CN103923938A

CN103923938A - 藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达

Info

Publication number: CN103923938A
Application number: CN201410186005.8A
Authority: CN
Inventors: 欧瑜; 张静
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-04-30
Filing date: 2014-04-30
Publication date: 2014-07-16

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达。通过基因工程手段将藻蓝蛋白β亚基基因克隆于pET-32a质粒载体，重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中。构建的工程菌的表达产物用镍亲和层析柱纯化后，所得融合蛋白对Hela细胞的增殖有一定的抑制作用。

Description

藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达。

技术背景

藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)是一种存在于蓝藻和红藻细胞内的光合色素，能高效捕获光能。其基本构建单位是α和β亚基，分子量在17kD至22kD之间。α亚基由162个氨基酸残基组成，β亚基由172个氨基酸残基组成。研究发现，藻蓝蛋白的生理活性包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎症、提高机体抗辐射能力、保护神经组织免受损伤、增强免疫功能、抑制溶血等。将藻蓝蛋白的β亚单位在大肠杆菌中表达，发现重组体藻蓝蛋白β单位有抗癌活性，但是在正常细胞中有很小的反应，抑制癌细胞增殖和诱导细胞凋亡可能会使重组体藻蓝蛋白β单位成为一种有效的癌症预防和治疗的手段。研究发现与相同摩尔浓度的藻蓝蛋白及其α亚基相比，β亚基对某些肿瘤细胞的生长有更强的抑制作用，提示β亚基具有成为抗肿瘤药物的良好潜力。

本发明首先克隆表达藻蓝蛋白β亚基的基因，并纯化表达的融合蛋白，体外检测该蛋白对Hela细胞生长的抑制作用，为其作为抗肿瘤药物的研发提供实验依据。

发明内容

本发明所述的藻蓝蛋白β亚基融合蛋白是通过重组质粒构建后转化到感受态大肠杆菌，通过诱导表达，纯化所得蛋白而得。其制备方法如下：

从本实验室保存的含有藻蓝蛋白全部β亚基和部分α亚基基因的重组质粒上，PCR法扩增出β亚基基因片段，用内切酶BamH I、HindIII37℃双酶切β亚基基因片段和pET-32a质粒1.5h，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物再16℃连接16h。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21中。工程菌用LB培养基培养到细菌生长的对数期，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，20℃诱导表达20h。诱导结束后10000rpm、15min离心收集菌体，按照每收集1L菌体加入50ml缓冲液的比例，用缓冲液重悬菌体，60％功率超声破碎，12000rpm、30min收集上清，用镍亲和层析柱纯化得到藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白。

将本发明所述的含藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白作用于Hela细胞，MTT法检测其对Hela细胞增殖的抑制作用，发现该融合蛋白对Hela细胞有明显的增殖抑制作用。

附图说明

图1为PCR扩增出的藻蓝蛋白β亚基基因序列。M：DNAMarker；1：藻蓝蛋白β亚基基因。

图2为菌液PCR扩增出的藻蓝蛋白β亚基基因序列。M：DNA Marker；1：藻蓝蛋白β亚基基因。

图3为提取的重组质粒双酶切验证。M：DNAMarker；1：双酶切得到的藻蓝蛋白β亚基基因。

图4为融合蛋白镍亲和层析柱纯化结果。M：蛋白marker；1：诱导前菌体；2：诱导后菌体；3：菌体超声破碎离心后上清；4：菌体超声破碎离心后沉淀；5：融合蛋白镍亲和层析柱纯化效果。

具体实施方式

下面结合一些实例并参照图表数据对本发明做进一步的说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

含藻蓝蛋白β亚基基因的重组质粒的构建

选择藻蓝蛋白β亚基对应的基因序列克隆，序列长度为519bp。在目的基因的上下游引物中分别加入BamH I、HindIII酶切位点。用本实验室保存的含藻蓝蛋白全部β亚基和部分α亚基基因的重组质粒pMD18-T-PC作为模板，并进行PCR扩增β亚基对应基因。PCR反应结束后，产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，如图1，切下含有目的DNA的凝胶，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的DNA片段。目的基因片段与pET-32a质粒载体同时双酶切，取双酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，切下含有目的DNA的凝胶，按照凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。将目的基因片段与双酶切后的原核表达载体pET-32a在16℃、16h条件下连接。

实施例2

重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21中

取连接产物10μl加入到50μl已制备好的大肠杆菌BL21感受态细胞，轻轻混匀后冰浴30min；42℃水浴中热激90s后，迅速再次冰浴3min；加入500μl LB液体培养基并充分混匀，37℃、220rpm振摇培养1h；离心弃上清留取约100μl转化菌液，涂布于含氨苄青霉素(Amp⁺，100μg/mL)的LB固体培养基平板上，37℃培养12-16h。挑取转化成功的单克隆进行菌液PCR验证(图2)、提取质粒双酶切验证(图3)，并测序。

实施例3

工程菌的诱导表达

将保存的菌种接种于含LB培养基的小试管中，37℃、220rpm摇至菌液饱和，作为种子菌。将饱和菌液按1：100比例转接到含LB培养基的锥形瓶中，37度220rpm摇到OD600在0.6-0.8之间。加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，20℃诱导20h。10000rpm、15min离心收集菌体。

实施例4

融合蛋白的纯化

收集的菌体用缓冲液重悬，超声破碎菌体，12000rpm、30min收集上清。镍离子亲和层析柱纯化蛋白：用结合缓冲液平衡柱子，将要流尽时，将已用0.45μm微孔滤膜过滤后的超声上清液加入柱中；待上清液流尽，用结合缓冲液冲洗填料洗去未结合的蛋白；最后用含200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液并浓缩处理，加入终浓度为10％的甘油并用0.22μm无菌滤器过滤后备用。

实施例5

融合蛋白对Hela细胞的增殖抑制实验

将纯化后的含藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白作用于***细胞Hela，终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5、10μmol/L的融合蛋白及10μmol/L的pET-32a空载体蛋白，72h后，MTT法检测Hela细胞存活率。具体操作步骤：取生长良好的对数期Hela细胞，用DMEM培养基制成浓度为2×10⁴个/mL的单细胞悬液，每孔加入100μl于96孔板中培养至细胞贴壁。实验设空白：用于调零；阴性对照组：只加10μmol/L的pET-32a空载体蛋白；实验组：0.625、1.25、2.5、5、10μmol/L的含藻蓝蛋白β亚基的融合蛋白组，每孔加培养基至总体积100μl。37℃二氧化碳培养箱中培养72h后弃去上清液，加入5mg/mL的MTT，每孔10μl，37℃继续培养4h。弃上清液，加入DMSO150μl/L孔，振荡混匀后，在酶标仪上测定570nm下的OD值，按下式计算融合蛋白对Hela细胞生长抑制率：

抑制率％＝(1-OD_实验组/OD_{阴性对照组})×100％

表1

通过实验结果证实，藻蓝蛋白β亚基融合蛋白在10μmol/L浓度时，MTT法测得72h对Hela细胞的增殖抑制率为32.52％。

Claims

1.一种藻蓝蛋白β亚基基因在质粒载体上的克隆，其特征在于：质粒载体为pET-32a，酶切位点为BamH I、HindIII。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：重组质粒需转化到感受态大肠杆菌BL21中以表达融合蛋白。

3.一种权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：PCR法扩增出藻蓝蛋白β亚基基因，将扩增出的基因片段和质粒载体pET-32a同时用BamH I、HindIII内切酶于37℃双酶切1.5h，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物，16℃连接16h。

4.根据权利要求3所述，一种构建的工程菌表达的融合蛋白，其特征在于：融合蛋白用镍亲和层析柱纯化后，达电泳纯。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于：对Hela细胞的增殖有一定的抑制作用。