

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<220>

<223>  质粒pFZ71序列（不含骨架载体序列）

 

<400>  5

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aaaatgtgtt tccaggtgct gtataacacc acgtgtgaaa ttgcccgtga aatcgaagaa     1140

gaaaacggct ggaatcaagt cctgccgcag ctgaccaaag tgtgggccga tttttgcaag     1200

gcactgctgg ttgaagctga atggtataat aaatcccata ttccgacgct ggaagaatac     1260

ctgcgcaacg gttgtatcag ttcctcagtg tcagttctgc tggtccatag ctttttcagc     1320

attacccacg aaggcacgaa agaaatggcg gatttcctgc acaagaatga agacctgctg     1380

tataacattt ctctgatcgt gcgtctgaac aatgatctgg gtacctccgc agctgaacag     1440

gaacgcggcg attcaccgtc gagcatcgtg tgctacatgc gtgaagttaa tgcgagtgaa     1500

gaaacggccc gcaaaaacat taagggtatg atcgataatg cgtggaaaaa ggtgaacggc     1560

aaatgtttta ccacgaatca ggttccgttt ctgtctagtt tcatgaacaa tgccaccaac     1620

atggcgcgcg ttgcccatag cctgtataaa gatggcgacg gtttcggcga tcaagaaaaa     1680

ggtccgcgta cccacatcct gagcctgctg ttccaaccgc tggtcaacta actagaaata     1740

attttgttta actttaagaa ggagatatac catgggcagc agccatcatc atcatcatca     1800

cagcagcggc ctggtgccgc gcggcagcca tatggctagc atgactggtg gacagcaaat     1860

gggtcgcgga tccatggact ttccgcagca actcgaagcc tgcgttaagc aggccaacca     1920

ggcgctgagc cgttttatcg ccccactgcc ctttcagaac actcccgtgg tcgaaaccat     1980

gcagtatggc gcattattag gtggtaagcg cctgcgacct ttcctggttt atgccaccgg     2040

tcatatgttc ggcgttagca caaacacgct ggacgcaccc gctgccgccg ttgagtgtat     2100

ccacgcttac tcattaattc atgatgattt accggcaatg gatgatgacg atctgcgtcg     2160

cggtttgcca acctgccatg tgaagtttgg cgaagcaaac gcgattctcg ctggcgacgc     2220

tttacaaacg ctggcgttct cgattttaag cgatgccgat atgccggaag tgtcggaccg     2280

cgacagaatt tcgatgattt ctgaactggc gagcgccagt ggtattgccg gaatgtgcgg     2340

tggtcaggca ttagatttag acgcggaagg caaacacgta cctctggacg cgcttgagcg     2400

tattcatcgt cataaaaccg gcgcattgat tcgcgccgcc gttcgccttg gtgcattaag     2460

cgccggagat aaaggacgtc gtgctctgcc ggtactcgac aagtatgcag agagcatcgg     2520

ccttgccttc caggttcagg atgacatcct ggatgtggtg ggagatactg caacgttggg     2580

aaaacgccag ggtgccgacc agcaacttgg taaaagtacc taccctgcac ttctgggtct     2640

tgagcaagcc cggaagaaag cccgggatct gatcgacgat gcccgtcagt cgctgaaaca     2700

actggctgaa cagtcactcg atacctcggc actggaagcg ctagcggact acatcatcca     2760

gcgtaataaa taactagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat accatgggca     2820

gcagccatca tcatcatcat cacagcagcg gcctggtgcc gcgcggcagc catatgcaaa     2880

cggaacacgt cattttattg aatgcacagg gagttcccac gggtacgctg gaaaagtatg     2940

ccgcacacac ggcagacacc cgcttacatc tcgcgttctc cagttggctg tttaatgcca     3000

aaggacaatt attagttacc cgccgcgcac tgagcaaaaa agcatggcct ggcgtgtgga     3060

ctaactcggt ttgtgggcac ccacaactgg gagaaagcaa cgaagacgca gtgatccgcc     3120

gttgccgtta tgagcttggc gtggaaatta cgcctcctga atctatctat cctgactttc     3180

gctaccgcgc caccgatccg agtggcattg tggaaaatga agtgtgtccg gtatttgccg     3240

cacgcaccac tagtgcgtta cagatcaatg atgatgaagt gatggattat caatggtgtg     3300

atttagcaga tgtattacac ggtattgatg ccacgccgtg ggcgttcagt ccgtggatgg     3360

tgatgcaggc gacaaatcgc gaagccagaa aacgattatc tgcatttacc cagcttaaat     3420

aa                                                                    3422

 

<210>  6

<211>  50

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  P15A-f

 

<400>  6

gcattgccgc cgtgggtttc tcgagcgggg cggagatttc ctggaagatg                  50

 

<210>  7

<211>  52

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  P15A-r

 

<400>  7

ggggccactt tttgccggag ctcgagaaat attttatctg attaataaga tg               52

 

<210>  8

<211>  52

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pBBR1MCS1-p15A-f

 

<400>  8

catcttatta atcagataaa atatttctcg agctccggca aaaagtggcc cc               52

 

<210>  9

<211>  50

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pBBR1MCS1-p15A-r

 

<400>  9

catcttccag gaaatctccg ccccgctcga gaaacccacg gcggcaatgc                  50

 

<210>  10

<211>  55

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pBBR1MCS1-f

 

<400>  10

tttgaaagat gggtccgtca cctgcattaa atcctaagga tccactagtt ctaga            55

 

<210>  11

<211>  59

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pBBR1MCS1-r

 

<400>  11

ttttatattc ctcctagtcg actctagagg atccccgggc tgcaggaatt cgatatcaa        59

 

<210>  12

<211>  59

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  atoB-f

 

<400>  12

cccggggatc ctctagagtc gactaggagg aatataaaat gaaaaattgt gtcatcgtc        59

 

<210>  13

<211>  49

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  atoB-r

 

<400>  13

gttgagagtt tcatttagct gtcctcctta attcaaccgt tcaatcacc                   49

 

<210>  14

<211>  46

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ERG13-f

 

<400>  14

acggttgaat taaggaggac agctaaatga aactctcaac taaact                      46

 

<210>  15

<211>  49

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ERG13-r

 

<400>  15

tggctgctgc ccatagtgta atcctcctta ttttttaaca tcgtaagat                   49

 

<210>  16

<211>  47

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  tHMG1-f

 

<400>  16

atgttaaaaa ataaggagga ttacactatg ggcagcagcc atcatca                     47

 

<210>  17

<211>  23

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  tHMG1-r

 

<400>  17

ttaggattta atgcaggtga cgg                                               23

 

<210>  18

<211>  59

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pBBR1MCS2-f

 

<400>  18

cagaaaacga ttatctgcat ttacccagct taaataagag ctccaattcg ccctatagt        59

 

<210>  19

<211>  55

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  pBBR1MCS2-r

 

<400>  19

ttaagaacgg taatgacatg gttaattcct cctactgcag gaattcgata tcaag            55

 

<210>  20

<211>  42

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ERG12-f

 

<400>  20

ctgcagtagg aggaattaac catgtcatta ccgttcttaa ct                          42

 

<210>  21

<211>  44

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ERG12-r

 

<400>  21

ctcaactctg acatttgatc tgcctcctat gaagtccatg gtaa                        44

 

<210>  22

<211>  51

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ERG8-f

 

<400>  22

ttaccatgga cttcatagga ggcagatcaa atgtcagagt tgagagcctt c                51

 

<210>  23

<211>  53

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  ERG8-r

 

<400>  23

gatgctgtgt aaacggtcat gagtattacc tcctatttat caagataagt ttc              53

 

<210>  24

<211>  50

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MVD1-f

 

<400>  24

atcttgataa ataggaggta atactcatga ccgtttacac agcatccgtt                  50

 

<210>  25

<211>  55

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  MVD1-r

 

<400>  25

tgcccatata gtaatcctcc tcccgggctg cagttattcc tttggtagac cagtc            55

 

<210>  26

<211>  51

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Idi-f

 

<400>  26

ggaataactg cagcccggga ggaggattac tatatgggca gcagccatca t                51

 

<210>  27

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Idi-r

 

<400>  27

ttatttaagc tgggtaaatg caga                                              24

 

<210>  28

<211>  58

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  IspA-BamHI

 

<400>  28

gctagcatga ctggtggaca gcaaatgggt cgcggatcca tggactttcc gcagcaac         58

 

<210>  29

<211>  35

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  IspA-EcoRI-SpeI

 

<400>  29

gctagaattc actagttatt tattacgctg gatga                                  35

 

<210>  30

<211>  25

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Idi-NdeI

 

<400>  30

atatcatatg caaacggaac acgtc                                             25

 

<210>  31

<211>  30

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  Idi-XhoI

 

<400>  31

tatactcgag ttatttaagc tgggtaaatg                                        30

Claims (10)

1.一种生产法尼烯的菌株，其特征在于含有甲羟戊酸途径和部分或全部经过密码子优化的法尼烯合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括atoB、erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1和idi基因；所述的法尼烯合成的相关基因包括ispA和afs基因。

2.根据权利要求1所述的生产法尼烯的菌株，其特征在于：所述的afs基因经过密码子优化，其序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的生产法尼烯的菌株，其特征在于：生产法尼烯的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ38的大肠杆菌或含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pFZ71的大肠杆菌；

所述的质粒pMH1以pBBR1MCS为骨架载体、复制子为p15A、启动子为lac启动子、包含atoB、erg13和thmg1基因；

所述的质粒pFZ81以pBBR1MCS-2为骨架载体、复制子为pBBR1MCS复制子、启动子为lac启动子、包含erg12、erg8、mvd1和idi基因；

所述的质粒pFZ38以pET21a(+)为骨架载体、复制子为pBBR322高拷贝复制子、启动子为T7强启动子、包含afs和ispA基因；

所述的质粒pFZ71以pET21a(+)为骨架载体、复制子为pBBR322高拷贝复制子、启动子为T7强启动子、包含afs、ispA和idi基因。

4.根据权利要求3所述的生产法尼烯的菌株，其特征在于：所述的质粒pMH1的序列如SEQ ID NO.2所示；所述的质粒pFZ81的序列如SEQ ID NO.3所示；所述的质粒pFZ38的序列如SEQ ID NO.4所示；所述的质粒pFZ71的序列如SEQ ID NO.5所示。

5.权利要求1-4任一项所述的菌株在生产法尼烯中的应用。

6.利用权利要求1-4任一项所述的生产法尼烯的方法，其特征在于包含如下步骤：将权利要求1-3任一项所述的菌株种子液接入含碳源的培养基中进行原核表达得到法尼烯。

7.根据权利要求6所述的生产法尼烯的方法，其特征在于：原核表达时，加入诱导剂IPTG 2-4小时后再加入正癸烷进行双相发酵。

8.根据权利要求6所述的生产法尼烯的方法，其特征在于：原核表达时MVA途径各蛋白比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS=1-56∶2-16∶2-30∶1-5∶ 1-5∶2-20∶4-600∶20-40∶2-11。

9.根据权利要求6所述的生产法尼烯的方法，其特征在于：原核表达时MVA途径各蛋白比例为AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS =1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2。

10.一种提高原核生物生产番茄法尼烯的方法，其特征在于包含如下方法：对法尼烯合成的相关基因进行密码子优化；或使MVA途径各蛋白更加接近AtoB∶ERG13∶tHMG1∶ERG12∶ERG8∶MVD1∶Idi∶IspA∶AFS =1∶10∶2∶5∶5∶2∶5∶2∶2的进一步改造；或过表达Idi、ERG8、MVD1、ERG13、ERG12和tHMG1中的任一或多个基因。

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