WO2022222213A1 - 一种产β-榄香烯工程菌及其构建方法和用途 - Google Patents

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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the recombinant bacteria express acetoacetyl-CoA thiolase atoB, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase ERG13, truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase tHMG1, mevalonate kinase ERG12, phosphomevalonate kinase ERG8, pyrophosphate mevalonate decarboxylase MVD1, pyrophosphate prenyl isomerase idi and farnesenyl pyrophosphate synthase ispA
  • the expression vector is pACYCDuet-1 vector.
  • Acetoacetyl-CoA thiolase atoB gene 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase ERG13 gene, truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase tHMG1 gene, mevalonate kinase ERG12 gene, phosphomevalonate kinase ERG8 gene, pyrophosphate mevalonate decarboxylase MVD1 gene, pyrophosphate prenyl isomerase idi gene and farnesenyl pyrophosphate synthase.
  • the enzyme ispA gene was linked to the pACYCDuet-1 vector, transformed into competent cells, positive clones were picked, and the recombinant plasmid pACYCDuet-FPP was extracted;
  • volume ratio of the organic solvent to the fermentation broth is 2:1 to 1:20.

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Abstract

提供了一种产β-榄香烯的重组菌，还提供了该重组菌的构建方法和利用该重组菌生产β-榄香烯的方法。该重组菌表达来自加拿大一枝黄花的吉玛烯A合酶(ScGAS)，并引入包含大肠杆菌的atoB、idi、ispA和酿酒酵母的ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1重组质粒，经过发酵条件优化，β-榄香烯产量达到156.94mg/L。

Description

一种产β-榄香烯工程菌及其构建方法和用途 技术领域
本发明涉及代谢工程、合成生物学和生物制药等技术领域，特别涉及一种产β-榄香烯菌株的构建方法及用途。
背景技术
以β-榄香烯(β-elemene)为主要成分的榄香烯类化合物，为国家Ⅱ类非细胞毒性抗肿瘤新药。β-榄香烯具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、转移和主动免疫保护等作用，临床上可以单独或与其他化疗药物联合用于治疗各种癌症，此外还具有抗氧化、抗菌、抗病毒、改善微循环等药效，因此具有良好医药价值和应用前景。
目前市场的β-榄香烯主要是从中药莪术中提取获得。该获取方法成本高、纯度低，而常规化学全合成方法的步骤繁琐、反应条件苛刻、得率低、环境不友好，限制了β-榄香烯的供给和应用。因此，寻找新的β-榄香烯经济可行的量产技术，对该类药物的推广应用具有重要意义。
合成生物学的发展，为规模化生产自然界中含量低、结构复杂、应用价值高的天然产物提供了新的方法。利用微生物生长速度快、周期短、成本低、遗传背景清楚有利于遗传改造等优点，通过构建重组细胞、异源重组天然产物的合成途径，已有快速、大量获取中间体和终产物的成功范例：在酿酒酵母中构建青蒿素的生物合成途径，其前体青蒿酸的产量达到25g/L(Paddon,C.J.,et al.Nature 496.7446(2013):528.)。
β-榄香烯是植物中比较常见的一类倍半萜类化合物，但目前尚无β-榄香烯合酶被克隆，β-榄香烯是由吉玛烯A经cope重排而来的，而吉玛烯A则是经吉玛烯A合酶催化底物法呢烯基焦磷酸FPP获得。研究开发一种快速、高产、环境友好的β-榄香烯的制备方法成为当前亟待研究的重要课题。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供了一种产β-榄香烯菌株及其构建方法。本发明通过构建产生倍半萜类化合物的前体法呢烯基焦磷酸(FPP)的重组质粒和构建来源于加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)的吉玛烯A合酶ScGAS重组质粒，获得含有上述重组质粒的大肠杆菌工程菌株，并通过优化温度、诱导剂浓度、诱导时间和诱导时菌液浓度，从而实现快速、高产地制备β-榄香烯。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种产β-榄香烯的重组菌，所述重组菌表达吉玛烯A合酶ScGAS、乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA。
进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.3所示，
进一步地，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、甲羟戊酸激酶ERG12的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，焦磷酸异戊烯脂异构酶idi的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、法呢烯基焦磷酸合酶ispA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步地，所述重组菌为重组大肠杆菌或重组酵母菌。
进一步地，所述吉玛烯A合酶ScGAS的表达载体为pGEX-4T1载体。
进一步地，所述重组菌表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的表达载体为pACYCDuet-1载体。
进一步地，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS1位点，所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的基因连接到pACYCDuet-1的MCS2位点。
本发明另一方面提供了上述产β-榄香烯的重组菌的构建方法，主要包括以下步骤：
(1)将吉玛烯A合酶ScGAS基因连接到pGEX-4T1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pGEX-4T1-ScGAS；
(2)将乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13 基因、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1基因、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi基因和法呢烯基焦磷酸合酶ispA基因连接到pACYCDuet-1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pACYCDuet-FPP；
(3)将步骤(1)所得的pGEX-4T1-ScGAS重组质粒和步骤(2)所得的pACYCDuet-FPP共同转化感受态细胞，挑取阳性克隆即得产β-榄香烯的重组菌株。
进一步地，步骤(3)中的感受态细胞为E.coil BL21(DE3)。
本发明提供了一种利用上述产β-榄香烯的重组菌生产β-榄香烯的方法，所述方法主要包括以下步骤：
(1)在转速50～300rpm，温度20～32℃的培养条件下，培养上述产β-榄香烯的重组菌，待重组菌液浓度A 600为0.2～2时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.01～1.0mM，继续培养至12-120h；
(2)使用有机溶剂萃取发酵液中的β-榄香烯，离心收集有机相，即得。
进一步地，所述培养的培养基为液体LB培养基。
进一步地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、己烷、石油醚或氯仿中的一种或2种以上的混合物。
进一步地，所述有机溶剂与发酵液的体积比2:1～1:20。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明构建的产β-榄香烯工程菌具备产量高、纯度高、低成本、无污染等特点,适于工业化生产β-榄香烯。
2.本发明的产β-榄香烯工程菌经发酵条件优化后β-榄香烯产量高达156.94mg/L。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1重组质粒pACYCDuet-FPP示意图。
图2重组菌株和β-榄香烯的产量对应图。
图3共同表达pGEX-4T1-ScGAS和pACYCDuet-FPP工程菌发酵条件正交实验组合中的β-榄香烯产量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见 地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
下述实施例中，采用的pGEX-4T1载体、pACYCDuet-1购自于上海生工生物有限公司，E.coli Trans-1和E.coil BL21(DE3)感受态细胞购自于上海源叶生物科技有限公司。
实施例1 重组质粒pGEX-4T1-ScGAS构建
依据NCBI数据库中加拿大一枝黄花来源的吉玛烯A合酶ScGAS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。由生工生物工程(上海)股份有限公司依据大肠杆菌密码子进行优化、合成基因和测序，获得密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，并***到pBlueScript II SK(+)载体中，构成pBlueScript II SK(+)-ScGAS重组质粒。
将pBlueScript II SK(+)-ScGAS重组质粒和pGEX-4T1质粒分别用EcoR I与Sal I进行双酶切后(20μl酶切总体系中，10×Quic.Cut Green Buffer 2μl，EcoR I与Sal I各1μl，质粒pBlueScript II SK(+)-ScGAS或pGEX-4T1各8μl，ddH 2O 8μl)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，连接入pGEX-4T1载体(10μl连接总体系中，Solution I 5μl，pGEX-4T1线性化载体1μl，ScGAS片段4μl，16℃反应3小时)，转化E.coli Trans-1感受态细胞，涂布含100mg/L的LB/Amp平板，37℃培养过夜，挑取转化子进行菌落PCR验证(20μlPCR体系中，10×ExTaq Buffer 2μl，dNTP 2μl，ScGAS-F和ScGAS-R各1μl，菌液1μl，ExTaq酶0.3μl，ddH 2O 12.7μl；PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min，32个循环；最后72℃再延伸15min；引物序列见表1)，提取阳性菌落的质粒即pGEX-4T1-ScGAS重组质粒。
表1.引物序列表
Figure PCTCN2021094795-appb-000001
Figure PCTCN2021094795-appb-000002
实施例2 重组质粒pACYCDuet-FPP构建
2.1基因全长序列的获得
提取大肠杆菌Trans-1和酿酒酵母S288C全基因组序列。依据NCBI上公布的atoB、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1、idi、ispA基因序列设计引物(7-22号引物，序列见表1)，以上述大肠杆菌基因组DNA为模板扩增atoB、idi、ispA，以酵母基因组DNA为模板扩增ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1，使用高保真酶PrimeSTAR GXL(Takara)进行扩增(50μlPCR体系中，5×PrimeSTAR Buffer 10μl，dNTP 4μl，引物-F和引物-R各1μl，模板1μl，PrimeSTAR酶0.5μl，ddH 2O 32.5μl；PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，32个循环；最后，68℃再延伸15min)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回 收后，回收产物使用ExTaq酶进行加A尾反应，与pMD18-T载体连接后，转化E.coli Trans-1感受态细胞，涂布含100mg/L的LB/Amp平板，37℃培养过夜，挑取转化子进行菌落PCR验证，阳性克隆送上海生工生物有限公司进行测序，测序正确的菌落，提取质粒后可作为后续载体构建的模板。
2.2利用重叠PCR原理构建操纵子A和B
操纵子A中包含基因atoB、ERG13、tHMG1，操纵子B中包含基因ERG12、ERG8、MVD1、idi、ispA。分别以步骤2.1中含有atoB、ERG13、tHMG1质粒为模板，用高保真酶PrimeSTAR GXL进行PCR扩增，使用各自基因正反向引物(23-28号引物，序列见表1)，进行第一轮PCR反应，分别扩增上述3个基因(PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，15个循环；最后，68℃再延伸15min)，然后以上述PCR产物各1μl为模板，使用23号和28号引物，进行第二轮PCR反应(PCR反应条件首先98℃变性5min；其次98℃变性10sec，55-60℃退火5sec，68℃延伸1-2min，32个循环；最后，68℃再延伸15min)，跑1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收后，即为操纵子A。操纵子B的构建过程类似操纵子A，仅使用不同引物扩增不同基因，第一轮PCR使用29-38号引物分别扩增ERG12、ERG8、MVD1、idi、ispA基因，第二轮使用29号和38号引物。
2.3使用OK Clon DNA连接试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)具体操作方法见试剂盒说明书，将操纵子A同源重组到pACYCDuet-1载体的多克隆位点1(MCS2)的Sal I位点，将操纵子B同源重组到pACYCDuet-1载体的多克隆位点2的Xho I位点，即获得pACYCDuet-FPP重组质粒。
实施例3 高产β-榄香烯工程菌的构建
3.1用质粒pGEX-4T1或pGEX-4T1-ScGAS与pACYCDuet-1或pACYCDuet-FPP共同转化E.coil BL21(DE3)感受态，涂布LB/Amp&Cm抗性平板，过夜培养后，挑取单克隆使用pGEX-4T1载体上的通用引物M13-F&M13-R和pACYCDuet-1载体上的通用引物Cm-F&Cm-R(3-6号引物，序列见表1)进行菌落PCR鉴定，阳性克隆即分别为pGEX-4T1/pACYCDuet-FPP/BL21、pGEX-4T1-ScGAS/pACYCDuet-FPP/BL21、pGEX-4T1-ScGAS/pACYCDuet-1/BL21、pGEX-4T1/pACYCDuet-1/BL21重组菌株。
3.2上述步骤3.1获得的4种重组菌株分别接种到至含Amp&Cm抗生素的2mL液体LB培养基中，37℃恒温震荡培养箱中180rpm过夜培养。第二天以1：50的比例扩 接至50mL含Amp&Cm抗生素的液体LB培养基中，37℃恒温震荡培养箱中继续培养至菌液浓度A600约为2，加入10μL浓度为0.5M的IPTG及10ml的正十二烷溶液，28℃恒温震荡培养箱内，180rpm培养48h。将发酵液冷却至室温，等体积分装至3个50mL离心管内，再在每个离心管内加入20mL乙酸乙酯，用封口膜封口震荡混匀抽提，并超声5分钟；室温下12000rpm离心10min，收集上清液至圆底烧瓶；在28℃，50rpm的旋转蒸发仪上旋至无乙酸乙酯，收集正十二烷；加入适量无水Na 2SO 4去除有机相内水分，再次离心收集上清，即为发酵产物。
3.3将步骤3.2发酵产物用0.22μm有机滤膜过滤，并用乙酸乙酯稀释200倍，加入终浓度为20mg/L乙酸壬酯为内参，样品使用GC-MS检测，通过β-榄香烯与内参的峰面积比值，计算β-榄香烯的含量(如图2所示)。GC-MS检测条件：石英毛细管柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：80℃，停留3min；10℃/min升至210℃，停留1min。载气：高纯氦气，流量设置为1mL/min；进样口及接口温度分别设置为250℃与280℃；进样量1μL；离子源EI；电子能量70eV；离子源温度250℃；扫描质量范围35～550amu；溶剂延迟6.5min。
结果表明，只表达pGEX-4T1-ScGAS的重组菌中β-榄香烯的产量为49.21mg/L(图2，ScGAS B)，而共同表达pGEX-4T1-ScGAS和pACYCDuet-FPP的重组菌中β-榄香烯的产量为146.88mg/L(图2，ScGAS D)，产量提高了2.98倍。因此，共同表达pGEX-4T1-ScGAS和pACYCDuet-FPP的重组菌可作为β-榄香烯的量产的工程菌株。
实施例4 高产β-榄香烯工程菌的发酵条件优化
活化步骤3.1中获得的pGEX-4T1-ScGAS/pACYCDuet-FPP/BL21工程菌进行发酵条件优化。影响发酵产物产量的主因素包括IPTG添加时菌的浓度、培养温度、IPTG使用浓度及诱导时长，分别选择3个不同的实验条件(如表2所示)设计L 9(3 4)正交实验表(如表3所示)，并使用正交实验的极差分析法分析4个因素对β-榄香烯产量的影响。按照方法3.2制备待检测样，使用3.3方法检测样品中β-榄香烯的含量变化，并计算和评估各因素对β-榄香烯产量的影响。
通过正交实验的极差分析法确定的各因素对β-榄香烯产量的主次关系结果如表4所示，不同发酵条件下，β-榄香烯产量如图3所示，最终确定发酵条件为重组菌的A600为0.5时添加IPTG，IPTG的终浓度为0.1mM，在28℃摇瓶发酵72h时，β-榄香烯的产量达到156.94mg/L。
表2.正交因素水平
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表3.正交实验条件
Figure PCTCN2021094795-appb-000004
表4.β-榄香烯的产量与各因素的关系表
Figure PCTCN2021094795-appb-000005
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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Claims (10)

  1. 一种产β-榄香烯的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达吉玛烯A合酶ScGAS、乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA。
  2. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述吉玛烯A合酶ScGAS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
  3. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述吉玛烯A合酶ScGAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或如SEQ ID NO.3所示，乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、甲羟戊酸激酶ERG12的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，焦磷酸异戊烯脂异构酶idi的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示、法呢烯基焦磷酸合酶ispA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
  4. 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述吉玛烯A合酶ScGAS的表达载体为pGEX-4T1载体；所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的表达载体为pACYCDuet-1载体。
  5. 根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS1，所述甲羟戊酸激酶ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi和法呢烯基焦磷酸合酶ispA的基因连接到pACYCDuet-1的多克隆位点MCS2。
  6. 权利要求4或5所述的重组菌的构建方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
    (1)将吉玛烯A合酶ScGAS基因连接到pGEX-4T1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pGEX-4T1-ScGAS；
    (2)将乙酰乙酰辅酶A硫解酶atoB基因、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶ERG13 基因、截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1基因、甲羟戊酸激酶ERG12基因、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶MVD1基因、焦磷酸异戊烯脂异构酶idi基因和法呢烯基焦磷酸合酶ispA基因连接到pACYCDuet-1载体中，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒pACYCDuet-FPP；
    (3)将步骤(1)所得的pGEX-4T1-ScGAS重组质粒和步骤(2)所得的pACYCDuet-FPP共同转化感受态细胞，挑取阳性克隆即得产β-榄香烯的重组菌株。
  7. 根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的感受态细胞为E.coil BL21(DE3)。
  8. 利用权利要求1-5任一项所述的重组菌生产β-榄香烯的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
    (1)在转速50～300rpm，温度20～32℃的培养条件下，培养权利要求1-5任一项所述的重组菌，待重组菌液浓度A 600为0.2～2时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.01～1.0mM，继续培养至12-120h；
    (2)使用有机溶剂萃取发酵液中的β-榄香烯，离心收集有机相，即得。
  9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的培养基为液体LB培养基。
  10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯、己烷、石油醚或氯仿中的一种或2种以上的混合物，所述有机溶剂与发酵液的体积比2:1～1:20。
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