CN108893483B - 丹参萜类合酶基因SmTPS11、其克隆引物、表达载体、催化产物及应用 - Google Patents

丹参萜类合酶基因SmTPS11、其克隆引物、表达载体、催化产物及应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一条主要参与合成丹参挥发性产物石竹烯等多种倍半萜的萜类合酶基因序列(SmTPS11)；本申请提供的SmTPS11基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列以及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。基于丹参基因组和转录组数据获得SmTPS11基因，通过构建pET28a‑SmTPS11原核表达载体，在大肠杆菌体内检测SmTPS11的催化产物，验证SmTPS11的功能。结果证明SmTPS11具有催化合成石竹烯等多种倍半萜的功能。SmTPS11具有催化产生丹参石竹烯的功能。本申请为明确丹参中挥发性成分石竹烯合成的分子机制奠定基础，有利于利用SmTPS11进行定向且大量合成石竹烯，用于开发该化合物的商业用途及其在生物防治方面的应用。

Description

丹参萜类合酶基因SmTPS11、其克隆引物、表达载体、催化产物 及应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学和植物基因工程技术领域，具体涉及丹参中一种参与合成石竹烯等多种倍半萜成分的酶基因的克隆、鉴定及功能验证方法。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科、鼠尾草属双子叶药用植物，根部入药，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效，在临床上治疗心脑血管疾病有显著药用价值。丹参植物体内存在大量挥发性成分，其中倍半萜类化合物是挥发性成分中的主要化合物。这些挥发性成分具有良好的生物活性，成为开发高效低毒天然香料、抗氧化剂和杀菌剂的重要来源。
石竹烯是一种倍半萜化合物，由于其具有芳香味道，常用作食品添加剂和化妆品。石竹烯存在于多种可食用植物的精油中。自然界中，β-石竹烯通常连同少量的异构体和α-石竹烯、石竹烯氧化物形成混合物。在丹参萜类化合物中，β-石竹烯、α-石竹烯和石竹烯氧化物含量高，也是目前植物挥发性成分中药理学活性成分研究较为深入的三种挥发性成分。石竹烯在新药研发中得到广泛关注，β-石竹烯可作为麻醉剂，并且具有抗肿瘤功能。β-石竹烯是一种双环倍半萜型化合物。近年来国内外的研究发现β-石竹烯具有较强的抗炎作用，及抗焦虑、抗抑郁、镇痛等作用。
丹参萜类合酶(Terpene synthase，TPS)基因家族主要参与丹参中单萜、倍半萜和二萜等化合物的生物合成。鉴定到参与丹参体内β-石竹烯合成的TPS对于实现异源合成石竹烯用于新药研发具有重要意义和应用前景。
发明内容
本发明的目的在于研究丹参倍半萜合酶基因在丹参挥发性成分合成途径中的功能，提供一种主要参与β-石竹烯等倍半萜合成的萜类合酶基因SmTPS11及其编码的蛋白质、其扩增引物、以及表达载体pET28a-SmTPS11、其催化产物及应用。
本发明的另一目的在于提供对丹参倍半萜合酶基因SmTPS11的功能验证方法。
本发明提供的SmTPS11基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明提供的SmTPS11基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明设计出了扩增SmTPS11基因的克隆引物，其碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
构建了原核表达载体pET28a-SmTPS11，植物表达载体PCAMBIA1302-SmTPS11，其碱基序列含SmTPS11基因的cDNA碱基序列。
本发明目的可通过如下技术方案实现：
技术方案一：构建植物瞬时表达载体PCAMBIA1302-SmTPS11，转化至根瘤农杆菌(GV3101)中，以叶背面摁压注射的方法侵染约6周大小的烟草叶片，侵染2-4天后，剪下侵染部位的叶片，观察荧光，发现SmTPS11主要定位于细胞质体和细胞膜。
技术方案二：构建pET28a-SmTPS11表达载体，转化至大肠杆菌表达菌株，以0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行蛋白诱导表达。通过固相微萃取技术和气质联用(GC-MS)技术检测基因在原核表达***中的产物，获得SmTPS11主要催化产物β-石竹烯。
附图说明
图1所示为SmTPS11在丹参不同器官中的差异表达谱
图2所示为SmTPS11在烟草瞬时表达体系中的亚细胞定位情况
图3所示为SmTPS11在原核表达体系中其催化产物的GC-MS检测结果
图4所示为SmTPS11在原核表达体系中其催化产物的各产物的质谱图结果
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明。实施是为更好的理解本发明，但不限定于本发明。以下实施方法中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
实施例1 SmTPS11编码基因的克隆及结构分析
1)采用RT-qPCR技术对丹参不同器官中SmTPS11基因进行差异表达分析。结果如图1所示：发现SmTPS11在丹参茎中显著高表达。
2)依据丹参基因组中的SmTPS11序列设计引物，以丹参cDNA为模板进行基因扩增，获得长度为1653bp的核苷酸序列，如SEQ ID No.1。根据全长cDNA序列翻译后，获得SmTPS11基因编码的氨基酸序列，如SEQ ID No.2。
实施例2 SmTPS11的亚细胞定位
1)选取Bgl II/Spe I作为酶切位点，对SmTPS11和PCAMBIA1302载体进行酶切及连接，构建PCAMBIA1302-SmTPS11基因表达载体。
2)分别将PCAMBIA1302空载体和PCAMBIA1302-SmTPS11转化至GV3101感受态中，将转化细胞涂布于含有50mg/L Rif(利福平)和15mg/L Gen(庆大霉素)，50mg/L Kana(卡那霉素)抗性的YEB平板筛选阳性克隆。
3)对于包含PCAMBIA1302空载体和PCAMBIA1302-SmTPS11的阳性菌株、P19菌株扩大培养。转接一次后，待OD值达到0.4-0.6时，离心去除培养液，保留菌体。并分别用1mL烟草侵染液重悬菌体(每100mL烟草侵染液包含1mL 1M的MgCl2(氯化镁)，1mL 1M的MES(2吗啉代乙磺酸)，100μL 0.2M的乙酰丁香酮，98mL的ddH2O。侵染液需现配现用)。将携带质粒的阳性菌株与P19菌株分别按照1∶0.6的比例混合，28℃避光放置2-4h。
4)选取培养6周大、生长状态良好的烟草植株。用1mL的注射器针头从烟草叶面背面戳孔，用注射器摁压式向戳孔位置注射入菌液混合液。置于25℃培养箱，2-4d后，准备观察荧光。
5)剪取叶片小块，制备植物玻片，通过共聚焦显微镜油镜40×倍镜观察荧光。如图2所示，发现SmTPS11主要定位于细胞膜和细胞质体中。
实施例3 SmTPS11基因的原核表达体系构建及代谢产物检测
1)选取Nde I/Not I作为酶切位点，对SmTPS11和pET28a载体进行酶切和连接，构建该基因的原核表达载体pET28a-SmTPS11。
2)分别将pET28a空载体和pET28a-SmTPS11转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50mg/L Kana的LB固体培养基平板中筛选阳性克隆。挑选阳性克隆的单菌落接种于含相应抗生素(50mg/L Kana)的LB液体培养基中，培养过夜。次日，按1∶50的比例进行转接及扩大培养，待菌液的OD600达到0.4-0.6之间时，加入0.5mM的IPTG，于25℃摇床中，避光诱导蛋白表达20h，转速设为110r/min。
3)取10mL诱导后菌液置于20mL顶空瓶中，萃取温度为60℃、震荡频率为500rpm、萃取时间约为30min，以固相微萃取柱(萃取纤维PDMS，100μm)作为萃取头进行萃取。
4)GC-MS仪器为岛津QP2010ultra(HP-5ms：30m×0.25mm×0.25μm)，直接由固相微萃取柱进样。热脱附温度280℃，脱附时间：3min。色谱条件：40℃保持2min，以10℃/min涨至300℃保持5min，氦气流速1ml/min。质谱条件：离子源温度200℃，接口温度250℃，scan模式采集45-500。获得如下结果：相对于转化空载体的对照菌株，含pET28a-SmTPS11的菌株在7.712min出现产物β-月桂烯，8.42min出现产物D-柠檬烯，11.653min出现产物3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇，12.048/12.488min出现产物橙花醇，14.691min出现产物石竹烯，15.209min出现产物蛇麻烯，其中以石竹烯为主要产物，如图3所示。各产物质谱图如图4所示。
本发明基于丹参全基因组对TPS基因家族的挖掘，对TPS家族成员SmTPS11基因进行基因克隆、功能验证及产物分析，发现SmTPS11主要催化合成丹参石竹烯等倍半萜类化合物。本发明为解析丹参体内β-石竹烯等倍半萜类化合物的合成途径奠定基础，也为实现异源合成石竹烯化合物从而用于新药研发提供简便而高效的方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure ISB0000176231680000011
Figure ISB0000176231680000021
Figure ISB0000176231680000031
Figure ISB0000176231680000041

Claims (5)

1.一种丹参萜类合酶编码基因SmTPS11，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种丹参萜类合酶编码基因SmTPS11，其特征在于，所述基因SmTPS11编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种原核表达体系检测基因产物的方法，其特征在于，将pET28a-SmTPS11载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，经Kana筛选获得阳性克隆，对阳性克隆进行扩大培养后，加入0.5mM的IPTG，于25℃摇床中，110r/min，避光诱导20h；诱导完成后，取10mL菌液在萃取温度60℃、震荡频率500rpm、萃取时间约30min条件下，以100μm萃取纤维PDMS的固相微萃取柱作为萃取头进行萃取；利用GC-MS仪器进行产物检测，仪器型号：岛津QP2010ultra，参数：Restek-5MS：30m×0.25mm id，filmthickness 0.25μm；
基因SmTPS11的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求1所述的一种丹参萜类合酶编码基因SmTPS11在基因工程中的应用，其特征在于，所述基因SmTPS11在细菌、真菌和高等植物中通过基因工程手段参与萜类化合物的合成。
5.根据权利要求4所述的应用，外源基因导入宿主需要一种用于携带基因SmTPS11的质粒，其特征在于，质粒选自原核表达载体：pET系列、pGEX系列，植物表达载体：pCAMBIA系列，并含有权利要求1中的核苷酸序列。
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