CN109678949A - 一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，包括以下步骤：(1)将藻蓝蛋白β亚基编码基因与载体连接，得到重组质粒，所述重组质粒含有启动子；(2)制备酵母感受态细胞，将重组质粒经电转化法转入酵母感受态细胞，培养得到酵母转化子，筛选阳性酵母转化子；(3)阳性酵母转化子转接入发酵培养基中培养。本发明成功实现在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，发酵结束后，藻蓝蛋白含量达到60.8～167.6mg/L，占总蛋白的40.5～61.3％。本发明方法不仅藻蓝蛋白得率较高，操作简单，原料易得，成本低，而且本发明在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，为进一步研究藻蓝蛋白的β亚基功能提供了大量的基础材料。

Description

一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法。
背景技术
藻蓝蛋白(Phycocyanin,简称PC，吸收光谱在610～640nm)是重要的捕光色素蛋白，不仅可以作为工业原料和食品添加剂。而且由于藻蓝蛋白易于与生物素、抗体等蛋白质结合，因此藻蓝蛋白作为荧光探针越来越受到重视。目前藻蓝蛋白主要从螺旋藻中分离纯化制得，但螺旋藻养殖困难，破壁困难，从螺旋藻中分离纯化藻蓝蛋白成本高、工艺复杂、得率低，而且原料浪费严重。酵母表达***是迄今为止最为成功的高效表达***，其细胞繁殖速度快，生长周期短，破壁容易，遗传背景相对清楚，外源基因可稳定遗传，表达产量高，成本低，特别适合用于蛋白表达。因此借助基因工程与发酵工程技术生产藻蓝蛋白将成为本领域新趋势。
此外，藻蓝蛋白主要由α和β亚基组成，α和β亚基先通过二硫键形成(αβ)单体，再通过共价键形成(αβ)3三聚体或(αβ)6六聚体，至于组成PC的α和β亚基在行使生物学功能时，哪一个亚基更重要或是否需要特定的空间结构，国内外均未见报道。
发明内容
鉴以此，本发明的目的是提供一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，不仅解决现有技术中生产藻蓝蛋白时成本高、得率低等问题，而且本发明在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，为进一步研究藻蓝蛋白的β亚基功能提供了大量的基础材料。
本发明的技术方案是：
一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，包括以下步骤：
(1)将藻蓝蛋白β亚基编码基因与载体连接，得到重组质粒，所述重组质粒含有启动子；
(2)制备酵母感受态细胞，将重组质粒经电转化法转入酵母感受态细胞，培养得到酵母转化子，筛选阳性酵母转化子；
(3)阳性酵母转化子转接入发酵培养基中培养。
优选的，所述藻蓝蛋白源于极大螺旋藻。
优选的，所述酵母为酿酒酵母。
优选的，所述启动子为GAL1或GAL10。
优选的，所述载体为pYES2。
优选的，步骤(2)中采用YNB培养基进行培养，所述YNB培养基包括以下成分：葡萄糖30～40g/L、硫酸铵0.6～0.9g/L、YNB 15～20g/L、亮氨酸20～30μg/L和色氨酸25～35μg/L，pH 5.0～5.5；培养的条件为：25～28℃、280～300r/min震荡培养15～20h。
优选的，所述发酵培养基包括以下成分：酵母粉20～25g/L、胰蛋白胨10～12g/L、葡萄糖20～25g/L、半乳糖2～5g/L、K2HPO4 0.1～0.3g/L和亮氨酸5～20μg/L，pH 5.5～6.0。
优选的，步骤(3)为：阳性酵母转化子转接入发酵培养基中，30～38℃、500～800r/min发酵培养36～48h，收集菌体，即得。
优选的，在发酵过程中，保持发酵罐中DO值始终维持25～30％。
优选的，发酵培养24h后向发酵液中添加半乳糖、色氨酸、银杏多糖和毛子草酮的混合物，其中，半乳糖、色氨酸、银杏多糖和毛子草酮的质量比为100:1：0.3:0.2，混合物的添加量为20g/L发酵液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
A.本发明成功实现在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，发酵结束后，藻蓝蛋白含量达到60.8～167.6mg/L，占总蛋白的40.5～61.3％。本发明方法不仅藻蓝蛋白得率较高，操作简单，原料易得，成本低，而且本发明在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，为进一步研究藻蓝蛋白的β亚基功能提供了大量的基础材料。
B.酵母中***外源蛋白基因的不同，在相同条件下其生长的行为规律也不相同。本发明合理调整各培养阶段的培养基及培养条件，调控目标产物的合成时机，实现目标产物的大量积累，且同时有效缩短生产时间。
C.本发明在发酵24h后加补加诱导剂半乳糖，为了适应新环境，酵母的代谢途径也相应地发生了转变，随着半乳糖的补加，酵母适应了新环境后，外源藻蓝蛋白基因持续表达，藻蓝蛋白的总产量也随之增加。此外，试验发现当发酵至24h后，部分代谢物的大量积累不利于细胞生长以及目标蛋白的表达，本发明在发酵过程中还添加了色氨酸、银杏多糖和毛子草酮，可有效屏蔽发酵过程中影响细胞生长和目标蛋白表达的因素，促进目标蛋白产量的增加。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，包括以下步骤：
(1)将极大螺旋藻的藻蓝蛋白β亚基编码基因与载体pYES2连接，得到重组质粒，所述重组质粒含有启动子GAL1；
(2)制备酿酒酵母感受态细胞，将重组质粒经电转化法转入酵母感受态细胞，然后在YNB培养基中培养得到酵母转化子，筛选阳性酵母转化子；培养的条件为：25℃、280r/min震荡培养15h；
(3)阳性酵母转化子转接入发酵培养基中，30℃、500r/min发酵培养36h，发酵期间保持发酵罐中DO值始终维持25％。
所述YNB培养基包括以下成分：葡萄糖30g/L、硫酸铵0.6g/L、YNB 15g/L、亮氨酸20μg/L和色氨酸25μg/L，pH 5.0。
所述发酵培养基包括以下成分：酵母粉20g/L、胰蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L、半乳糖2g/L、K2HPO4 0.1g/L和亮氨酸5μg/L，pH 5.5。
实施例2
一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，包括以下步骤：
(1)将极大螺旋藻的藻蓝蛋白β亚基编码基因与载体pYES2连接，得到重组质粒，所述重组质粒含有启动子GAL10；
(2)制备酿酒酵母感受态细胞，将重组质粒经电转化法转入酵母感受态细胞，然后在YNB培养基中培养得到酵母转化子，筛选阳性酵母转化子；培养的条件为：28℃、300r/min震荡培养20h。
(3)阳性酵母转化子转接入发酵培养基中，38℃、800r/min发酵培养48h，发酵期间保持发酵罐中DO值始终维持30％。
所述YNB培养基、发酵培养基与实施例1相同。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于，
所述YNB培养基包括以下成分：葡萄糖40g/L、硫酸铵0.9g/L、YNB 20g/L、亮氨酸30μg/L和色氨酸35μg/L，pH 5.5。
所述发酵培养基包括以下成分：酵母粉25g/L、胰蛋白胨12g/L、葡萄糖25g/L、半乳糖5g/L、K2HPO4 0.3g/L和亮氨酸20μg/L，pH 6.0。
实施例4
实施例4与实施例3的区别在于，
步骤(3)：阳性酵母转化子按体积分数10％接种量转接入发酵培养基中，35℃、500r/min发酵培养，发酵培养24h后向发酵液中添加半乳糖、色氨酸、银杏多糖和毛子草酮的混合物(100:1:0.3:0.2)，混合物的添加量为20g/L发酵液，继续发酵至48h。
实施例5
实施例5与实施例4的区别在于，
步骤(3)：阳性酵母转化子按体积分数10％接种量转接入发酵培养基中，35℃、500r/min发酵培养，发酵培养24h后向发酵液中添加半乳糖、色氨酸和银杏多糖的混合物(100:1:0.3)，混合物的添加量为20g/L发酵液，继续发酵至48h。
实施例6：
实施例6与实施例1的区别在于，所述酵母为巴斯德毕赤酵母。
实施例7：
实施例7与实施例1的区别在于，
所述发酵培养基包括以下成分：酵母粉20g/L、胰蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L、半乳糖35g/L、甘油1g/L、YNB 10g/L、0.1g/L K2HPO4和KH2PO4 0.5g/L，pH 5.5。
试验例：藻蓝蛋白含量测定
方法：
取实施例中发酵结束后的发酵液，发酵液经600W的超声波处理15min，使细胞壁完全破碎，然后在4℃下经12 000r/min离心10min后取上清液，用SDS-PAGE凝胶电泳分析，并根据各条带的百分比，计算蛋白含量。结果见下表。
总藻蓝蛋白的含量mg/L 总藻蓝蛋白/菌体总蛋白
实施例1 100.7 47.7％
实施例2 107.0 49.0％
实施例3 122.2 54.8％
实施例4 167.6 61.3％
实施例5 150.2 59.0％
实施例6 60.8 40.5％
实施例7 75.9 43.9％
试验结果表明，本发明成功实现在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基，发酵结束后，藻蓝蛋白含量达到60.8～167.6mg/L，占总蛋白的40.5～61.3％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将藻蓝蛋白β亚基编码基因与载体连接，得到重组质粒，所述重组质粒含有启动子；
(2)制备酵母感受态细胞，将重组质粒经电转化法转入酵母感受态细胞，培养得到酵母转化子，筛选阳性酵母转化子；
(3)阳性酵母转化子转接入发酵培养基中培养。
2.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，所述藻蓝蛋白源于极大螺旋藻。
3.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母。
4.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，所述启动子为GAL1或GAL10。
5.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，所述载体为pYES2。
6.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，步骤(2)中采用YNB培养基进行培养，所述YNB培养基包括以下成分：葡萄糖30～40g/L、硫酸铵0.6～0.9g/L、YNB 15～20g/L、亮氨酸20～30μg/L和色氨酸25～35μg/L，pH 5.0～5.5；培养的条件为：25～28℃、280～300r/min震荡培养15～20h。
7.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下成分：酵母粉20～25g/L、胰蛋白胨10～12g/L、葡萄糖20～25g/L、半乳糖2～5g/L、K2HPO4 0.1～0.3g/L和亮氨酸5～20μg/L，pH 5.5～6.0。
8.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，步骤(3)为：阳性酵母转化子转接入发酵培养基中，30～38℃、500～800r/min发酵培养36～48h，收集菌体，即得。
9.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，在发酵过程中，保持发酵罐中DO值始终维持25～30％。
10.根据权利要求1所述的在酵母中表达生产藻蓝蛋白β亚基的方法，其特征在于，发酵培养24h后向发酵液中添加半乳糖、色氨酸、银杏多糖和毛子草酮的混合物，其中，半乳糖、色氨酸、银杏多糖和毛子草酮的质量比为100:1:0.3:0.2，混合物的添加量为20g/L发酵液。
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