CN102146413B - 一种人重组白介素-3的表达纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达人重组白介素-3(rhIL-3)的毕赤酵母转化子及其纯化方法，真核宿主为毕赤酵母X-33，主要包括以下步骤：克隆人IL-3基因；构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的IL-3存在糖基化和非糖基化的两种形式；利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经镍亲合纯化后再经DEAE阴离子柱进一步纯化，纯化产物进行了质谱鉴定分析，结果表明，表达出的IL-3是经不同糖基修饰的IL-3，该IL-3含有His×6标签和C-MYC标签，易于纯化和检测表达产。本发明改变了传统的用原核宿主表达rhIL-3，首次利用毕赤酵母表达***大量表达rhIL-3的方法，通过His-tag标签蛋白得到快速纯化，纯化的rIL-3是经不同程度糖基化的分子量分别在19kDa和22kDa的高活性rhIL-3蛋白，本方法保证了快速获得高活性的rhIL-3重组蛋白。

Description

一种人重组白介素-3的表达纯化方法

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及到一种高效的人重组白介素-3(rhIL-3)的表达纯化方法。

背景技术

白细胞介素3(IL-3)：又称为多能集落刺激因子(multi-csf)，主要由活化的cd4+t细胞产生。其主要作用为促进骨髓中多能造血干细胞的定向分化与增殖，产生各种类型的血细胞。因不在骨髓基质细胞生成，所以并不经常与造血相关，它主要参与人体的防御机能，是反应产生的炎症性细胞因子。此外il-3还可调节多种成熟细胞的生长、分化及相关的基因表达，如c-myc、il-2r α基因等。il-3分子量约为15kd，其化学本质为糖蛋白。人类的il-3基因位于第5号染色体长臂区，1987年人il-3克隆成功。成熟的人IL-3分子由133个氨基酸组成，分子量为25-28kD。IL-3受体由两条不同链组成的异源双体，分子量为140kD.IL-3具有刺激多能造血干细胞、髓样、红样、巨噬、前单、单核、中性、嗜酸及肥大细胞的分化增殖。临床上，rhIL-3主要用于治疗骨髓功能衰竭、血小板减少等造血功能障碍性疾病。同时，可作为放疗、化疗的辅佐用药。预防和治疗放化疗后的骨髓抑制以及骨髓移植后的骨髓重建。

由于正常情况下IL-3的水平受到精确的调控，而从白血病患者体内分离出的白血病细胞在体外要维持其存活与增殖，在培养体系中需加外源性IL-3等造血生长因子.即使无造血因子维持。其本身亦要自分泌某些造血因子，如白血病细胞系WEHI-3B能自发地分泌IL-3，而鼠源性的IL-3就是从该细胞株中克隆成功的，提示IL-3与某些白血病的发生与发展有着极其密切的关系。于红细胞生成素(EPO)存在时.rhIL-3能明显增加骨髓BFU-E和CFU-GEMM的产率.BFU-E集落的体积增大.血红蛋白含量增多。rhIL-3还能与II-12协同作用，增加外周血BFU-E和CFU-GM的产率。IL-3除了对白血病细胞起作用外，还能刺激非造血系肿瘤细胞的克隆生长并能促进肿瘤在体内的转移过程。当临床上使用IL-3等***放化疗后的骨髓抑制时，同时亦存在着刺激剩余肿瘤组织生长的危险性。

支气管哮喘是一种典型的特应性疾病。IL-3在哮喘炎症反应中的作用非常显著。哮喘患者的支气管粘膜、肺泡灌洗液及外周血中IL-3水平的升高。研究发现rhIL-3对成熟的嗜酸粒细胞有调节作用，如促进体外嗜酸粒细胞的活存，增强嗜酸粒细胞的细胞毒和吞噬作用。IL-3能促使嗜酸性粒细胞释放白三烯而增强其细胞毒性，并刺激嗜酸性粒细胞向活化型转化。此外，IL-3不但作用于嗜酸性粒细胞，而且作用于中性粒细胞和肥大细胞。这些细胞因子对嗜酸性粒细胞及其它炎症细胞反应的调控作用.是哮喘发病过程中的重要免疫事件，是启动哮喘气道炎症并使其持续存在的关键因素。IL-3除了对嗜酸性粒细胞发挥作用外，在嗜碱性粒细胞引发的过敏反应中也充当了重要的角色。

rhIL-3具有刺激多谱系造血细胞的作用特点，临床上主要用于治疗化疗或放疗所致骨髓造血功能抑制，尚试用于骨髓移植后造血功能恢复、MDS、AA和DBA。rhlL-3的副作用较大，其中部分限制剂量的副作用是由于rhIL-3引起体内释放组胺等炎症介质造成。国外采用基因工程技术生产出强效IL-3受体激动剂，其导致外周血自细胞释放炎症介质的作用相对较弱。

随着对IL-3作用机制及临床应用研究的不断深入，IL-3作为药物，其需求量也大大增加。目前，市场上主要利用原核表达***(主要是大肠杆菌)或昆虫细胞对其进行表达，没有利用毕赤酵母成功表达并纯化到IL-3的报道。大肠杆菌的表达产物通常以包涵体形式存在，要通过变性复性得复杂操作才能得到活性形式的IL-3，从而减少了活性蛋白的产率；另外，原核宿主表达尤其是在大肠杆菌中表达，因为LPS的存在而产生毒素性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定；最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。虽然，昆虫细胞也能表达IL-3蛋白，但其成本高昂且产率很低。因此，目前市场上的rhIL-3重组蛋白价格异常昂贵。本发明首次利用毕赤酵母成功实现了高活性的rhIL-3的大量表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效筛选高水平分泌表达人白介素-3的酵母转化子及其纯化方法，根据该方法可获得稳定、高效分泌表达rhIL-3的毕赤酵母转化子并高效快速纯化到该rhIL-3，该重组蛋白是经不同糖基化修饰的人IL-3蛋白，其主要分子量约在19kDa和22kDa。利用镍亲合层析可以快速将蛋白从发酵上清液中分离出来，再利用DEAE阴离子交换法可以获得高纯度的rhIL-3蛋白，利用该方法得到的rhIL-3具有很好的生物学活性。

实现上述目的的技术方案如下：

一种高效生产rhIL-3的方法，包括以下步骤：

(1)克隆人IL-3基因：以人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hIL-3基因片段，所用IL-3特异引物中引入Xho I酶切位点和在未端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhIL-3/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；

(2)构建真核表达载体：将表达载体pPICZαA和质粒rhIL-3/pMD20-T经过Xho I及Xba I双酶切后纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA/IL-3；

(3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαA/IL-3用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入毕赤酵母X-33宿主菌中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆，阳性克隆利用聚合酶链式反应得到了验证；

(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选阳性克隆转接至含有高浓度Zeocin 3000μg/mL的YPD平板，筛选到了高Zeocin抗性的转化子，高抗性转化子在BMGY培养基培养至光密度值＞10，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，于诱导后的0h，24h，48h和72h时取样，样品经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhIL-3酵母转化子，在摇瓶条件下的表达情况，该转化子表达的rhIL-3超过40mg/mL；

(5)诱导上清液于4℃离心，收集离心后的上清液，0.3M NaCl、20mM咪唑、20mM TrispH 8.0透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC***中纯化，0.3M NaCl、40mM咪唑、20mMTris pH8.0缓冲液漂洗后，利用0.3M NaCl、250mM咪唑、20mM Tris pH8.0缓冲液洗脱收集的样品，上述蛋白样品利用20mM Tris、PH8.0的缓冲液透析过夜，利用DEAE柱于AKTA***中纯化，0-0.5M NaCl、20mM Tris pH8.0线性洗脱，收集mAu＞50的洗脱液，蛋白样品经浓缩后冻存。

经质谱分析，结果表明该方纯化的IL-3是经不同程度糖基化的IL-3，其最主要蛋白的分子量分别经为18995.694Da和22317.469Da，该纯化得到的蛋白具有很高的生物学活性。

优选地，所述rhIL-3特异引物为：

il-3-for：5’-GCCTCGAGAAAAGAGCTCCCATGACCCAGAC-3’

il-3-rev：5’-CGTCTAGAAAGATCGCGAGGCTCAAAG-3’

用本发明所述的生产rhIL-3的方法具有显著的优势：一方面，它能够防止宿主菌对表达产物的降解、减轻宿主细胞代谢的负荷以及表达产物对宿主的毒性作用；二是能够促进分泌蛋白按适当的方式折叠、恢复其天然构象；三是毕赤酵母在表达重组蛋白的同时进行适度的糖基化修饰；四是表达产物带有HIS及C-MYC标签，摸索出一条有效纯化活性重组hIL-3的方法；五是经质谱分析表明利用本纯化方法得到的IL-3经糖基化修饰，其主要蛋白分子量大小为约法19kDa和22kDa；六是测定了毕赤酵母表达IL-3的生物活性，测定结果表明：毕赤酵母表达的rhIL-3在低浓度下(0.5ng)表现生物学活性(MTT法)。

本发明探索出一套最优组合的用真核宿主毕赤酵母高效表达和纯化IL-3的方法，既保证了IL-3的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。

附图说明

图1，真核表达载体pPICZαA/IL-3构建示意图；

图2，毕赤酵母转化子的PCR验证电泳分析示意图；

图3，高水平酵母表达子的筛选及摇瓶条件下hIL-3不同诱导时间的SDS-PAGE分析示意图；

图4，rhIL-3的镍亲合纯化蛋白的SDS-PAGE分析及分子量较大的蛋白的质谱鉴定；

图5，rhIL-3的镍亲合纯化蛋白的SDS-PAGE分析及分子量较小蛋白的质谱鉴定；

图6，IL-3的DEAE纯化；

图7，质谱分析IL-3的分子量大小；

图8，rhIL-3生物学活性的结果示意图。

具体实施方式

本发明选用毕赤酵母X-33菌株，整合性表达质粒pPICZαA载体均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)酵母生长培养基(BMGY)：

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL 500*B，100mL 10*GY；

2)酵母诱导培养基(BMMY)

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700mL。121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL500*B，100mL10*M；

3)YPD液体培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，10g葡萄糖，定容到1000mL，121℃蒸气高压灭菌15-20min。(固体YPD培养基：向YPD液体培养基中加入18g琼脂，即得YPD固体培养基，用于制备YPD平板)

所述高效rhIL-3的表达纯化方法，主要包括以下步骤：

1、克隆rhIL-3全基因：

设计一对引物，以从人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，用IL-3特异引物扩增出完整人重组IL-3基因片段，PCR条件为：954℃预变性，45min，一个热循环；94℃热变性30s，55℃褪火30s，72℃延伸45s，30个热循环；72℃复性10min。所获得的扩增片断连接到pMD20-T载体(购自于广州TAKARA公司)，用PCR，酶切和核酸测序鉴定，测定序列与Genebank公布的IL-3的序列一致。

IL-3特异引物：

il-3-for：5’-GCCTCGAGAAAAGAGCTCCCATGACCCAGAC-3’

il-3-rev：5’-CGTCTAGAAAGATCGCGAGGCTCAAAG-3’

2、构建毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/IL-3：

1)用Xho I和Xba I双酶切重组质粒rhIL-3/pMD20-T，获得目的片断rhIL-3，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

质粒rhIL-3/pMD20-T        15μL

10×H缓冲液               5μL

Xho I                     5U

Xba I                     5U

无菌水                    至50μL

2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

质粒pPICZαA              15μL

10×H缓冲液               5μL

Xho I                     5U

Xba I                     5U

无菌水                    至50μL

3)由1)及2)步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。构建示意图见图1(从该图可看出，表达的重组蛋白含有有His×6标签和C-MYC标签)。

4)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确***到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

质粒pPICZαA片段          1μL

目的片段落                3μL

10×缓冲液                1μL

T4连接酶                  0.5μL

无菌水                    至10μL

得重组载体pPICZαA/IL-3。

3、转化重组质粒至毕赤酵母X-33：

将10μg经Xho I和Xba I双酶切pPICZαA验证的质粒线性化后(Sac I)溶解在10μLMilliQ水中，与80μL X-33混均，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；按照Invitrogen公司操作手册电转化法将重组载体转化到宿主毕赤酵母菌X-33中。转化后用含有100μg/mLZeocin抗生素的YPD(Yeast extract peptone dextrose)平板进行筛选，利用PCR对转化子进行了验证(以5’Fac和3’AOX1为引物，PCR电泳结果如图2所示)。

4、高水平分泌表达酵母转化子的筛选：

阳性克隆转接至含有500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选到了Zeocin抗性的转化子；能在500μg/mL Zeocin的YPD平板的转化子利用YPD液体培养基将YPD平板的菌落洗下，经稀释后，涂布到1500μg/mL Zeocin的YPD平板，再将1500μg/mL Zeocin的YPD平板生长的转化子经稀释后涂布到3000μg/mL Zeocin的YPD平板，最后得到最高抗性为3000μg/mLZeocin的转化子以BMGY培养基培养至光密度值＞10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，诱导72小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhIL-3酵母转化子(结果如图3-A所示)，摇瓶条件下，该转化子表达的rhIL-3超过40mg/L。

5、rhIL-3在摇瓶条件下的扩大表达：

高水平分泌表达酵母转化子于1L BMGY培养基培养至光密度值＞10，离心收集细胞，用150mL BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，每24小时取样一次并补加甲醇一次至终浓度为1％，经诱导120小时后，各时间段的样品测定其总蛋白含量及菌体温得，所得样品上清经SDS-PAGE分析。在扩大摇瓶诱导条件下，该转化子表达的rhIL-3超过40mg/L；摇瓶条件下，诱导96小时左右，rhIL-3的表达量达到最高值，再延长诱导的时间会其表达水平没有明显提高。SDS-PAGE电泳结果如图3-B所示，在约18KDa和22KDa处存在两条特异表达的蛋白条带(图3-B)。

6、rhIL-3的镍亲合纯化：

诱导上清液于4℃离心，收集离心后的上清液，0.3M NaCl、20mM咪唑、20mM Tris pH8.0透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC***中纯化，0.3M NaCl、40mM咪唑、20mM TrispH8.0缓冲液漂洗后，利用0.3M NaCl、250mM咪唑、20mM Tris pH8.0缓冲液洗脱收集的样品，上述蛋白样品利用20mM Tris、PH8.0的缓冲液透析过夜，利用DEAE柱于AKTA***中纯化，0-0.5M NaCl、20mM Tris pH8.0线性洗脱，收集mAu＞50的洗脱液，蛋白样品经SDS-PAGE，结果表明，纯化到的蛋白是两条主带分别为约19K和22K的蛋白(图4)。说明表达的蛋白带有正确的His×6标签和C-MYC标签，能利用镍亲合纯化有效纯化得到该重组蛋白。

7、肽脂纹图谱分析及比对：

镍亲合纯化到的蛋白经SDS-PAGE分析后，发现两条大小分别为19K和22K的蛋白，从胶上切下两条主带，进行肽指纹图谱分析，结果表明，两蛋白都是IL-3(图4及图5)，说明IL-3在酵母中的表达产物经不同程度的糖基化修饰。

8、DEAE进一步纯化：

诱导上清液于4℃离心，收集离心后的上清液，0.3M NaCl、20mM咪唑、20mM Tris pH8.0透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC***中纯化，0.3M NaCl、40mM咪唑、20mM TrispH8.0缓冲液漂洗后，利用3M NaCl、250mM咪唑、20mM Tris pH8.0缓冲液洗脱收集的样品，上述蛋白样品利用20mM Tris、PH8.0的缓冲液透析过夜，利用DEAE柱于AKTA***中纯化，0-0.5M NaCl、20mM Tris pH8.0线性洗脱，收集mAu＞50的洗脱液，蛋白样品经SDS-PAGE，结果表明，经DEAE纯化后，蛋白纯度明显提高(图6)。

9、IL-3的分子量大小分析：

DEAE纯化得到的蛋白经丙酮沉淀后，质谱分析分子量的大小，结果如图7示，表明纯化到的IL-3是经糖基化修饰的蛋白，分子量分别为18995.694Da和22317.469Da。，与SDS-PAGE的结果相符。

10、rhIL-3A的生物学活性分析：

A：将BAF3细胞于含10ng/ml商业化大肠杆菌表达的鼠IL-3蛋白的1640RPMI培养基(含10％FBS)中，于10cm培养皿内培养48小时，离心分离细胞，再用无IL-3的1640RPMI培养基(含10％FBS)10mL洗涤细胞两次，离心，得到细胞，利用无IL-3的1640RPMI培养基(含10％FBS)重悬细胞，并调整细胞浓度至约一万个细胞/毫升，将细胞悬液接种至96孔细胞培养板，每孔接种100μL。向上述96孔板中分别加入终浓度为0、0.1、0.5、1、5、10、20、50ng/mL的本发明表达纯化到的IL-3，每个浓度分别做6重复孔；于温箱中培养48小时；向各孔中加入10微升5mg/mL的MTT，于培养箱中温育4小时，利用移液枪小心将培养液上清吸干净，向每孔中加入100μL的DMSO于震荡器中震荡10min充分溶解，测定570nm光值。所测结果表明，酵母表达的IL-3具有生物学活性，在极低浓度下(0.5ng/mL)纯化得到的rhIL-3具有良好的生物学活性(结果如图8-A所示)。

B：将BAF3细胞于含10ng/ml商业化大肠杆菌表达的鼠IL-3蛋白的1640RPMI培养基(含10％FBS)中，于10cm培养皿内培养48小时，离心分离细胞，再用无IL-3的1640RPMI培养基10mL洗涤细胞两次，离心，得到细胞，利用无IL-3的1640RPMI培养基重悬细胞，并调整细胞浓度至约一百万个细胞/毫升，将细胞悬液接种至6孔细胞培养板，每孔接种2000μL，温箱中无血清饥饿12小时。向上述6孔板中分别加入终浓度为0、1、10、20、40ng/mL的IL-3，温箱培养15分钟，离心收集细胞，并用冰冷的PBS洗细胞两次，RIPA裂解细胞，并提取蛋白，SDS-PAGE分，WB分析p-ERK及p-AKT的变化，结果表明：IL-3能激活p-ERK及p-AKT的磷酸化(结果如图8-B所示)，进一步证实了表达产物的生物活性。

以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种人重组白介素-3的表达纯化方法，其特征在于：主要包括以下步骤：

（1）克隆人IL-3基因：以从人血白细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hIL-3基因片段，所用IL-3特异引物中引入XhoI酶切位点和在3’端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhIL-3/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；

（2）构建真核表达载体：将表达载体pPICZ αA和质粒rhIL-3/pMD20-T经过Xho I及XbaI双酶切并纯化回收，并利用T4 DNA连接酶连接，得重组载体pPICZ αA/rhIL-3；

（3）转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZ αA/rhIL-3用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入毕赤酵母X-33宿主菌中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

（4）高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选到了Zeocin抗性的转化子；将Zeocin抗性的转化子利用YPD液体培养基洗下，经稀释后，涂布到1500μg/mL Zeocin的YPD平板，将1500μg/mL Zeocin的YPD平板生长的转化子经稀释后涂布到3000μg/mL Zeocin的YPD平板，得到高抗性转化子；再以BMGY培养基培养至光密度值>10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0%，诱导72小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhIL-3酵母转化子；

（5）利用BMMY大量诱导表达，诱导后的酵母转化子上清液，经0.3M NaCl、20mM咪唑、20mM Tris pH 8.0透析后，利用镍亲合层析柱于ATKA-HPLC***中纯化，0.3M NaCl、20mM咪唑、20mM Tris pH8.0缓冲液漂洗后，利用0.3M NaCl、250mM咪唑、20mM Tris pH 8.0缓冲液洗脱收集的样品；上述蛋白样品利用20mM Tris、PH8.0的缓冲液透析过夜，利用DEAE柱于AKTA***中纯化，0-0.5M NaCl、20mM Tris pH8.0线性洗脱，收集mAu>50的洗脱液，蛋白样品经浓缩后即得人重组白介素-3。

2.根据权利要求1所述的表达纯化方法，其特征是：所述步骤（1）中所述的特异引物为：

il-3-for:5’-GCCTCGAGAAAAGAGCTCCCATGACCCAGAC-3’

il-3-rev:5’-CGTCTAGAAAGATCGCGAGGCTCAAAG-3’。

3.根据权利要求1或2所述的表达纯化方法得到的人重组白介素-3，其是经糖基化修饰的蛋白，分子量分别为18995.694Da和22317.469Da。

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