CN108753699B - 一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法 - Google Patents

一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108753699B
CN108753699B CN201810632505.8A CN201810632505A CN108753699B CN 108753699 B CN108753699 B CN 108753699B CN 201810632505 A CN201810632505 A CN 201810632505A CN 108753699 B CN108753699 B CN 108753699B
Authority
CN
China
Prior art keywords
zea
lysophosphatidylcholine
lpc
porcine
oocytes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810632505.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108753699A (zh
Inventor
李兰
刘雪莲
李娜
沈伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Agricultural University
Original Assignee
Qingdao Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Agricultural University filed Critical Qingdao Agricultural University
Priority to CN201810632505.8A priority Critical patent/CN108753699B/zh
Publication of CN108753699A publication Critical patent/CN108753699A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108753699B publication Critical patent/CN108753699B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及涉及一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法，主要是在猪***体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱，所添加的溶血磷脂酰胆碱工作液浓度为10μg/mL，现配现用，每1mL猪***体外成熟培养液中加入0.2μL。本发明发现在体外成熟培养液中加入LPC，可以显著提高遭受ZEA毒害的猪***成熟率，并能显著提高猪***孤雌激活率和促进早期孤雌胚胎卵裂，本发明同时首次给出完整的在猪***体外培养中通过添加LPC挽救ZEA毒害的操作步骤。本发明证实了LPC的确对ZEA的毒性有对抗作用，为研究ZEA脱毒的方法提供了与现有技术完全不同的一个研究方向。

Description

一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法
技术领域
本发明涉及生殖生物学和发育生物学领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮(ZEA)是由禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、雪腐镰刀菌等菌种产生的一种非甾体霉菌毒素。主要存在于易受真菌污染的玉米、小麦、高粱、燕麦等谷物中，且是世界上污染范围最广的一种霉菌毒素。由于我国多数地区，雨量充沛，相对湿度较高，谷物和动物饲料更易受到霉菌毒素污染。研究表明，ZEA具有类***效应，在C8位上的酮基易被还原，生成α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)，它们也都有类***活性，α-ZOL的类***活性是ZEA的3倍，而β-ZOL的类***活性与ZEA相似，ZEA及其代谢物能引起动物流产、死胎和返情等生殖机能异常，还可以导致生长下降、免疫抑制、不育和畸形等。猪相比其它家养动物而言对ZEA更为敏感，归其原因有以下几点：1)ZEA本身的化合物结构稳定性比较强，不能通过粮食加工或饲料加工将其降解；2)ZEA虽为非类固醇化合物，但它的类雌激活性可以使它竞争的结合到两种类型的***受体，同时ZEA及其代谢产物还是参与甾类代谢相关各种酶的底物；3)肝微粒体的实验结果表明，α-ZOL和β-ZOL之间存在着相互转化，且这种转化比率存在着物种的差异性，研究表明猪和人类对α-ZOL的转化率较高，与ZEA相比α-ZOL与17-β-***的亲和力更强；4)ZEA及其代谢产物可以通过糖脂化作用排出体外，但是研究表明猪体内糖脂化的能力较低，这就意味着将会有更多的ZEA或ZEA代谢物停留在猪体内；5)ZEA代谢主要发生在肠道和肝脏中，有部分ZEA及其代谢产物会随着尿液和胆汁排出体外，但是还有一部分ZEA及其代谢产物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶的作用下与葡萄糖醛酸结合形成共轭化合物，经胆汁***后在肠道菌群的作用下发生还原反应，又经肠道黏膜细胞的重吸收再次进入肝脏，这样就构成不断循环的肝-肠循环。因此增加了ZEA及其代谢产物在体内的驻留时间，进一步增加其毒副作用。
目前对于ZEA脱毒方法主要分为三种，第一种是物理法，利用高温、辐射处理杀死菌株并降解ZEA。此外，利用各种吸附剂吸附ZEA也能达到脱毒效果；第二种是化学法，利用化学试剂(碱和氧化剂)降解ZEA；第三种是生物法，利用微生物产生的酶(内酯水解酶、蛋白酶和过氧化物酶)降解ZEA。但这些方法都不够完善，或是成本较高，或是效果较差。
作为生命早期的形式，***的发育过程往往更容易受到ZEA的毒害。如果能找到更多途径挽救***发育过程中受到的ZEA毒害，就能为进一步开辟ZEA脱毒方法找到值得深入研究的方向。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法，目的在于提供一种与现有ZEA脱毒方法都不同的挽救ZEA对猪***体外发育的毒害的方法。
本发明的玉米赤霉烯酮(ZEA)对猪***体外发育危害的挽救方法，其特征在于，在猪***体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱(LPC)。
进一步，所述在猪***体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱的方法包括如下步骤：
1)配制溶血磷脂酰胆碱浓储液：将溶血磷脂酰胆碱溶解于M199培养基中，配制浓度为50mg/mL，溶解后于-20℃保存备用；
2)配制溶血磷脂酰胆碱工作液：将步骤1)所述溶血磷脂酰胆碱浓储液自然融化后用M199培养基稀释5000倍，稀释后浓度为10μg/mL，现配现用；
3)配制猪***体外成熟培养液：每10mL猪***体外成熟培养液包含的组分为FSH 1mg/mL、LH 200IU/mL、EGF 10ng/mL、L-半胱氨酸3.05mM、猪***1mL、余量为M199培养基，混匀用0.22μm过滤器过滤分装到1.5mL离心管中，每管分装1mL，现配现用；
4)加入溶血磷脂酰胆碱：在步骤3)所得离心管中加入步骤2)所得溶血磷脂酰胆碱工作液，每管加入0.2μL。
优选地，所述溶血磷脂酰胆碱(LPC)为粉剂，购自Sigma公司，批号为L5254。
本发明的有益效果如下：
1、首次提出利用LPC来对抗ZEA的毒性：本发明另辟蹊径发现LPC能够对抗ZEA的毒害作用。目前没有任何文献和技术探究LPC能否对遭受ZEA损害的***体外发育具有挽救效应。本发明经过大量试验发现，在猪***体外培养过程中，如果在体外成熟培养液中加入LPC，可以显著提高遭受ZEA毒害的猪***成熟率，并且在后期的孤雌激活和早期孤雌胚胎发育中，能显著提高猪***孤雌激活率和促进早期孤雌胚胎卵裂，说明LPC的确对ZEA的毒性有对抗作用，为研究ZEA脱毒的方法提供了与现有技术完全不同的一个研究方向。
2、首次给出完整的在猪***体外培养中通过添加LPC挽救ZEA毒害的操作步骤：本发明经过大量试验，最终确定了在猪***体外成熟培养液中添加浓度为10μg/mL的LPC，添加量为每1mL猪***体外成熟培养液中添加0.2μL，并给出了LPC浓储液、LPC工作液的配制方法。
3、操作简单，便于扩展深入研究：本发明的方法操作简单，只是在常规的动物***体外成熟培养操作过程中，在体外成熟培养液中加入一定量的LPC，即可观察到显著的对ZEA毒害的挽救作用，挽救了有ZEA毒害的试验用猪的***，不至于完全浪费、或者由于ZEA因素导致试验效果不理想，同时也便于科研人员设计进一步试验验证LPC对ZEA的脱毒作用。
附图说明
图1为实施例1的猪卵丘-***体外成熟培养42h的显微镜观察图
图2为实施例1的猪***体外成熟培养22h和42h免疫荧光染色图
图3为实施例2的体外成熟的猪***孤雌激活免疫荧光染色图
图4为实施例3的孤雌早期胚胎的显微镜观察图
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但是本发明的技术方案不以实施例为限。
实施例1：LPC对被ZEA毒害的猪卵丘-***体外成熟培养挽救效果试验
本实验中所用到的主要试剂：玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA，32935)购自Sigma公司，溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,LPC，L5254)够自Sigma公司，二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，D8371)购自北京索莱宝科技公司，M199培养基(Medium，11150067)购自Gibco公司。
猪***配制：用20mL注射器抽取卵巢直径>6mm有腔卵泡，将***置于50mL进口离心管中，尽量一次多收集一些，3000rpm离心15分钟保留上清液，然后将上清液依次用0.45和0.22过滤器过滤，分装到1.5mL离心管，-20℃保存。
洗液配制：用无菌超纯水配制500mL猪卵巢清洗液，需要的成分为：氯化钙二水化合物150mg、氯化钾118mg、氯化镁六水化合物50mg、磷酸二氢钠24mg、Nalactic Acia 705μL、氯化钠3330mg、碳酸氢钠84mg、HEPES1190mg、丙酮酸钠500μL、聚乙烯醇500mg、青霉素-链霉素500μL、酚红适量，PH：7.2-7.4，最后用无菌超纯水定容至500mL，过滤分装，4℃保存。
ZEA工作液配制：ZEA的工作液浓度为10μM。用DMSO配制ZEA的浓储液(20000μM)，溶解后避光-20℃保存，每次使用时将浓储液按相应工作液浓度进行稀释2000倍。
LPC浓储液配制：将LPC溶解于M199培养基中，配制浓度为50mg/mL，溶解后于-20℃保存备用。
LPC工作液配制：将上述LPC浓储液自然融化后用M199培养基稀释5000倍，稀释后浓度为10μg/mL，现配现用。
猪***体外成熟培养液配制：每10mL猪***体外成熟培养液包含的组分为FSH 1mg/mL、LH 200IU/mL、EGF 10ng/mL、L-半胱氨酸3.05mM、猪***1mL、余量为M199培养基，混匀用0.22μm过滤器过滤分装到1.5mL离心管中，每管分装1mL，现配现用。
操作步骤如下：
1、取卵：于青岛万福肉类食品加工厂获得***母猪卵巢，保存在30-37℃的0.9％生理盐水中，并在2h内运送到实验室，用常规取卵方式捡取***周围颗粒细胞尽量多的卵丘-***(COCs)。
2、平衡猪***体外成熟培养液：将猪***体外成熟培养液分装到1.5mL无菌离心管，每管分装1mL，一共分装4个离心管。第一个离心管作为LPC-/ZEA-组，添加ZEA工作液0μL，LPC工作液0μL，DMSO 0.5μL；第二个离心管作为LPC-/ZEA+组，添加ZEA工作液0.5uL，LPC工作液0uL，DMSO 0uL；第三个离心管作为LPC+/ZEA-组，添加ZEA工作液0μL，LPC工作液0.2μL，DMSO 0.5μL；第四个离心管作为LPC+/ZEA+组，添加ZEA工作液0.5μL，LPC工作液0.2μL，DMSO 0μL。将四个组的培养液混匀，用1mL的移液枪分别吸取700μL培养液放到24孔板，每孔加入6滴石蜡油，接下来将24孔板放到39℃培养箱，0.5％CO2平衡至少5h。此外，接着从剩余的6mL猪***体外成熟培养液中吸取700uL添加到另一个24孔板中，一共添加4个孔(此24孔板用来洗COCs)，每孔加入6滴石蜡油，同样将此24孔板放到39℃培养箱，0.5％CO2平衡至少5h。
3、体外培养COCs：从步骤1分离获得的COCs中挑选出160个COCs，每40个COCs一组，先用洗液洗3遍，再用平衡好的猪***体外成熟培养液洗一遍，最后转移到平衡好的猪***体外成熟培养液中。经过观察，此时COCs中的***处于GV期，即***中细胞核膜没有破裂，分别于体外培养22h和42h时通过免疫荧光法观察统计***生发泡破裂率和第一极体排出率，并于体外培养42h时通过显微镜观察***形态。
4、试验结果：见图1、图2和表1
表1 LPC对被ZEA毒害的猪卵丘-***体外成熟培养的挽救效果
Figure BDA0001700548300000061
注：表中的数字是具体的***个数，括号内数字是所占比例
图1表明，与LPC-/ZEA-对照组和LPC+/ZEA-组相比，LPC-/ZEA+组中COCs卵丘扩展差，COCs整个体积小，颗粒细胞之间间距紧密。与LPC-/ZEA+组相比，LPC+/ZEA+组COCs的卵丘扩展效果好，COCs整个体积变大，颗粒细胞之间间距变大。
从表1的数据可见，与LPC-/ZEA-对照组相比，ZEA+/LPC-实验组***排第一极体率明显下降由80.3±1.1％下降到62.0±5.0％，ZEA+/LPC+实验组细胞排第一极体率显著增加到75.6±6.9％。
从图2可见，***体外成熟培养22h时，四组都发生细胞核膜破解(即生发泡破解)，培养到42h时LPC-/ZEA-、LPC+/ZEA-、LPC+/ZEA+三组均***排出第一极体，可以看到两套染色体组，极体一套染色体组和***一套染色体组，唯独LPC-/ZEA+没有排出第一极体。
图2和表1数据表明，与LPC-/ZEA-对照组相比，ZEA-/LPC+实验组和ZEA+/LPC+实验组GVBD率相似，表明ZEA对***由GV期发育到GVBD期没有影响，但是ZEA影响了***由GVBD发育到排第一极体。
图1、图2和表1表明，LPC挽救了ZEA对COCs卵丘扩展的影响，促进了猪卵丘-***在体外成熟培养发育到排出第一极体。
实施例2：LPC对被ZEA毒害的体外成熟的猪***孤雌激活的挽救效果试验
CB配制：细胞松弛素B(Cytochalasin B，CB)，用DMSO配制CB浓储液为1000倍，浓度为5mg/mL的溶液，用无菌离心管分装，每管1μL，-20℃避光保存。
透明质酸酶配制：透明质酸酶(Hyaluronidase)溶解到PBS中或操作液、M2中都可，透明质酸酶的工作液浓度0.003g/mL。-20℃保存。
***激活液配制：激活液的配制在PEM-5溶液的基础上添加0.6mML-半胱氨酸、4mg/mL BSA、7.5μg/mL CB，0.22过滤器过滤，现配现用。
电激活液配制(孤雌激活)：电激活液用超纯水配制，需要的成分为甘露醇260mM、氯化钙或乙酸钙0.1mM、硫酸镁0.15mM、HEPES 0.1mM、BSA 0.001％，0.22过滤器过滤，4℃保存使用。
成熟***操作液：用无菌超纯水配制1000mL成熟***操作液，成分为，TCM-M199 1PKg、碳酸氢钠0.05g、HEPES 0.75g、氯化钠1.855g、BSA 3g、适量酚红，PH：7.2-7.4,最后用无菌超纯水定容至1000mL，0.22过滤器过滤，4℃保存。
具体操作步骤：
1、平衡***激活液和预热成熟***操作液、电激活液：在3.5cm无菌培养皿中将***激活液每50μL做一个滴，3mL石蜡油覆盖，39℃培养箱，0.5％CO2平衡2h。此外，在3.5cm无菌培养皿中将成熟***操作液每50μL做一个滴，做6个滴，一共准备四个皿，每个皿加入3mL石蜡油，37℃热台预热。此外将电激活液分装到6个1.5mL无菌离心管中，每管1.4mL(在用的过程中不够时可以再预热一部分)热台预热。
2、成熟***孤雌激活：用1mL枪将实施例1获得的成熟COCs连同培养液一起吸取到3.5cm无菌培养皿中，添加10μL透明质酸酶，用200μL枪轻轻吹打去掉颗粒细胞，将去掉颗粒细胞的***用口吸管转移到***操作液中，在体视镜下捡取成熟***(排出第一极体的***)，接着用电激活液将***洗5次，在电融合仪下激活60us，110V/mm。将激活的***再转移到***激活液中，每个滴放置25-30个***，培养3h，通过免疫荧光染色法观察孤雌激活率。
3、试验结果：见图3、表2
图3是成熟***孤雌激活的免疫荧光染色图，因为肉眼无法看到孤雌激活***内的两个细胞核，所以必须染色才能观察***是否被孤雌激活。从图3中可以看出LPC-/ZEA+实验组***没有被孤雌激活(没有两个原核)，但是LPC+/ZEA+实验组***被孤雌激活(有两个原核)，因此我们可以推断LPC挽救了ZEA对***孤雌激活的毒害作用。
表2 LPC对被ZEA毒害的体外成熟的猪***孤雌激活的挽救效果
Figure BDA0001700548300000091
注：表中的数字是具体的***个数，括号内数字是所占比例
从表2的数据可见，与LPC-/ZEA-对照组组相比，LPC+/ZEA-实验组***孤雌激活率相似，但是LPC-/ZEA+实验组***孤雌激活显著地受到抑制，***孤雌激活率由77.7±8.9％下降到58.9±2.3％且P<0.05与LPC+/ZEA+实验组相比较，LPC-/ZEA+实验组***孤雌激活率由58.9±2.3％增加到72.6±9.3％，且P<0.05，这表明单独添加LPC对***孤雌激活可能没有影响，但是却能挽救ZEA对***孤雌激活的抑制作用。
实施例3：LPC对被ZEA毒害的猪的孤雌早期胚胎的挽救效果试验
猪孤雌早期胚胎体外培养液配制(PEM-5)：用无菌超纯水配制500mL猪孤雌早期胚胎体外培养液，成分包括：氯化钠(108mM)、氯化钾(10mM)、磷酸二氢钾(0.35mM)、硫酸镁七水化合物(0.4mM)、碳酸氢钠(25.07mM)、丙酮酸钠(0.2mM)、乳酸钙五水化合物(2.0mM)、谷氨酰胺(2.0mM)、亚牛磺酸(5.0mM)、适量酚红，PH：7.2-7.4，用无菌超纯水定容500mL，0.22过滤器过滤并4℃保存。
具体操作步骤：
1、平衡猪孤雌早期胚胎体外培养液：用24孔板，每孔加入700μL猪孤雌早期胚胎体外培养液，6滴石蜡油覆盖，39℃培养箱，0.5％CO2平衡2h。
2、猪孤雌早期胚胎体外培养：将实施例2中获得的在猪***激活液中培养3h后的孤雌早期胚胎转移到步骤1平衡好的猪孤雌胚胎体外培养液中，培养38h，显微镜观察卵裂情况，培养7天观察囊胚生长状态。
3、试验结果：见图4、表3
表3 LPC对被ZEA毒害的猪的孤雌早期胚胎的挽救效果
Figure BDA0001700548300000101
注：表中的数字是具体的***个数，括号内数字是所占比例
从表3的数据可见，与LPC-/ZEA-对照组相比，LPC+/ZEA-实验组中LPC能促进孤雌早期胚胎卵裂，卵裂率由66.1±10.5％增加到75.0±14.6％和囊胚发育由39.2±4.1％增加到47.2±11.9％；与LPC-/ZEA-对照组相比，LPC-/ZEA+实验组卵裂率从66.1±10.5％下降到63.4±10.4％，囊胚率从39.2±4.1％下降到29.4±9.1％，说明ZEA对猪孤雌早期胚胎的发育有毒害抑制作用；而添加了LPC后，LPC+/ZEA+实验组卵裂率提高到73.4±11.0％，囊胚率提高到31.2±12.1％，说明LPC可以挽救ZEA对猪孤雌早期胚胎的毒害作用。
从图4可看出，38h时，LPC-/ZEA+实验组***卵裂的少，其余三个组(LPC-/ZEA-，LPC+/ZEA-，LPC+/ZEA+)***卵裂的多(结合表3数据)，特别是加入LPC的卵裂率增加了约10个百分点。7d时，LPC-/ZEA+实验组囊胚形成的数量少，且囊胚的体积小，LPC+/ZEA-实验组囊胚数量多，且囊胚体积大，LPC+/ZEA+实验组囊胚的体积也大，但囊胚的数量和LPC-/ZEA+实验组类似(结合表3数据)，而且LPC-/ZEA-实验组的囊胚体积要比LPC+/ZEA-实验组中囊胚体积小一些。从图4和表3可以看出LPC有利于孤雌激活的***卵裂和囊胚发育。注：LPC-/ZEA-实验组的囊胚其中有一个囊胚体积大，但是中间细胞皱缩成一团，这样的囊胚也是正常囊胚，因为体外拍照时间长囊胚会出现皱缩现象，但是LPC+/ZEA-实验组的囊胚体积、数量都是最好的。
以上对本发明所提供的一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法进行了详细介绍。本文通过具体实施方式对本发明的原理和实施方式进行了阐述，以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法，其特征在于，在猪***体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱。
2.根据权利要求1所述玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法，其特征在于，所述在猪***体外成熟培养液中加入溶血磷脂酰胆碱的方法包括如下步骤：
1)配制溶血磷脂酰胆碱浓储液：将溶血磷脂酰胆碱溶解于M199培养基中，配制浓度为50mg/mL，溶解后于-20℃保存备用；
2)配制溶血磷脂酰胆碱工作液：将步骤1)所述溶血磷脂酰胆碱浓储液自然融化后用M199培养基稀释5000倍，稀释后浓度为10μg/mL，现配现用；
3)配制猪***体外成熟培养液：每10mL猪***体外成熟培养液包含的组分为FSH 1mg/mL、LH 200IU/mL、EGF 10ng/mL、L-半胱氨酸3.05mM、猪***1mL、余量为M199培养基，混匀用0.22μm过滤器过滤分装到1.5mL离心管中，每管分装1mL，现配现用；
4)加入溶血磷脂酰胆碱：在步骤3)所得离心管中加入步骤2)所得溶血磷脂酰胆碱工作液，每管加入0.2μL。
3.根据权利要求1或2所述玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法，其特征在于，所述溶血磷脂酰胆碱为粉剂，购自Sigma公司，批号为L5254。
CN201810632505.8A 2018-06-19 2018-06-19 一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法 Active CN108753699B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810632505.8A CN108753699B (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810632505.8A CN108753699B (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108753699A CN108753699A (zh) 2018-11-06
CN108753699B true CN108753699B (zh) 2021-04-30

Family

ID=63978970

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810632505.8A Active CN108753699B (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108753699B (zh)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0958383A1 (en) * 1997-11-17 1999-11-24 The Carnegie Institution Of Washington Production of a lampbrush chromosome
CN1166774C (zh) * 1999-10-01 2004-09-15 国家农艺研究院 用胎儿和成年分化细胞重组非人类哺乳动物胚胎的方法
CN101119745A (zh) * 2002-08-20 2008-02-06 热尼特里克斯有限责任公司 凝集素组合物和调节对抗原免疫应答的方法
WO2008051620A2 (en) * 2006-10-24 2008-05-02 University Of Hawaii Methods and compositions for intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis
WO2009129583A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
CN102166364A (zh) * 2011-04-14 2011-08-31 江南大学 用于治疗卵巢癌的钙离子非依赖性磷脂酶a2的抑制剂
CN102427825A (zh) * 2009-03-24 2012-04-25 约瑟夫·傅立叶大学 受精调节化合物和使用它们的方法
CN104120141A (zh) * 2014-07-14 2014-10-29 青岛农业大学 一种微生物催化合成β-石竹烯的方法及能够合成β-石竹烯的重组细胞
CN105025912A (zh) * 2012-09-13 2015-11-04 小利兰·斯坦福大学托管委员会 卵泡发育和***成熟的刺激
CN105518124A (zh) * 2015-06-26 2016-04-20 深圳市第二人民医院 一种猪***体外成熟培养液及其制备方法和培养方法
CN107574144A (zh) * 2017-10-20 2018-01-12 中国农业大学 一种添加鼠尾草酸的猪***体外成熟培养液及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009520730A (ja) * 2005-12-23 2009-05-28 ヤド・テヒノロギース・ゲーエムベーハー アレルギー性疾患を治療および予防するための手段および方法
WO2015175171A1 (en) * 2014-04-23 2015-11-19 X-Rx Discovery, Inc. Substituted n-(2-(amino)-2-oxoethyl)benzamide inhibitors of autotaxin and their preparation and use in the treatment of lpa-dependent or lpa-mediated diseases

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0958383A1 (en) * 1997-11-17 1999-11-24 The Carnegie Institution Of Washington Production of a lampbrush chromosome
CN1166774C (zh) * 1999-10-01 2004-09-15 国家农艺研究院 用胎儿和成年分化细胞重组非人类哺乳动物胚胎的方法
CN101119745A (zh) * 2002-08-20 2008-02-06 热尼特里克斯有限责任公司 凝集素组合物和调节对抗原免疫应答的方法
WO2008051620A2 (en) * 2006-10-24 2008-05-02 University Of Hawaii Methods and compositions for intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis
WO2008051620A3 (en) * 2006-10-24 2008-07-03 Univ Hawaii Methods and compositions for intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis
WO2009129583A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
CN102427825A (zh) * 2009-03-24 2012-04-25 约瑟夫·傅立叶大学 受精调节化合物和使用它们的方法
CN102166364A (zh) * 2011-04-14 2011-08-31 江南大学 用于治疗卵巢癌的钙离子非依赖性磷脂酶a2的抑制剂
CN105025912A (zh) * 2012-09-13 2015-11-04 小利兰·斯坦福大学托管委员会 卵泡发育和***成熟的刺激
CN104120141A (zh) * 2014-07-14 2014-10-29 青岛农业大学 一种微生物催化合成β-石竹烯的方法及能够合成β-石竹烯的重组细胞
CN105518124A (zh) * 2015-06-26 2016-04-20 深圳市第二人民医院 一种猪***体外成熟培养液及其制备方法和培养方法
CN107574144A (zh) * 2017-10-20 2018-01-12 中国农业大学 一种添加鼠尾草酸的猪***体外成熟培养液及其应用

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
[Effect of the mycotoxin zearalenone on the metabolism of membrane phospholipids of rat lymphocytes];M K Karagezian;《Ukr Biokhim Zh (1999)》;20000630;第72卷(第3期);第105-109页 *
Acrosin Activity Regulation by Protein Kinase C and Tyrosine Kinase in Bovine Sperm Acrosome Exocytosis Induced by Lysophosphatidylcholine;Perez Aguirreburualde, M. S等;《REPRODUCTION IN DOMESTIC ANIMALS》;20020215;第47卷(第6期);第915-920页 *
Boar seminal plasma exosomes: Effect on sperm function and protein identification by sequencing;Piehl, Lidia L等;《THERIOGENOLOGY》;20130815;第79卷(第7期);第1071-1082页 *
Improved preimplantation development of bovine ICSI embryos generated with spermatozoa pretreated with membrane-destabilizing agents lysolecithin and Triton X-100;Zambrano, F等;《THERIOGENOLOGY》;20161001;第86卷(第6期);第1489-1497页 *
In vitro capacitation of stallion spermatozoa assessed by the lysophosphatidylcholine-induced acrosome reaction and the penetration rate into in vitro-matured, zona-free mare oocytes;S. Hochi MSc等;《Journal of Equine Veterinary Science》;19960630;第16卷(第6期);第244-248页 *
Lysophosphatidylcholine induces changes in physicochemical, morphological, and functional properties of mouse zona pellucida: A possible role of phospholipase A(2) in sperm-zona pellucida interaction;Riffo, M等;《MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT》;19990531;第53卷(第1期);第68-76页 *
Lysophosphatidylcholine suppresses apoptosis and induces neurite outgrowth in PC12 cells through activation of phospholipase D2;Doo Hee Yun等;《Exp Mol Med》;20060831;第38卷(第4期);第375-384页 *
LYSOPHOSPHATIDYLCHOLINE TREATMENT ALLOWS INTERSPECIES FERTILIZATION OF HAMSTER OOCYTES WITH ZONA-PELLUCIDA BY HUMAN SPERMATOZOA;RIFFO, M等;《JOURNAL OF EXPERIMENTAL ZOOLOGY》;19950201;第271卷(第2期);第151-154页 *
NTE对培养神经细胞的卵磷脂和溶血卵磷脂平衡的影响;侯威远等;《中国毒理学会全国学术大会》;20090810;全文 *
Oxidative stress in the molecular mechanism of pathogenesis at different diseased states of organism in clinics and experiment;Konstantin G Karageuzyan等;《Curr Drug Targets Inflamm Allergy》;20050228;第4卷(第1期);第85-98页 *
Phosphatidylcholine could protect the defect of zearalenone exposure on follicular development and oocyte maturation;Fang-Nong Lai等;《Aging (Albany NY)》;20181125;第10卷(第11期);第3486-3506页 *
Simultaneous removal of sperm plasma membrane and acrosome before intracytoplasmic sperm injection improves oocyte activation/embryonic development;Morozumi, K等;《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA》;20061121;第103卷(第47期);第17661-17666页 *
Study of the acrosome reaction and the fertilizing ability of hamster epididymal cauda spermatozoa treated with antibodies against phospholipase A2 and/or lysophosphatidylcholine;M S Riffo等;《J Exp Zool》;19960830;第275卷(第6期);第459-468页 *
溶血磷脂酸在***体外成熟过程中作用的研究进展;邢雅欣等;《中华生殖与避孕杂志》;20170925;第37卷(第9期);第750-762页 *
溶血磷脂酸对人卵巢癌细胞P120catenin表达的影响;姜歆等;《中国生物制品学杂志》;20100620;第23卷(第6期);第605-608,612页 *
溶血磷脂酸对冷冻小鼠***体外成熟过程中减数***的作用机制;高磊等;《中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十八届学术研讨会暨中日韩第四届动物繁殖学术交流会》;20160818;全文 *
联合使用1-磷酸鞘氨醇和溶血磷脂酸对小鼠***体外成熟和受精后胚胎发育的影响;段彪等;《中华临床医师杂志(电子版)》;20160801(第15期);第2314-2318页 *
黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的肠毒性和肝毒性研究;武晨清;《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)工程科技I辑》;20210115(第01期);B024-466 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108753699A (zh) 2018-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thouas et al. The ‘GO’system–a novel method of microculture for in vitro development of mouse zygotes to the blastocyst stage
Blondin et al. The time interval between FSH-P administration and slaughter can influence the developmental competence of beef heifer oocytes
Chauhan et al. Replacement of serum and hormone additives with follicular fluid in the IVM medium: effects on maturation, fertilization and subsequent development of buffalo oocytes in vitro
Arias et al. Evaluation of different culture systems with low oxygen tension on the development, quality and oxidative stress-related genes of bovine embryos produced in vitro
Ahumada et al. Effect of supplementation of different growth factors in embryo culture medium with a small number of bovine embryos on in vitro embryo development and quality
Kwak et al. Effects of porcine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on porcine in vitro-fertilized embryos
Khatir et al. Production of dromedary (Camelus dromedarius) embryos by IVM and IVF and co-culture with oviductal or granulosa cells
WAKASUGI Studies on fertility of DDK mice: reciprocal crosses between DDK and C57BL/6J strains and experimental transplantation of the ovary
CN108642001B (zh) 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法
Atabay et al. Vitrification of bovine oocytes and its application to intergeneric somatic cell nucleus transfer
Chen et al. Insulin‐like growth factor I enhances the developmental competence of yak embryos by modulating aquaporin 3
Yoneda et al. Effects of delipidation and oxygen concentration on in vitro development of porcine embryos
JPH06507565A (ja) 体外受精方法および装置
CN108753699B (zh) 一种玉米赤霉烯酮对猪***体外发育危害的挽救方法
Wang et al. Sonic Hedgehog promotes in vitro oocyte maturation and term development of embryos in Taiwan native goats
Sirisathien et al. Effect of leukemia inhibitory factor on bovine embryos produced in vitro under chemically defined conditions
CN107603944B (zh) 一种添加迷迭香酸的***体外成熟培养液及其应用
Shirazi et al. Effect of culture system on survival rate of vitrified bovine embryos produced in vitro
King et al. Nucleolar and mitochondrial morphology in bovine embryos reconstructed by nuclear transfer
Asaadi et al. Frozen–thawed ampullary cell monolayer improves bovine embryo in vitro development and quality
Sereni et al. Freezing spermatozoa obtained by testicular fine needle aspiration: a new technique
Yoshida et al. Effects of the preservation medium and storage duration of domestic cat ovaries on the maturational and developmental competence of oocytes in vitro
US20010028878A1 (en) In vitro maturation of human oocytes in one day
Saeki et al. Effects of cumulus cells on sperm penetration of bovine oocytes in protein-free medium
Demirol et al. Successful birth following transfer of frozen–thawed embryos produced from in-vitro matured oocytes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant