CN103898037B - 一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明在基因工程菌中表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3‑羟‑3‑甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸‑5‑磷酸激酶、甲羟戊酸‑5‑二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶，以及香叶醇合成酶或磷酸酶。本发明利用基因工程手段在大肠杆菌体内成功建立了合成香叶醇和橙花醇的代谢途径，可直接将葡萄糖生物转化为香叶醇和橙花醇。
Description
技术领域
本发明涉及一种联产香叶醇和橙花醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
香叶醇（反-3，7-甲基-2，6-辛二烯-1-醇，Geraniol，又称牻牛儿醇）及其同分异构体橙花醇（顺-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醇，nerol）是一种非环单萜醇类化合物，是玫瑰油、马丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一。香叶醇和橙花醇及其酯可用于香精和食用香精，是玫瑰系香精的主剂，还可广泛应用于药物、烟草、食品配料。此外，还可用作天然低毒防虫剂，一类新型的化学防癌制剂。目前橙花醇的全球年需求量在5000吨左右，其中我国的需求量也不低于500吨，而全世界的生产能力只有3000吨左右。
香叶醇和橙花醇天然存在于天竺葵、芸香草、香茅、玫瑰花等50多种植物中。从天然植物中提取出挥发油，仍是市场上的主要来源。但是，由于人工培植受气候影响较大，且随着人力成本的上升，天然香叶醇的数量和成本难以稳定，供应不能得到保证。
工业上生产香叶醇和橙花醇是以月桂烯为原料，月桂烯的一级氯化物与乙酸钠共热，得香叶醇和橙花醇的乙酸酯混合物。然后将此粗酯皂化，再蒸馏得约含60%牻牛儿醇和40%橙花醇的混合物，仔细分馏可得高品级的香叶醇。黄宇平等以芳樟醇为原料，合成出香叶醇和橙花醇。以柠檬醛为原料制备橙花醇香叶醇的合成方法已有许多报道，例如催化氢化法，醇铝法，硼氢化钠法。尹显洪对硼氢化钠法进行改进研究，以水和苯作混合溶剂，替代纯有机溶剂。采用相转移催化方法，提高反应速率。但是，化学法存在环境污染、条件苛刻等问题，且合成的产品杂质多，影响了香叶醇的品质及下游应用。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种以葡萄糖为底物合成香叶醇和橙花醇的基因工程菌。
所述基因工程菌是在能够表达香叶基焦磷酸的微生物中导入了香叶醇合成酶基因或磷酸酶基因得到的基因工程菌。
所述微生物为常用于分子生物学改造的微生物，优选大肠杆菌。
所述基因工程菌共表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶，以及香叶醇合成酶或磷酸酶。
所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）。
所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶来源于：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）。
所述甲羟戊酸激酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。
所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。
所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。
所述异戊烯焦磷酸异构酶来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母。
所述香叶酯二磷酸合成酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，或北美冷杉(Abiesgrandis)其它生物体，优选北美冷杉。
所述香叶醇合成酶来源于甜罗勒(Sweet Basil)，或细毛樟(Cinnamomumtenuipilum)，或其它生物体。优选来源于甜罗勒的香叶醇合成酶，其核苷酸序列如GenBank:AY362553.1所示。
所述磷酸酶来源于酵母，或细菌，或其它生物体，优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。优选酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1（NCBI Reference Sequence:NM_001180592.1），或来源于酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1（NCBI Reference Sequence:NM_001180811.3），或来源于大肠杆菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF（GenBank:U22009.1），或来源于大肠杆菌的碱性磷酸酶（phoA），或来源于枯草芽胞杆菌的磷酸酶phoE（GenBank:CP003783.1），或来源于克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）的碱性磷酸酶phoA（GenBank:AF453253.1）。
本发明还提供一种构建所述基因工程菌的方法，是在能够表达香叶基焦磷酸的微生物中导入了香叶醇合成酶基因或磷酸酶基因。
所述构建方法主要包括下述步骤：
（1）将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因以及香叶酯二磷酸合成酶基因克隆到质粒pACYCDuet-1，构建重组质粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2。
所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因优选来源于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。所述香叶酯二磷酸合成酶基因来源于北美冷杉（Abiesgrandis）。
（2）将甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因以及异戊烯焦磷酸异构酶基因克隆到pTrcHis2B得到重组质粒pTrc-low。
所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因优选来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
（3）将编码香叶醇合成酶或磷酸酶或焦磷酸酶的基因克隆到质粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2上。
本发明首次证明磷酸酶可以催化GPP合成香叶醇和橙花醇。
本发明还提供了一种生产香叶醇和橙花醇的的方法，是在能够表达香叶基焦磷酸的微生物中导入香叶醇合成酶基因或磷酸酶基因，利用基因工程菌发酵生产香叶醇和橙花醇。
在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶，以及香叶醇合成酶或磷酸酶；利用重组菌发酵生产香叶醇和橙花醇。
优选在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶和磷酸酶；利用重组菌发酵生产香叶醇和橙花醇。
所述磷酸酶是来自酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1，编码该酶的核苷酸序列如NCBIReference Sequence:NM_001180592.1所示；或是来自酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1，编码该酶的核苷酸序列如NCBI Reference Sequence:NM_001180811.3所示；或是来源于大肠杆菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF，其核苷酸序列如GenBank:U22009.1所示；或是来源于大肠杆菌的碱性磷酸酶基因phoA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或是来源于枯草芽胞杆菌的磷酸酶phoE，其核苷酸序列如GenBank:CP003783.1所示；或是来源于克雷伯氏肺炎菌的碱性磷酸酶phoA，其核苷酸序列如GenBank:AF453253.1所示。
本发明提出利用廉价的、可再生资源葡萄糖为原料，通过生物催化剂直接制备香叶醇和橙花醇。该路线原料廉价、可持续供应，具有规模化发展的潜力。与传统的制备工艺相比，利用微生物催化合成蒎烯的路线具有如下的优势：（1）使用的原料为木质纤维素降解获得的葡萄糖，是可再生资源。（2）整个过程是在常温常压下进行，能耗低。（3）与从植物中提取法相同，生物法合成的香叶醇和橙花醇是天然产品，市场需求度高。（4）以葡萄糖为原料，通过工程菌一步发酵获得香叶醇和橙花醇，具备产业化生产潜力。因此，利用生物催化手段制备香叶醇和橙花醇将成为今后工业发展的必然趋势。此外，大肠杆菌具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此大肠杆菌作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
附图说明
图1是质粒pLWG2构建示意图。
图2是质粒pLWG3构建示意图。
图3是质粒pLWG4构建示意图。
图4是质粒pLWG5构建示意图。
图5香叶醇和橙花醇混合标准品GC-MS流出曲线。
图6橙花醇分子碎片质谱图。
图7香叶醇分子碎片质谱图。
图8工程大肠杆菌LWG2合成出的香叶醇GC-MS图。
图9工程大肠杆菌LWG3的GC-MS图。
图10工程大肠杆菌LWG4的GC-MS图。
图11香叶醇和橙花醇混合标准品的GC检测图。
图12工程大肠杆菌LWG5合成出的橙花醇和香叶醇的GC检测图。
图13工程大肠杆菌LWG6合成出的橙花醇和香叶醇的GC检测图。
具体实施方式
本发明利用基因工程手段以大肠杆菌为模式菌株，在其体内成功建立了合成香叶醇和橙花醇的代谢途径，可直接将葡萄糖生物转化为香叶醇和橙花醇。
橙花醇和香叶醇的检测方法：取发酵液1ml然后12000×1min离心，取上清500μl并加入等体积乙酸乙酯于涡旋振荡器上混匀5min，然后静置10min，取上层有机相进行过滤后放置在液相小瓶中待测。检测条件：GC-MS仪器型号：Angilent7890；分离柱型号：DB-5；离子源：EI；进样量：0.01ml；检测器：四级杆；柱温：50℃起步以10℃/min的速度升温至280℃，保温5min；样品检测：取液相小瓶中液体进行检测。GC仪器型号：SP-6890分离柱形号：HP-INNOWAX进样量：1ul检测器：氢火焰检测器（FID）柱温：50℃起步以10℃/min的速度升温至250℃，保温5min样品检测：取上层有机相进行检测。
质粒：
pYJM26，即pACY-mvaE-mvaS-GPPS2，是携带有来源于粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)（GenBankNo.AAG02438），3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)（GenBank No.AAG02439）；以及来源于北美冷杉（Abiesgrandis）的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)(GenBankNo.AF513112.1)的pACYCDuet-1。pYJM26的构建方法参见Jianming Yang,et al.Metabolicengineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。
pYJM14，即pTrc-low，是携带有来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)NCBI Reference Sequence:NM_001182715.1，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)NCBI Reference Sequence:NM_001182727.1，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)GenBank:X97557.1，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)NCBI ReferenceSequence:NM_001183931.1的pTrcHis2B。该质粒的构建方法参见Jianming Yang,etal.Metabolic engineering of Escherichia coli for the biosynthesis of alpha-pinene.Biotechnology for Biofuels,2013,6:60。
表1引物序列
实施例1表达来源于酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1生物合成橙花醇和香叶醇
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)和来源于酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶DPP1（NCBI Reference Sequence:NM_001180592.1），利用葡萄糖生物合成香叶醇。
（1）DPP1基因的克隆和表达载体的构建
以酿酒酵母S288c基因组DNA为模版，DPP1-rbs-F2和DPP1-XhoR为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性5s，60℃退火5s，72℃延伸1min30s，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，72℃延伸10min。利用胶回收试剂盒（购自Fermentas，Cat.No.K0692）回收目的基因片段。将所得基因片段与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pLWG2(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-‘DPP1)（图1）后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
（2）E.coli重组菌株的构建
将pLWG2和pYJM4共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pLWG2和pYJM4的工程大肠杆菌LWG2。
（3）发酵产橙花醇和香叶醇
挑取步骤（2）获得的LWG2的白色单克隆（12h内长出的）在3ml LB(Cm+Amp,1‰)中，于37℃摇床培养活化。菌浓为1.0左右转接至30ml LB（Amp+Cm）中进行扩培，作为种子。
取扩培后的菌液按1%接种量接入100ml发酵培养基（K2HPO4·3H2O0.98g；一水合柠檬酸0.21g；柠檬酸铁铵0.03g；MD牛肉粉0.9g；葡萄糖0.2g；MgSO4(1M)200ul；微量元素100μl（(NH4)6Mo7O24·4H2O7.4g/L，ZnSO4·7H2O5.8g/L，H3BO449.4g/L，CuSO4·5H2O5g/L，MnCl2·4H2O31.6g/L）；氨苄青霉素50μg/mL；氯霉素34μg/mL），37℃摇菌，菌浓长至1.0左右加入终浓度为0.5mM的IPTG，加瓶塞，进行厌氧发酵。30℃，180rpm摇菌。（4）产物检测
发酵24-48h后，取最终发酵液检测产量，GC-MS结果表明（图8），获得了451mg/L的橙花醇和400mg/L的香叶醇。
实施例2表达来源于酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1生物合成橙花醇和香叶醇
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)和来源于酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1（NCBI Reference Sequence:NM_001180811.3），利用葡萄糖生物合成香叶醇。
（1）LPP1基因的克隆和表达载体的构建
以酿酒酵母S288c基因组DNA为模版，LPP1-rbs-F2和LPP1-XhoR为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性5s，62℃退火5s，72℃延伸1min30s，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，72℃延伸10min。利用胶回收试剂盒（购自Fermentas，Cat.No.K0692）回收目的基因片段。将所得基因片段与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pLWG3(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-‘LPP1)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
（2）E.coli重组菌株的构建
将pLWG3(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-‘LPP1)和pYJM14重组质粒（共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pLWG3和pYJM4的工程大肠杆菌LWG3。
（3）发酵产橙花醇和香叶醇
M9种子培养基（/L）：20g葡萄糖，6g Na2HPO4，3g KH2PO4，1g NH4Cl，0.5gNaCl，0.24gMgSO4，121℃高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基（/2L）：19.6g K2HPO4·3H2O，4.2g citric acid·H2O，0.6g柠檬酸铁铵，0.8ml浓硫酸，40g葡萄糖，0.123mg(NH4)6Mo7O2·4H2O，0.097mg ZnSO4·7H2O，0.823mgH3BO4，0.083mg CuSO4·5H2O，0.527mg MnCl2·4H2O，4ml1M MgSO4，1900ml蒸馏水。
挑取单克隆到50ml M9种子培养基中，37℃、180rpm活化过夜（18-24h）。将种子按10%的接种量接种至含有2L发酵培养基的5L小型发酵罐中，通气量1.3VVM，转速400rpm，37℃培养至OD600约为12时，添加终浓度为0.1-1mM的IPTG，25℃-37℃诱导表达，以氨水调pH，控制pH在7.0。得到的蒎烯产物通过GC-MS对其进行定性和定量分析。培养过程中对发酵液中残余葡萄糖进行检测，并通过变速流加浓度为800g/L的糖液，维持残糖浓度在0.5g/L以下。每4h取发酵液5ml，测定细胞OD600、葡萄糖浓度；每15min取尾气1ml,利用气相色谱检测产物异戊二烯浓度。直到OD不再变化，产物不再产生为止。
GC-MS结果表明（图9），获得了1.35g/L的橙花醇和1.98g/L的香叶醇。
实施例3表达来源于大肠杆菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF生物合成橙花醇和香叶醇
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)和来源于大肠杆菌的ADP-核糖焦磷酸酶基因EcNudF（GenBank:U22009.1），利用葡萄糖生物合成香叶醇。
（1）EcNudF基因的克隆和表达载体的构建
以大肠杆菌K12基因组DNA为模版，eNudF-rbs-BglF和eNudF-XhoR为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性5s，58℃退火5s，72℃延伸1min30s，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，72℃延伸10min。利用胶回收试剂盒（购自Fermentas，Cat.No.K0692）回收目的基因片段。将所得基因片段与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pLWG4(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-EcNudF)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
（2）E.coli重组菌株的构建
将pLWG4和pYJM14共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pLWG4和pYJM4的工程大肠杆菌LWG4。
（3）发酵产橙花醇和香叶醇
工程大肠杆菌LWG4的培养和发酵方法同实施例1。GC-MS结果表明，获得了135mg/L的橙花醇和198mg/L的香叶醇。
实施例4表达来源于甜罗勒香叶醇合成酶基因GES生物合成橙花醇和香叶醇
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)和来源于甜罗勒香叶醇合成酶基因GES（GenBank:AY362553.1），利用葡萄糖生物合成香叶醇。
（1）GES基因的克隆和表达载体的构建
根据基因序列GenBank:AY362553.1合成香叶醇合成酶基因(GES)，并连入pGH载体上形成pGH-GES载体。以pGH-GES为模版，GES-rbs-Bgl II和GES-xhol I为引物，PCR扩增，PCR扩增条件：98℃预变性30s；98℃变性5s，57℃退火5s，72℃延伸1min30s，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，72℃延伸10min。利用胶回收试剂盒（购自Fermentas，Cat.No.K0692）回收目的基因片段。
将回收的基因片段与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pLWG1(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-GES)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
（2）工程大肠杆菌LWG6的构建
将pLWG1和pYJM14重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pLWG1和pYJM4的工程大肠杆菌LWG5。
（3）发酵产橙花醇和香叶醇
发酵方法同实施例2，利用GC进行定量检测（图12），最终获得了150mg/L的橙花醇和1.98g/L的香叶醇。
实施例5表达来源于大肠杆菌的碱性磷酸酶（phoA）生物合成橙花醇和香叶醇
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)和来源于大肠杆菌的碱性磷酸酶（phoA），如SEQ ID NO.1所示，利用葡萄糖生物合成香叶醇。
（1）phoA基因的克隆及质粒构建
以大肠杆菌K12基因组DNA为模版，phoA-rbs-F2和phoA-R为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。利用胶回收试剂盒（购自Fermentas，Cat.No.K0692）回收目的基因片段。
将回收的基因片段与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1:5的比例，4℃连接过夜或16℃连接4～6h，连接产物转化E.coli DH5α，然后涂布加有34μg·mL-1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pLWG5(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-phoA)后，再通过限制性酶切和测序鉴定。
（2）E.coli重组菌株LWG5的构建
将pLWG5和pYJM14重组质粒共同热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于加有氯霉素和氨苄霉素抗生素的LB固体平板，通过PCR筛选获得阳性克隆，由此获得含有pLWG5和pYJM4的工程大肠杆菌LWG5。
（3）发酵产橙花醇和香叶醇
方法同实施例1，GC结果表明（图13），获得了20mg/L的橙花醇和637mg/L的香叶醇。
实施例6表达来源于枯草芽胞杆菌的磷酸酶phoE生物合成橙花醇和香叶醇
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)和来源于枯草芽胞杆菌的磷酸酶phoE如SEQ ID NO.2所示（GenBank:CP003783.1）。质粒方法：由上海生工合成两段带有BglII和XhoI酶切位点的基因phoE，形成质粒pGH/phoE,将该质粒与pYJM26载体分别用BglII和XhoI进行双酶切，连接、转化和发酵等过程同实施例5。最终利用葡萄糖，发酵培养后获得了15mg/L的橙花醇和35mg/L的香叶醇。
实施例7表达来源于克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）的碱性磷酸酶phoA生物合成橙花醇和香叶醇
通过在大肠杆菌中共同表达来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(mvaE)，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因(mvaS)；来源于酿酒酵母的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因(ERG8)，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因(ERG19)，异戊烯焦磷酸异构酶基因(IDI1)；来源于北美冷杉的香叶酯二磷酸合成酶基因(GPPS2)和来源于克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）的碱性磷酸酶phoA（GenBank:AF453253.1），利用葡萄糖发酵培养后获得了60mg/L的橙花醇和348mg/L的香叶醇。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (1)
1.一种生产香叶醇和橙花醇的方法，其特征在于，通过基因工程菌利用葡萄糖生产香叶醇和橙花醇，所述基因工程菌是在大肠杆菌中共表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、香叶酯二磷酸合成酶以及磷酸酶；所述磷酸酶基因是来自酿酒酵母的磷脂酸磷酸酶LPP1，编码该酶的核苷酸序列如NCBIReference Sequence:NM_001180811.3所示；其中乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因来源于粪肠球菌，其中香叶酯二磷酸合成酶基因来源于北美冷杉；其中甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因来源于酿酒酵母。
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