CN105087408B - 一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产β‑胡萝卜素的酵母菌株及其应用。本发明酵母菌株基因组上的GAL1、GAL7和GAL10基因被ERG12、tHMG1和ERG8基因替换掉;GAL80基因被MVD1、ERG10和IDI1基因替换掉;ERG9基因的启动子被tHMG1、ERG13基因和pCTR3启动子替换掉;且含有能表达carG、carB和carRA基因的真核表达质粒。各基因通过构建在半乳糖诱导的启动子下实现超表达。这些启动子在细胞生长前期时不启动,而在细胞生长后期时启动基因表达,可以避免细胞生长前期β‑胡萝卜素的积累对细胞生长造成伤害。将本发明菌株接入含碳源的培养基中进行发酵即可得到β‑胡萝卜素。
Description
技术领域
本发明属于代谢工程和合成生物学领域,涉及一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株及其应用。
背景技术
β-胡萝卜素是类胡萝卜素(Carotenoids)的一种,具有非常强的抗氧化性,可以预防、延缓和治疗某些疾病,尤其是癌症,同时也能提高机体的免疫功能。目前被广泛应用于食品、药品、化妆品和保健品行业,具有广阔的市场前景。
目前β-胡萝卜素的开发生产主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等方法。相比于前两种生产方式,微生物发酵生产β-胡萝卜素具有生产周期短,原料低廉易获取,生产成本低,安全性高,产物易纯化等特点。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株。
本发明的另一目的在于提供上述生产β-胡萝卜素菌株的应用。
本发明的再一目的在于提供利用上述菌株生产β-胡萝卜素的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株,其基因组上的GAL1、GAL7和GAL10基因被ERG12、tHMG1和ERG8基因替换掉;GAL80基因被MVD1、ERG10和IDI1基因替换掉;ERG9基因的启动子被tHMG1、ERG13基因和pCTR3启动子替换掉;且含有能表达carG、carB和carRA基因的真核表达质粒。所述的ERG12、tHMG1、ERG8、MVD1、ERG10、IDI1、ERG13、carG、carB和carRA基因通过构建在半乳糖诱导的启动子下实现超表达。所述的半乳糖诱导的启动子优选为GAL1、GAL7和GAL10基因的启动子(pGAL1、pGAL7和pGAL10),这些启动子在细胞生长前期时不启动,而在细胞生长后期时开始启动基因表达,使用这些启动子可以避免细胞生长前期β-胡萝卜素的积累对细胞生长造成伤害。
所述的酵母菌株优选为酿酒酵母CEN.PK2-1C。
所述的GAL1、GAL7、GAL10和GAL80基因为酿酒酵母内涉及到半乳糖代谢和调控相关的基因。其中,基因GAL1编码将D-半乳糖磷酸转化为D-半乳糖-1-磷酸的半乳糖激酶,基因GAL7编码将D-半乳糖-1-磷酸转化为D-葡萄糖-1-磷酸的半乳糖-1-磷酸转尿苷酰酶,基因GAL10编码将尿苷二磷酸-半乳糖转化为尿苷二磷酸-葡萄糖的尿苷二磷酸葡萄糖异构酶,基因GAL80转录的蛋白和GAL4蛋白结合,阻止GAL4蛋白对半乳糖代谢相关基因的转录激活作用。
所述的ERG12、tHMG1、ERG8、MVD1、ERG10、IDI1和ERG13基因为酿酒酵母内甲羟戊酸途径中相关的基因。其中,基因ERG10编码将两分子乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的乙酰辅酶A硫脂酶,基因ERG13编码将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的HMG-CoA合酶,基因tHMG1编码将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的HMG-CoA还原酶,基因ERG12编码将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的甲羟戊酸激酶,基因ERG8编码将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的甲羟戊酸磷酸激酶,基因MVD1编码将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶,基因IDI1编码将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的异戊烯焦磷酸异构酶。
所述的carG、carB和carRA基因为外源引入的β-胡萝卜素合成相关基因。其中,基因carG编码将异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸缩合为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶,基因carRA编码的蛋白具有双功能,将两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸缩合为八氢番茄红素的八氢番茄红素合成酶功能和将番茄红素环化生成β-胡萝卜素的番茄红素环化酶功能,基因carB编码将八氢番茄红素脱氢生成番茄红素的八氢番茄红素脱氢酶。
所述的甲羟戊酸途径相关基因优选为来源于酿酒酵母INVSC1的ERG10(329138979:498096-499292)、ERG13(329138949:19060-20535)、tHMG1(329138949:115734-117239)、ERG12(329138949:684467-685798)、ERG8(329138949:712316-713671)、MVD1(329138953:701895-703085)和IDI1(329138979:327864-328730)。
所述的β-胡萝卜素合成相关的基因为经过密码子优化的基因,优选以三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的carG(JQ289995.1)、carB(AY176663.1)和carRA(AY176663.1)基因为基础进行密码子优化得到的基因,经过密码子优化的carG、carB和carRA基因的序列如SEQ ID NO.9-11所示。
所述的生产β-胡萝卜素的酵母菌株,优选通过包含如下步骤的方法制备得到:
(1)将以p416GAL1为骨架载体,包含ERG12、tHMG1、ERG8、TRP1基因(TRP1基因编码蛋白的功能涉及到酿酒酵母中色氨酸的合成,该基因存在时可恢复营养缺陷型酵母CEN.PK2-1C色氨酸合成能力,用作质粒的筛选标记)和pGAL7、pGAL10、pGAL1启动子,序列如SEQ ID NO.12所示的pXL141质粒(不含骨架载体序列)用XhoI酶切后转化酿酒酵母CEN.PK2-1C,以色氨酸TRP1为筛选标记,筛选到携带所述基因和启动子的片段同源重组后替换掉CEN.PK2-1C基因组上GAL1、GAL7和GAL10基因的菌株XL151。在pXL141质粒上,基因ERG12构建在启动子pGAL7下,基因tHMG1构建在启动子pGAL10下,基因ERG8构建在启动子pGAL1下。
(2)将以p416GAL1为骨架载体,包含MVD1、ERG10、IDI1、LEU2基因(LEU2基因编码蛋白的功能涉及到酿酒酵母中亮氨酸的合成,功能同TRP1)和pGAL7、pGAL10、pGAL1启动子,序列如SEQ ID NO.13所示的pXL142质粒(不含骨架载体序列)用XhoI酶切后转化步骤(1)得到的菌株XL151,以亮氨酸LEU2为筛选标记,筛选到携带所述基因和启动子的片段同源重组后替换掉XL151基因组上GAL80基因的菌株XL152。在pXL142质粒上,基因MVD1构建在启动子pGAL7下,基因ERG10构建在启动子pGAL10下,基因IDI1构建在启动子pGAL1下。
(3)将以p416GAL1为骨架载体,包含tHMG1、ERG13、HIS3基因(HIS3基因编码蛋白的功能涉及到酿酒酵母中组氨酸的合成,功能同TRP1)和pGAL10、pGAL1、pCTR3启动子,序列如SEQ ID NO.14所示的pXL143质粒(不含骨架载体序列)用NcoI酶切后转化步骤(2)得到的菌株XL152,以组氨酸HIS3为筛选标记,筛选到携带所述基因和启动子的片段同源重组后替换掉XL152基因组上ERG9基因启动子的菌株XL153。在pXL143质粒上,基因tHMG1构建在启动子pGAL10下,基因ERG13构建在启动子pGAL1下。
(4)往菌株XL153中转入能表达carG、carB和carRA基因的真核表达质粒得到生产β-胡萝卜素的酵母菌株。
优选的步骤(4)为:将以p426GAL1为骨架载体,包含carG、carB、carRA、URA3基因(URA3基因编码蛋白的功能涉及到酿酒酵母中组氨酸的合成,功能同TRP1)和pGAL7、pGAL10、pGAL1启动子,序列如SEQ ID NO.15所示的pXL144质粒(不含骨架载体序列)转化步骤(3)得到的菌株XL153,以尿嘧啶URA3为筛选标记,筛选得到菌株XL154。在pXL144质粒上,基因carG构建在启动子pGAL1下,基因carB构建在启动子pGAL10下,基因carRA构建在启动子pGAL7下。
上述生产β-胡萝卜素的酵母菌株在生产β-胡萝卜素中的应用。
利用上述生产β-胡萝卜素的酵母菌株生产β-胡萝卜素的方法,包含如下步骤:将上述生产β-胡萝卜素的酵母菌株接入含碳源的培养基中进行发酵得到β-胡萝卜素。所述的碳源优选为葡萄糖、甘油或乙醇。
所述的培养基优选为如下培养基中的一种:
SC-URA液体培养基:0.67%YNB,2%葡萄糖,缺尿嘧啶的氨基酸混合物;
YPD液体培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,2%葡萄糖;
YPDG液体培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,1%葡萄糖,1%甘油;
YPDE液体培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,1%葡萄糖,1%乙醇。
更优选的,所述的培养基为YPDE液体培养基。
本发明中涉及的培养基或溶液的%单位指每100mL培养基或溶液中含有该物质多少g,如发酵培养基YPDE是指100mL YPDE培养基中含有蛋白胨2g、酵母提取物1g、葡萄糖1g、乙醇1g。其他培养基或溶液亦然。
所述的氨基酸混合物的配方如下表1:
缺尿嘧啶的氨基酸混合物即上述混合物中不含尿嘧啶,缺亮氨酸的氨基酸混合物即上述混合物中不含L-亮氨酸。
上述生产β-胡萝卜素的酵母菌株还可用于生产番茄红素。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:选用工业上常用的模式菌株酿酒酵母作为宿主菌株,该菌株具有遗传改造简单,同时在工业生产上具有明显抗逆性优势。本发明首先特征性比较了酿酒酵母中半乳糖诱导相关启动子的表达强度,选取较强的诱导型启动子pGAL1、pGAL7和pGAL10用于控制β-胡萝卜素合成相关的基因表达。同时通过敲除调控半乳糖相关的基因GAL80,实现诱导型启动子的组成型表达,使得构建的菌株无需添加诱导剂半乳糖可以合成β-胡萝卜素产物。同时本发明通过密码子优化合成来源于三孢布拉霉中β-胡萝卜素合成相关的基因,成功实现了在异源真核宿主内进行表达。随后本发明超表达了甲羟戊酸途径中的基因以提高前体异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的合成。通过这些技术,在摇瓶发酵中,构建的工程菌种能够合成45mg/L的β-胡萝卜素,同时产生29mg/L的番茄红素。随后经过碳源的优化,工程菌株可以产生149mg/L的总胡萝卜素(64mg/L的β-胡萝卜素和85mg/L的番茄红素),该发明具有很好的工业运用前景。
附图说明
图1是β-胡萝卜素合成途径示意图。
图2是半乳糖代谢示意图。
图3是半乳糖调控示意图。
图4是GAL80敲除菌株构建示意图。
图5是转化了pRS416GAL1_lacZ质粒的酿酒酵母的生长曲线图。
图6是不同诱导型启动子强度测定结果图。
图7是质粒pXL141构建示意图。
图8是质粒pXL141染色体整合位点示意图。
图9是质粒pXL142构建示意图。
图10是质粒pXL142染色体整合位点示意图。
图11是质粒pXL143构建示意图。
图12是质粒pXL143染色体整合位点示意图。
图13是质粒pXL144构建示意图。
图14是XL154菌株在SC-URA培养基中添加不同浓度半乳糖生产β-胡萝卜素的结果图。
图15是XL154菌株在SC-URA培养基中添加2%葡萄糖摇瓶发酵的结果图。
图16是XL154菌株在YPD、YPDG和YPDE液体培养基中摇瓶发酵的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明从酿酒酵母基因组DNA中扩增相应诱导型启动子片段,选用lacZ基因作为启动子活性检测的报告基因,通过测定β-半乳糖苷酶活性反映启动子的强弱。从酿酒酵母基因组DNA中扩增甲羟戊酸途径中相应基因,并随后整合在染色体上实现了内源超表达酿酒酵母的甲羟戊酸途径以提供前体异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)。最后通过密码子优化并表达了来源于三孢布拉霉的β-胡萝卜素合成基因,构建一株可以高效合成β-胡萝卜素的菌株。相关反应途径见图1。
实施例1启动子表达宿主菌的构建
GAL4蛋白对半乳糖代谢相关基因有转录激活作用,而GAL80蛋白可以和GAL4蛋白结合,从而阻止GAL4蛋白对半乳糖代谢相关基因的转录激活,半乳糖代谢相关基因如图2所示。当诱导剂半乳糖存在时,半乳糖可以和GAL80蛋白以及GAL3蛋白、ATP形成复合物,游离的GAL4蛋白可以发挥转录激活作用,促进半乳糖代谢相关基因的表达;当半乳糖不存在时,GAL80蛋白和GAL4蛋白结合,从而使GAL4蛋白无法发挥转录激活作用,半乳糖代谢相关基因不表达。敲除GAL80基因可以解除对GAL4蛋白的相互结合,实现启动半乳糖代谢相关基因转录的组成型表达。相关原理如图3所示。
启动子表达宿主菌为GAL80基因敲除的酿酒酵母,其构建过程如下:
(1)以p415GAL1(购自ATCC)质粒为模板,用引物ΔGAL80-LEU2-F和ΔGAL80-LEU2-R PCR得到亮氨酸LEU2筛选标记ΔGAL80/LEU2。
(2)以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组DNA为模板,用引物ΔGAL80-5’-F、ΔGAL80-5’-R PCR得到用于敲除GAL80基因的5’端同源臂(同源左臂),用引物ΔGAL80-3’-F、ΔGAL80-3’-R PCR得到用于敲除GAL80基因的3’端同源臂(同源右臂)。
(3)将得到的三个片段通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收,然后以这三个片段为模板,ΔGAL80-5’-F和ΔGAL80-3’-R为引物,利用重叠PCR(OE-PCR)反应连接为一条片段。PCR过程如图4所示。
(4)随后用LiAC方法将连接的片段转化酿酒酵母CEN.PK2-1C菌株,SC-LEU固体平板(0.67%YNB,2%葡萄糖,缺亮氨酸的氨基酸混合物,2%琼脂)筛选阳性克隆。
(5)将筛选的阳性克隆提取基因组后进一步通过PCR验证,验证引物为ΔGAL80-verify-F和ΔGAL80-verify-R。验证正确的菌株命名为EX002,用于筛选GAL系列诱导型启动子的表达。
实施例1所用引物的序列见表2:
表2
实施例2启动子表达载体的构建
选用酿酒酵母中pGAL1(SEQ ID NO.1)、pGAL2(SEQ ID NO.2)、pGAL3(SEQ IDNO.3)、pGAL5(SEQ ID NO.4)、pGAL7(SEQ ID NO.5)和pGAL10(SEQ ID NO.6)六个GAL系列的启动子以及pGAL10-GAL1(SEQ ID NO.7,在酿酒酵母中天然存在形式,用于测定启动子pGAL1的强度)、pGAL1-GAL10(SEQ ID NO.8,用于测定启动子pGAL10的强度)两个双向启动子。并选用酿酒酵母中组成型启动子pTEF1、pPGK1、pTPI1和GAL系列的启动子进行比较。组成型启动子pTEF1、pPGK1、pTPI1序列来源于Jie S等(Sun,J.,et al.2012.Cloning andcharacterization of a panel of constitutive promoters for applications inpathway engineering in Saccharomyces cerevisiae.Biotechnology andbioengineering.109:2082-2092.)报道的组成型启动子序列。
构建上述启动子的表达载体,具体过程如下:
(1)以大肠杆菌MG1655基因组为模板,用引物BamHI-lacZ-F和HindIII-lacZ-R为引物扩增获得lacZ基因片段。用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切处理获得的lacZ基因片段,随后连接到经过相同内切酶处理的质粒p416GAL1(购自ATCC)上,获得质粒pRS416GAL1_lacZ。
(2)以酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组为模板扩增获得启动子片段。用引物GAL2-F和GAL2-R PCR得到pGAL2启动子片段,用引物GAL3-F和GAL3-R PCR得到pGAL3启动子片段,用引物GAL5-F和GAL5-R PCR得到pGAL5启动子片段,用引物GAL7-F和GAL7-R PCR得到pGAL7启动子片段,用引物GAL10-F和GAL10-R PCR得到pGAL10启动子片段,用引物GAL10-GAL1-F和GAL10-GAL1-R PCR得到pGAL10-GAL1双向启动子片段,用引物GAL1-GAL10-F和GAL1-GAL10-R PCR得到pGAL1-GAL10双向启动子片段,用引物TEF1-F和TEF1-R PCR得到pTEF1启动子片段,用引物TPI1-F和TPI1-R PCR得到pTPI1启动子片段,用引物PGK1-F和PGK1-R PCR得到pPGK1启动子片段。
(3)以pRS416GAL1_lacZ载体为模板,用引物pRS416GAL1_lacZ-F和pRS416GAL1_lacZ-R扩增得到质粒骨架。
(4)用DNA assembler方法(Shao,Z.,and Zhao H.,2011.DNA assembler:asynthetic biology tool for characterizing and engineering natural productgene clusters.Methods in enzymology.517:203-224.)在酿酒酵母INVSC1中通过同源重组将启动子片段和载体骨架组装为启动子表达载体。分别取200ng启动子片段和200ng质粒骨架片段混合,总体积计为V,添加10%总体积的3M乙酸钠和2%总体积的10mg/mL的糖元,混匀后添加两倍总体积的无水乙醇,-80℃冰箱放置2小时。13200rpm离心20分钟后去上清,剩余沉淀冷冻干燥后加入5μL水溶解。随后将5μL DNA全部转化酿酒酵母INVSC1。
(5)用酵母质粒提取试剂盒(购自上海天根)从酿酒酵母中提取质粒,并转化大肠杆菌XL1-blue,用于富集构建的质粒。再用质粒小量提取试剂盒(Axygen)从大肠杆菌中提取质粒,通过酶切验证载体的正确性。
pRS416GAL1_lacZ命名为pEX16(含有启动子pGAL1的质粒p416GAL1片段和***的lacZ片段组装得到的启动子表达载体),pRS416GAL10_lacZ(GAL10启动子片段和质粒骨架组装得到的启动子表达载体,下述载体的含义与此类似)命名为pEX17,pRS416GAL1-GAL10_lacZ命名为pEX18,pRS416GAL10-GAL1_lacZ命名为pEX19,pRS416GAL7_lacZ命名为pEX20,pRS416GAL2_lacZ命名为pEX21,pRS416GAL3_lacZ命名为pEX22,pRS416GAL5_lacZ命名为pEX23,pRS416TEF1_lacZ命名为pEX24,pRS416PGK1_lacZ命名为pEX25,pRS416TPI1_lacZ命名为pEX26。
实施例2所用引物的序列见表3:
表3
实施例3启动子表达强度的测定
为了测量酿酒酵母生长曲线,以确定其生长的对数期和稳定期,选用在实施例1构建的EX002菌株中转化了pEX16质粒的酿酒酵母菌株作为测量菌株。挑取单菌落接种至5mLSC-URA液体培养基(0.67%YNB,2%葡萄糖,缺尿嘧啶的氨基酸混合物)中,过夜培养。分别取过夜培养后的菌液约400μL接种于三个装有50mL SC-URA液体培养基的250mL三角瓶中,初始OD600均约为0.1,记录初始OD600值,于30℃摇床培养。分别于培养3h、6h、9h、12h、13.5h、24h时取1mL菌液测OD600。生长曲线如图5所示。
将实施例2中构建好的含有酿酒酵母启动子的质粒pEX17、pEX18、pEX19、pEX20、pEX21、pEX22、pEX23、pEX24、pEX25、pEX26分别转化实施例1构建的酿酒酵母菌株EX002,用于测量启动子的表达强度。
挑取2-3个含有不同酿酒酵母启动子的质粒的单菌落至5mL SC-URA液体培养基中。过夜培养后分别转接80μL菌液至8mL新鲜的SC-URA液体培养基中,30℃摇床培养。在对数期10.5小时和稳定期25小时分别取1mL菌液至离心管中,用于测定样品的OD600。同时取1mL菌液3000rpm离心5分钟,吸取上清后于-80℃保存,用于测量启动子强度。
用lacZ酶(β-半乳糖苷酶)活性作为启动子强度的指标,β-半乳糖苷酶活性的检测方法采用ONPG法(Partow,S.,et al.2010.Characterization of different promotersfor designing a new expression vector in Saccharomyces cerevisiae.Yeast.27:955-964.)。取出1mL在-80℃保存的菌液,解冻后加入1mL预冷的bufferZ(0.06M Na2HPO4,0.04M NaH2PO4,0.01M KCl,0.001M MgSO4·7H2O)将菌体充分悬浮起来。往2mL离心管中加入100μL上述重悬菌液和900μL bufferZ。再在上述混合物中加入100μL氯仿和50μL 0.1%的SDS溶液,充分振荡15秒。将样品放入30℃水浴,预热5分钟,加入0.2mL 4mg/mL的ONPG(2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)。再在30℃反应30分钟(此时反应液出现黄色),立即加入0.5mL 1M的Na2CO3溶液,终止反应。13000rpm离心5分钟,取上清测OD420的值,并用以下公式计算β-半乳糖苷酶的活性U=1000×(OD420/t×V×OD600)。
其中t表示反应时间,V表示菌液的体积,OD420表示上清在紫外UV值=420时的光吸收值,OD600表示菌液在紫外UV值=600时的光吸收值。
EX002菌株中各个启动子强度比较结果见图6。
通过图6得出如下结论:
(1)在敲除了GAL80基因的菌株EX002中,GAL系列的启动子可以在不加诱导剂半乳糖的条件下进行转录。
(2)不同于组成型启动子,GAL系列的启动子在对数期表达相对较弱,有的甚至没有启动作用,但到稳定期时启动子活性大幅度的增加,增加的幅度从几倍到十多倍。GAL系列启动子的使用可以减少前期产物产生对细胞的毒性作用。
(3)GAL系列启动子中强度较强的启动子为pGAL1、pGAL7、pGAL10、pGAL2和双向启动子pGAL10-GAL1、pGAL1-GAL10。
由于产物β-胡萝卜素为一种抗氧化剂,在细胞生长前期合成时会对细胞造成潜在的伤害。本发明特征比较了一批与半乳糖代谢相关的启动子,并且发现其在稳定期时开始启动,因此选用这些启动子为随后实例中β-胡萝卜素合成相关基因的启动子,主要选用启动子为pGAL7和双向启动子pGAL10-GAL1、pGAL1-GAL10(与单独启动子启动效率相差不大,且天然结合在一起,易于随后的构建操作)。
实施例4β-胡萝卜素合成代谢途径质粒的构建
质粒pXL141含有甲羟戊酸途径的三个基因:来源于酿酒酵母INVSC1的tHMG1(HMG-CoA还原酶,3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶,删除了HMG1的跨膜区域)、ERG12(甲羟戊酸激酶)和ERG8(甲羟戊酸-5-磷酸激酶)基因。基因ERG12构建在启动子pGAL7下,基因tHMG1构建在启动子pGAL10下,基因ERG8构建在启动子pGAL1下。
质粒pXL142含有甲羟戊酸途径的三个基因:来源于酿酒酵母INVSC1的ERG10基因(乙酰乙酰辅酶A硫酯酶)、MVD1(甲羟戊酸-5-焦磷酸激酶)和IDI(异戊烯焦磷酸异构酶)基因。基因MVD1构建在启动子pGAL7下,基因ERG10构建在启动子pGAL10下,基因IDI1构建在启动子pGAL1下。
质粒pXL143含有甲羟戊酸途径的两个基因:来源于酿酒酵母INVSC1的tHMG1(HMG-CoA还原酶,3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A还原酶,删除了HMG1的跨膜区域)和ERG13(HMG-CoA合酶,3-羟甲基-戊二酸单酰辅酶A合酶)基因。基因tHMG1构建在启动子pGAL10下,基因ERG13构建在启动子pGAL1下。
质粒pXL144含有来源于三孢布拉霉Blakeslea trispora的carG(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶)、carB(八氢番茄红素脱氢酶)和carRA(双功能酶,八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶)三个基因。这三个基因经过密码子优化后进行基因合成,序列如SEQ IDNO.9-11所示。基因carG构建在启动子pGAL1下,基因carB构建在启动子pGAL10下,基因carRA构建在启动子pGAL7下。
具体构建方法如下:
上述四个质粒均采用DNA assembler方法进行组装。
(1)质粒pXL141的构建
以酿酒酵母INVSC1基因组为模板,用引物p424TRP1-GAL7-F和tADH1-GAL7-R PCR扩增得到用于敲除GAL1、GAL7和GAL10基因的同源左臂(GAL75’同源臂),用引物GAL7-tADH1-F和tADH1-R PCR扩增得到终止子tADH1,用引物tADH1-ERG12-F和pGAL7-tGAL10-ERG12-R PCR扩增得到基因ERG12,用引物pGAL7-tGAL10-F和pGAL7-tGAL10-R PCR扩增得到启动子pGAL7和终止子tGAL10;用引物pGAL7-tGAL10-tHMG1-F和pGAL10-pGAL1-tHMG1-RPCR扩增得到基因tHMG1,用引物pGAL10-pGAL1-F和pGAL10-pGAL1-R PCR扩增得到pGAL10和pGAL1双向启动子,用引物pGAL10-pGAL1-ERG8-F和tCYC1-TRP1-ERG8-R PCR扩增得到基因ERG8,用引物tCYC1-TRP1-GAL1-F和p424TRP1-GAL1-R PCR扩增得到用于敲除GAL1、GAL7和GAL10基因的同源右臂(GAL13’同源臂);以p424GAL1载体(购自ATCC)为模板,用引物ERG8-tCYC1-TRP1-F和GAL1-tCYC1-TRP1-R PCR扩增得到终止子tCYC1和色氨酸筛选标记TRP1;以p416GAL1载体(购自ATCC)为模板,用引物GAL1-p424TRP1-F和GAL7-p424TRP1-R PCR扩增得到质粒骨架。分别取200ng各PCR片段和200ng质粒骨架片段混合,总体积计为V,添加10%总体积的3M乙酸钠和2%总体积的10mg/mL的糖元,混匀后添加两倍总体积的无水乙醇,-80度冰箱放置2小时。13200rpm离心20分钟后去上清,剩余沉淀冷冻干燥后加入5μL水溶解沉淀DNA。随后将5μL DNA全部转化酿酒酵母INVSC1。用酵母质粒提取试剂盒(购自上海天根)从酿酒酵母中提取质粒,并转化大肠杆菌XL1-blue,用于富集构建的质粒。再用质粒小量提取试剂盒(Axygen)从大肠杆菌中提取质粒,通过酶切验证载体的正确性。质粒pXL141构建示意图如图7所示,其中,基因ERG12的启动子为pGAL7,基因tHMG1的启动子为pGAL10,基因ERG8的启动子为pGAL1。pXL141序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.12所示。
构建质粒pXL141所用引物的序列见表4:
表4
(2)质粒pXL142的构建
以酿酒酵母INVSC1基因组为模板,用引物p425LEU2-GAL80-F和tADH1-GAL80-RPCR扩增得到用于敲除GAL80基因的同源左臂(GAL805’同源臂),用引物GAL80-tADH1-F和tADH1-R PCR扩增得到终止子tADH1,用引物tADH1-MVD1-F和pGAL7-tGAL10-MVD1-R PCR扩增得到基因MVD1,用引物pGAL7-tGAL10-F和pGAL7-tGAL10-R PCR扩增得到启动子pGAL7和终止子tGAL10;用引物pGAL7-tGAL10-ERG10-F和pGAL10-pGAL1-ERG10-R PCR扩增得到基因ERG10,用引物pGAL10-pGAL1-F和pGAL10-pGAL1-R PCR扩增得到pGAL10和pGAL1双向启动子,用引物pGAL10-pGAL1-IDI1-F和tCYC1-LEU2-IDI1-R PCR扩增得到基因IDI1,用引物tCYC1-LEU2-GAL80-F和p425LEU2-GAL80-R PCR扩增得到用于敲除GAL80基因的同源右臂(GAL803’同源臂);以p425GAL1载体(购自ATCC)为模板,用引物IDI1-tCYC1-LEU2-F和GAL80-tCYC1-LEU2-R扩增得到终止子tCYC1和亮氨酸筛选标记LEU2;以p416GAL1载体为模板,用引物GAL80-p425LEU2-F和GAL80-p425LEU2-R PCR扩增得到质粒骨架。质粒pXL142构建过程同质粒pXL141构建方法,其构建示意图如图9所示,基因MVD1的启动子为pGAL7,基因ERG10的启动子为pGAL10,基因IDI1的启动子为pGAL1。pXL142序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.13所示。
构建质粒pXL142所用引物的序列见表5:
表5
(3)质粒pXL143的构建
以酿酒酵母INVSC1基因组为模板,用引物p423HIS3-pERG9-F和tADH1-pERG9-RPCR扩增得到用于替换ERG9基因启动子的同源左臂(pERG95’同源臂),用引物pERG9-tADH1-F和tADH1-R PCR扩增得到终止子tADH1,用引物tADH1-tHMG1-F和pGAL10-pGAL1-tHMG1-RPCR扩增得到基因tHMG1(第二个拷贝),用引物pGAL10-pGAL1-F和pGAL10-pGAL1-R PCR扩增得到pGAL10和pGAL1双向启动子,用引物pGAL10-pGAL1-ERG13-F和tCYC1-HIS3-ERG13-RPCR扩增得到基因ERG13,用引物tCYC1-HIS3-pCTR3-F和pERG9-pCTR3-R PCR扩增得到用于替换ERG9基因启动子的pCTR3启动子,用引物pCTR3-pERG9-F和p423HIS3-pERG9-R PCR扩增得到用于替换ERG9基因启动子的同源右臂(pERG93’同源臂);以p423GAL1载体(购自ATCC)为模板,用引物ERG13-tCYC1-HIS3-F和pCTR3-tCYC1-HIS3-R PCR扩增得到终止子tCYC1和组氨酸筛选标记HIS3;以p416GAL1载体为模板,用引物pERG9-p423HIS3-F和pERG9-p423HIS3-R PCR扩增得到质粒骨架。质粒pXL143构建过程同质粒pXL141构建方法,其构建示意图如图11所示,基因tHMG1(第二个拷贝)的启动子为pGAL10,基因ERG13的启动子为pGAL1。pXL143序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.14所示。
构建质粒pXL143所用引物的序列见表6:
表6
(4)质粒pXL144的构建
以酿酒酵母INVSC1基因组为模板,用引物p426URA3-HIS3-F和tADH1-HIS3-R PCR扩增得到基因HIS3同源左臂(HIS35’同源臂),用引物HIS3-tADH1-F和carRA-tADH1-R PCR扩增得到终止子tADH1,用引物carRA-pGAL7-tGAL10-F和carB-pGAL7-tGAL10-R PCR扩增得到启动子pGAL7和终止子tGAL10,用引物carB-pGAL10-pGAL1-F和carG-pGAL10-pGAL1-RPCR扩增得到pGAL10和pGAL1双向启动子,用引物URA3-HIS3-F和p426URA-HIS3-R PCR扩增得到基因HIS3同源右臂(HIS33’同源臂);以密码子优化后合成的基因carRA为模板,用引物tADH1-carRA-F和pGAL7-tGAL10-carRA-R PCR扩增得到基因carRA;以密码子优化后合成的基因carB为模板,用引物pGAL7-tGAL10-carB-F和pGAL10-pGAL1-carB-R PCR扩增得到基因carB;以密码子优化后合成的基因carG为模板,用引物pGAL10-pGAL1-carG-F和tCYC1-URA3-carG-R PCR扩增得到基因carG;以p426GAL1载体(购自ATCC)为模板,用引物carG-tCYC1-URA3-F和HIS3-tCYC1-URA3-R PCR扩增得到终止子tCYC1和尿嘧啶筛选标记URA3,用引物HIS3-p426URA3-F和HIS3-p426URA-R PCR扩增得到质粒骨架。质粒pXL144构建过程同质粒pXL141构建方法,基因carG的启动子为pGAL1,基因carB的启动子为pGAL10,基因carRA的启动子为pGAL7。其构建示意图如图13所示,pXL144序列(不含骨架载体序列)如SEQ IDNO.15所示。
构建质粒pXL144所用引物的序列见表7:
表7
实施例5β-胡萝卜素产生菌株的构建
将质粒pXL141用XhoI酶切后转化酿酒酵母CEN.PK2-1C,根据同源重组整合于染色体上。由于在酿酒酵母中GAL1、GAL7和GAL10成簇存在,pXL141的整合位点为GAL1、GAL7和GAL10。携带ERG12、tHMG1和ERG8基因的片段同源重组后替换掉CEN.PK2-1C基因组上GAL1、GAL7和GAL10三个基因,筛选标记为色氨酸TRP1。质粒染色体整合示意图如图8所示。提取构建菌株的染色体DNA,通过引物ERG8-tCYC1-TRP1-F和GAL1-tCYC1-TRP1-R(扩增得到终止子tCYC1和色氨酸筛选标记TRP1,为本片段特有序列)PCR验证正确的菌株命名为XL151。
将质粒pXL142用XhoI酶切后转化酿酒酵母XL151,整合位点为GAL80基因。携带MVD1、ERG10和IDI1基因的片段同源重组后替换掉XL151基因组上GAL80基因,筛选标记为LEU2。质粒染色体整合示意图如图10所示。提取构建菌株的染色体DNA,通过引物IDI1-tCYC1-LEU2-F和GAL80-tCYC1-LEU2-R(扩增得到终止子tCYC1和亮氨酸筛选标记LEU2,为本片段特有序列)PCR验证正确的菌株命名为XL152。
将质粒pXL143用NcoI酶切后转化酿酒酵母XL152,整合位点为ERG9基因的启动子部分。携带tHMG1、ERG13基因和pCTR3启动子的片段同源重组后替换掉XL152基因组上ERG9基因的启动子部分,筛选标记为HIS3。质粒染色体整合示意图如图12所示。提取构建菌株的染色体DNA,通过引物ERG13-tCYC1-HIS3-F和pCTR3-tCYC1-HIS3-R(扩增得到终止子tCYC1和组氨酸筛选标记HIS3,为本片段特有序列)PCR验证正确的菌株命名为XL153。
最后将质粒pXL144转化菌株XL153,获得菌株XL154。该菌株通过染色体整合超表达了甲羟戊酸途径所有基因和通过转入载体外源引入了β-胡萝卜素合成途径的相关基因。构建菌株的详细信息如下:酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组上的GAL1、GAL7和GAL10基因被ERG12、tHMG1和ERG8基因替换掉;GAL80基因被MVD1、ERG10和IDI1基因替换掉;ERG9基因的启动子被tHMG1、ERG13基因和pCTR3启动子替换掉;且含有能表达来源于三孢布拉霉Blakeslea trispora的carG、carB和carRA基因的真核表达质粒。其中,基因ERG8、IDI1、ERG13和carG构建在启动子pGAL1下,基因ERG12、MVD1和carRA构建在启动子pGAL7下,基因ERG10、tHMG1(两个拷贝)和carB构建在启动子pGAL1下。
实施例6SC-URA培养基中摇瓶发酵生产β-胡萝卜素
摇瓶发酵采用两级种子预培养,然后接种至发酵培养基中进行发酵培养。首先从平板上挑取实施例5得到的XL154菌株单菌落5-6个至10mL SC-URA培养基中(培养基含有2%浓度的葡萄糖),30℃、220rpm培养。待菌体生长至指数中后期,将10mL培养液全部转接至100mL SC-URA培养基中(培养基含有2%浓度的葡萄糖),30℃、220rpm培养。待菌体生长至指数中后期,接种至四种200mL SC-URA发酵培养基中(分别为含2%浓度的葡萄糖,含2%浓度的葡萄糖和0.2%浓度的半乳糖,含2%浓度的葡萄糖和0.5%浓度的半乳糖,含2%浓度的葡萄糖和1%浓度的半乳糖),计算接种量使得发酵培养基初始OD600为0.2(根据测得所接种菌液OD600值进行计算,接种mL数=200*0.2/菌液OD600),开始摇瓶发酵。每6小时左右取样2mL发酵液测OD600值;每12小时左右取样2mL左右发酵液测β-胡萝卜素合成量,2mL发酵液4000g离心3分钟后弃上清,细胞沉淀保存于-40℃冰箱直至进一步进行β-胡萝卜素产量分析。
对于产品萃取,取-40℃冰箱保存的样品,解冻后加入0.2g玻璃珠、1mL提取液(甲醇:丙酮=1:4(v/v),0.5%抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚)。涡旋振荡3分钟,在4℃下12000rpm离心2分钟,转移上清至10mL离心管中。随后再加入1mL提取液进行萃取。萃取过程重复6次至提取液中没有明显颜色。收集6次萃取的提取液,12000rpm离心后进行HPLC分析。胡萝卜素的检测使用四元HPLC进行的,色谱柱是Xterra-C18柱,柱温25度,流动相是乙腈和水,流速1mL/min,检测器是紫外检测器,β-胡萝卜素的吸收波长448nm,番茄红素的吸收波长是472nm。整个分析过程均在暗环境下进行以减少β-胡萝卜素降解。工程菌株在含有2%浓度的葡萄糖和不同浓度(分别为0%、0.2%、0.5%、1.0%)的半乳糖培养基中生产β-胡萝卜素的结果如图14所示。由于番茄红素为β-胡萝卜素合成的前一步反应,所以菌株在合成产物β-胡萝卜素的同时可以积累一定量的番茄红素。工程菌株在含有2%浓度葡萄糖(不含半乳糖)的培养基中生产番茄红素和β-胡萝卜素的结果如图15所示。
同时以酿酒酵母CEN.PK2-1C作为对照,按上述方法进行发酵,检测β-胡萝卜素产量。
结论:
(1)初始菌株CEN.PK2-1C中未检测到β-胡萝卜素的合成,构建的工程菌株XL154可以成功合成β-胡萝卜素,证明外源导入的来源于三孢布拉霉的β-胡萝卜素合成途径是有活性的。
(2)添加半乳糖后,菌株的产量没有增加,反而略有下降,说明构建的菌株完全不需要再添加半乳糖做诱导剂。
(3)XL154菌株发酵59h时在产生45mg/Lβ-胡萝卜素的同时可以积累29mg/L番茄红素。
实施例7YPD、YPDG和YPDE培养基中摇瓶发酵生产β-胡萝卜素
本实施例探索了碳源葡萄糖、甘油和乙醇对β-胡萝卜素合成的影响。摇瓶发酵也采用两级种子预培养,然后接种至发酵培养基中进行发酵培养。首先从平板上挑取XL154菌株单菌落5-6个至10mL SC-URA培养基中(培养基含有2%浓度的葡萄糖),30℃、220rpm培养。待菌体生长至指数中后期,将10mL培养液全部转接至100mL SC-URA培养基中(培养基含有2%浓度的葡萄糖),30℃、220rpm培养。待菌体生长至指数中后期,接种至200mL发酵培养基中,发酵培养基分别为YPD(2%蛋白胨,1%酵母提取物,2%葡萄糖)、YPDG(2%蛋白胨,1%酵母提取物,1%葡萄糖,1%甘油)和YPDE(2%蛋白胨,1%酵母提取物,1%葡萄糖,1%乙醇)三种培养基。计算接种量使得发酵培养基初始OD600为.2(根据测得所接种菌液OD600值进行计算,接种mL数=200*0.2/菌液OD600),开始摇瓶发酵。每6小时左右取样2mL测OD600值,在60小时左右取样2mL测β-胡萝卜素合成量。测量方法如实施例6中所示。生产β-胡萝卜素的结果如图16所示。
结论:
(1)相比于葡萄糖和甘油,乙醇作为碳源时可以明显促进β-胡萝卜素的合成。
(2)XL154菌株在YPDE培养基中发酵60h时可以产生64mg/Lβ-胡萝卜素,同时可以积累85mg/L番茄红素。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株,其特征在于:其基因组上的GAL1、GAL7和GAL10基因被ERG12、tHMG1和ERG8基因替换掉;GAL80基因被MVD1、ERG10和IDI1基因替换掉;ERG9基因的启动子被tHMG1、ERG13基因和pCTR3启动子替换掉;且含有能表达carG、carB和carRA基因的真核表达质粒;所述各基因均构建在半乳糖诱导的启动子下;
所述的半乳糖诱导的启动子为pGAL1、pGAL7或pGAL10;
所述的酵母菌株为酿酒酵母CEN.PK2-1C;
所述的ERG12、tHMG1、ERG8、MVD1、ERG10、IDI1和ERG13基因来源于酿酒酵母INVSC1;
所述的carG、carB和carRA基因来源于三孢布拉霉,经过密码子优化,序列如SEQ IDNO.9-11所示。
2.根据权利要求1所述的生产β-胡萝卜素的酵母菌株,其特征在于:通过包含如下步骤的方法制备得到:
(1)将以p416GAL1为骨架载体,包含ERG12、tHMG1、ERG8、TRP1基因和pGAL7、pGAL10、pGAL1启动子,序列如SEQ ID NO.12所示的pXL141质粒用XhoI酶切后转化酿酒酵母CEN.PK2-1C,以色氨酸TRP1为筛选标记,筛选到携带所述基因和启动子的片段同源重组后替换掉CEN.PK2-1C基因组上GAL1、GAL7和GAL10基因的菌株XL151;
(2)将以p416GAL1为骨架载体,包含MVD1、ERG10、IDI1、LEU2基因和pGAL7、pGAL10、pGAL1启动子,序列如SEQ ID NO.13所示的pXL142质粒用XhoI酶切后转化步骤(1)得到的菌株XL151,以亮氨酸LEU2为筛选标记,筛选到携带所述基因和启动子的片段同源重组后替换掉XL151基因组上GAL80基因的菌株XL152;
(3)将以p416GAL1为骨架载体,包含tHMG1、ERG13、HIS3基因和pGAL10、pGAL1、pCTR3启动子,序列如SEQ ID NO.14所示的pXL143质粒用NcoI酶切后转化步骤(2)得到的菌株XL152,以组氨酸HIS3为筛选标记,筛选到携带所述基因和启动子的片段同源重组后替换掉XL152基因组上ERG9基因启动子的菌株XL153;
(4)往菌株XL153中转入能表达carG、carB和carRA基因的真核表达质粒得到生产β-胡萝卜素的酵母菌株。
3.根据权利要求2所述的生产β-胡萝卜素的酵母菌株,其特征在于:步骤(4)为:
将以p426GAL1为骨架载体,包含carG、carB、carRA、URA3基因和pGAL7、pGAL10、pGAL1启动子,序列如SEQ ID NO.15所示的pXL144质粒转化步骤(3)得到的菌株XL153,以尿嘧啶URA3为筛选标记,筛选得到菌株XL154,XL154即为生产β-胡萝卜素的酵母菌株。
4.权利要求1-3任一项所述的酵母菌株在生产β-胡萝卜素和/或番茄红素中的应用。
5.一种利用权利要求1-3任一项所述的酵母菌株生产β-胡萝卜素和/或番茄红素的方法,其特征在于包含如下步骤:将权利要求1-3任一项所述的酵母菌株接入含碳源的培养基中进行发酵得到β-胡萝卜素和/或番茄红素;所述的碳源为葡萄糖、甘油或乙醇。
6.根据权利要求5所述的的方法,其特征在于:所述的培养基为如下培养基中的一种:
SC-URA液体培养基:0.67%YNB,2%葡萄糖,缺尿嘧啶的氨基酸混合物;
YPD液体培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,2%葡萄糖;
YPDG液体培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,1%葡萄糖,1%甘油;
YPDE液体培养基:2%蛋白胨,1%酵母提取物,1%葡萄糖,1%乙醇。
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CN103243066A (zh) * | 2013-05-30 | 2013-08-14 | 武汉大学 | 一种生产番茄红素的菌株及其应用 |
CN103740633A (zh) * | 2014-01-22 | 2014-04-23 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株生产番茄红素的重组菌及其应用 |
CN104805167A (zh) * | 2014-01-26 | 2015-07-29 | 上海医药工业研究院 | 一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
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Metabolic engineering for production of beta-carotene and lycopene in Saccharomyces cerevisiae.;Yamano S等;《BiosciBiotechnol Biochem》;19941231;第58卷(第6期);1112-1114 * |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN105087408A (zh) | 2015-11-25 |
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