CN103509823A - 一种利用cho细胞生产重组蛋白的真核表达载体及*** - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达***及真核表达载体，所述真核表达载体包括GS表达单元，所述GS表达单元包括5’至3’方向依次排列的TK启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列以及SV40polyA基因序列；本发明的表达***包括真核表达载体及CHO细胞，该表达***能够实现外源基因在CHO细胞基因组中的整合和高效表达，在蛋白制备领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体公开了一种利用CHO细胞生产重组蛋白的基因表达***及真核表达载体。
背景技术
基因工程领域所用基因表达***大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达***。与其它***相比，哺乳动物细胞表达***的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化修饰，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。哺乳动物细胞的规模化生产技术也日渐成熟和完善。因此，通过哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已经成为当今生物制药领域的主流技术。目前已经上市和正在进行临床试验的蛋白质药物中，主要来自于哺乳动物细胞，而这其中中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）是最常用基因工程宿主细胞。
为了获得高效的外源基因表达，基因工程CHO细胞中常使用二氢叶酸还原酶(Dihydrofolatereductase，DHFR)和谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase，GS)进行基因扩增和筛选。谷氨酰胺合成酶表达***（GS表达***）往往只需一轮加压筛选，所需筛选时间短；另外由于携带有GS基因的细胞株在放大培养过程中不需要添加谷氨酰胺，因此，受代谢副产物NH3毒的影响较小，有利于工艺优化及放大培养。
利用GS、DHFR基因扩增和筛选***的表达载体多由美国等发达国家开发，其专利保护、技术转让壁垒极大地限制了我国生物制药技术及工业的发展，因此现在急需一种具有自主知识产权的表达***，以促进相关蛋白药物的开发和我国生物制药工业的进步。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种自主开发、具有自主知识产权的高效表达载体pHLX101，以及一种CHO细胞基因整合表达***，以实现目的基因的筛选和高效表达。
本发明第一方面公开了一种pHLX101真核表达载体，包括GS表达单元，所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的TK启动子基因序列(TK promoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列（GS）以及SV40polyA基因序列。
所述TK启动子基因序列如SEQ ID NO：1所示；所述谷氨酰胺合成酶基因序列如SEQID NO：2所示；所述SV40poly A基因序列如SEQ ID NO：3所示。
较优的，所述GS表达单元基因序列如SEQ ID NO：4所示。
较优的，所述GS表达单元的序列还可以包括酶切位点序列。所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的酶切位点序列、TK启动子基因序列(TK promoter)、谷氨酰胺合成酶基因序列（GS）、SV40 polyA基因序列以及酶切位点序列。
更优的，所述酶切位点序列选自HindIII酶、NotI酶、SmaI酶或SalI酶中的一种或多种。
最优的，所述含有酶切位点的GS表达单元序列可以如SEQ ID NO：7所示。
较优的，所述pHLX101真核表达载体是由pUC19质粒改造获得。
更优的，所述pHLX101真核表达载体是在pUC19质粒的SmaI酶切位点和HindIII酶切位点之间，***所述GS表达单元构成的。
本发明pHLX101真核表达载体的制备方法为：通过PCR的方法在GS表达单元的两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将GS表达单元***表达载体，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本发明的pHLX101真核表达载体。
具体方法为：
1）***序列的制备：利用引物GS-TK5（SEQ ID NO：5）和GS-PA3（SEQ ID NO：6），通过PCR的方法获得含有GS表达单元的***序列（SEQ ID NO：7）；
2）酶切：将pUC19质粒用SmaI和HindIII酶双酶切，将含有GS表达单元的***序列用HindIII酶酶切，分别获得质粒片段和GS表达单元片段；
3）连接：连接酶连接质粒片段和GS表达单元片段，获得连接产物；
4）鉴定：连接产物转化感受态的大肠杆菌细胞，筛选阳性克隆，鉴定序列正确的连接产物为本发明的pHLX101真核表达载体。
较优的，所述pHLX101真核表达载体适用于CHO细胞。
更优的，所述pHLX101真核表达载体适用于CHO-K1细胞。
本发明第二方面公开了一种pHLX101-CHO真核表达***，包括本发明所述的pHLX101真核表达载体以及中国仓鼠卵巢细胞。
较优的，所述中国仓鼠卵巢细胞为CHO-K1细胞。
本发明第三方面公开了利用前述pHLX101-CHO真核表达***制备重组蛋白的方法，步骤如下：
1）重组质粒的构建：将表达重组蛋白的外源基因表达单元***pHLX101真核表达载体中，构建获得重组质粒；
2）表达***的筛选：重组质粒转化CHO细胞，筛选稳定表达的细胞株作为pHLX101-CHO真核表达***；
3）采用上一步筛选的pHLX101-CHO真核表达***表达重组蛋白。
较优的，步骤1）中所述外源基因表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的启动子序列、外源基因序列以及终止信号和poIyA加尾信号序列。
更优的，步骤1）所述外源基因表达单元的序列还包括两端的酶切位点序列。
更优的，步骤1）所述外源基因表达单元***到pHLX101真核表达载体的限制性酶切位点之间。
最优的，步骤1）所述外源基因表达单元***到pHLX101真核表达载体的EcoRV酶和NotⅠ酶的限制性酶切位点之间，或者***到SmaI酶和XmaI酶的限制性酶切位点之间。
较优的，步骤1）具体为：将外源基因表达单元通过酶切、连接的方法***pHLX101真核表达载体，连接产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的重组质粒
所述筛选为采用添加有Amp的LB培养基选择培养转化了连接产物的感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR，对PCR产物电泳分析或者测序分析。
较优的，步骤2）具体为：重组质粒转化CHO细胞后，通过MSX进行加压筛选，获得稳定表达的细胞株。
较优的，所述MSX加压筛选的终浓度为10～100μmol。
最后，本发明还公开了pHLX101真核表达载体、pHLX101-CHO真核表达***在重组蛋白表达中的应用。
本发明公开了一种在CHO细胞中利用pHLX101真核表达载体生产重组蛋白的基因表达***，该表达***能够实现外源基因在CHO细胞基因组中的整合和高效表达。该***的制备方法主要包括：构建真核表达载体，适合于目的基因在CHO细胞中的瞬时表达，并适合于目的基因高表达细胞株筛选。利用本发明的CHO表达***可以实现重组蛋白、单克隆抗体等在CHO细胞中的整合和表达，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1：PCR法从pBSK-TK-GS-SV质粒扩增含GS表达单元基因片段的电泳结果（M：DNAmarker L1：PCR扩增片段）
图2：GS表达单元及pUC19质粒酶切产物电泳结果（M、L5：DNA marker L1-L4：SmaI和HindⅢ限制性内切酶酶切pUC19质粒后的片段L6-L7：HindⅢ限制性内切酶酶切PCR产物后的片段）
图3：菌落PCR结果电泳图谱（M：DNA marker L1-L24：不同克隆的PCR产物）
图4：pHLX101真核表达载体的酶切鉴定电泳图谱（M：DNA marker L1、L2：限制性内切酶SalⅠ和限制性内切酶EcoRV.酶切pHLX101质粒后的片段）
图5：pHLX101真核表达载体的质粒图谱
图6：2009-HLX01-HC和2009-HLX01-LC的PCR扩增产物电泳结果
图7：pHLX101-HLX01-LC的酶切鉴定结果及pHLX101-HLX01-HC的菌落PCR结果
图8：pHLX101-HLX01-HC HindIII酶切鉴定
图9：pHLX101-HLX01-LC重组质粒图谱
图10：pHLX101-HLX01-HC重组质粒图谱
图11：谷氨酰胺合成酶活性比较
图12：pHLX101-eGFP重组质粒图谱
图13：加压筛选后的细胞株荧光显微镜检图
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTUREAND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。
实施例1 pHLX101真核表达载体的构建
1.标记基因表达单元的合成
从NCBI数据库中获得了鼠源的谷氨酰胺合成酶基因序列（GS，Genebank登录号：NM 008131.3，ABC015086.1，X16314.1）、TK启动子基因序列(TK promoter，Genebank登录号：JN420340.1，AF104248.2，AF362551.1)以及SV40polyA基因序列（Genebank登录号：JQ302818.1，HQ388295.1，EF437954.1），基于这些序列，设计了利于GS基因在CHO细胞中整合及表达的GS表达单元（SEQ ID NO：4），将设计的表达单元送交基因合成公司合成了该序列，合成的表达单元***在pBSK载体中，获得TK-GS-SV-pBSK载体。
13.真核表达载体pHLX101的构建
2.1含有GS表达单元的基因片段的制备
利用表1所示GS-TK5和GSPA3引物从TK-GS-SV-pBSK载体中通过PCR的方法扩增出含有GS表达单元的基因片段，并引入相应的酶切位点。
表1 PCR引物序列
| 引物名称 | 5′-3′序列 | 引入内切酶位点 |
| GS-TK5 | Gggagtcgactatacagacatgataagatac（SEQ ID NO:5） | SmaI-SalI |
| GS-PA3 | gccaagcttatgcggccgcgatatccccggaagaaatatattt（SEQ ID NO:6） | HindIII-NotI |
PCR反应条件：预变性95℃3min；变性94℃30s，退火53℃30s，延伸72℃2min，31循环；延伸：72℃10min。
PCR产物的电泳图谱见图1，含有GS表达单元的PCR产物的基因序列如下：
gccaagcttatgcggccgcgatatccccggaagaaatatatttgcatgtctttagttctatgatgacacaaaccccgcccagcgtcttgtcattggcgaattcgaacacgcagatgcagtcggggcggcgcggtccgaggtccacttcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcggacttccaccatggccacctcagcaagttcccacttgaacaaaggcatcaagcaaatgtacatgtccctgccccagggtgagaaagtccaagccatgtatatctgggttgatggaaccggagaaggactgcgctgcaagacccgtaccctggactgtgagcccaagtgtgtggaagagttacctgagtggaactttgatggctctagtacctttcagtctgaaggctccaacagcgacatgtacctccatcctgttgccatgtttcgagaccccttccgcaaagaccccaacaagctggtgctatgtgaagttttcaagtataaccggaaacctgctgagaccaacttgaggcacatctgtaaacggataatggacatggtgagcaaccagcacccctggtttggaatggagcaggaatatactcttatgggaacagacggccacccatttggttggccttccaatggcttccctggaccccaaggcccgtattactgcggtgtgggagcagacaaggcctacggcagggacatcgtggaggctcactaccgggcctgcttgtatgctggagtcaagattacggggacaaatgcggaggttatgcctgcccagtgggaatttcagataggaccctgtgagggaatccgaatgggagatcatctttggatagcccgttttatcttgcatcgggtgtgcgaagactttggggtgatagcaacctttgaccccaagcccattccagggaactggaatggtgcaggctgccataccaacttcagcaccaaggccatgcgggaggagaatggtctgaagtgcattgaggaggccattgacaaactgagcaagaggcaccagtaccacattcgcgcctacgatcccaaggggggcctggacaacgcccggcgtctgactggattccacgaaacctccaacatcaacgacttttctgccggtgttgccaaccgcggtgccagtatccgcattccccggactgtcggccaggagaagaagggctactttgaagaccgtcggccttctgccaattgtgacccctatgcggtgacagaagccatcgtccgcacgtgtctcctcaacgaaacaggcgacgaacccttccaatacaagaactaatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtatagtcgactccc（SEQ ID NO：7）
13.2 将GS表达单元***pUC19载体
2.2.1酶切
用HindIII酶酶切含有GS表达单元的PCR产物，同时用SmaI和HindIII酶酶切pUC19克隆载体。PCR产物的酶切反应体系见表2，反应条件为：37℃水浴3小时；pUC19载体的酶切反应体系见表3，酶切步骤为：按照表3的组分制备酶切反应体系，30℃水浴3小时后，加入HindⅢ内切酶2μL，37℃水浴3小时。酶切后的PCR产物及pUC19载体进行割胶回收，回收产物的电泳结果见说明书附图2。
表2 PCR产物酶切反应体系
| 试剂 | 体积 |
| PCR产物 | 30μL |
| 10×M缓冲液 | 4μL |
| HindⅢ内切酶 | 2μL |
| ddH20 | 4μL |
表3 pUC19克隆载体酶切反应体系
| 试剂 | 体积 |
| pUC19质粒 | 15μL |
| 10×T缓冲液 | 4μL |
| BSA | 6μL |
| SmaI | 2μL |
| ddH20 | 13μL |
2.2.2连接
将酶切后的载体和GS表达单元通过T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物。载体片段和GS表达单元的连接体系见表4，连接反应条件为：16℃连接过夜。
表4酶切产物连接体系
| 试剂 | 体积 |
| TaKaRa DNA ligation Kit Ver.2.0 | 5μL |
| PCR产物片断（HindⅢ酶切） | 4μL |
| pUC19载体片断（SmaI+HindⅢ酶切） | 1μL |
2.2.3转化
将制备获得的连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞，具体步骤如下：从-80℃取出感受态细胞，冰上放置15分钟溶解；将连接产物加入到感受态细胞中，用枪吹吸混匀；冰上放置30min；42℃水浴90s；冰上放置2min；加入1ml 30℃预热的LB培养基入离心管中；37℃放置1小时；5000g离心5min，弃上清，留少量液体，将细胞重悬后后涂布于Amp抗性的LB板上，过夜培养。
2.2.4鉴定
挑取单克隆，进行菌落PCR，菌落PCR引物为GS-TK5（SEQ ID NO:5）和GSPA3（SEQID NO:6），菌落PCR实验结果见图3。
鉴定结果为阳性的菌落用LB培养基培养，并抽取质粒DNA，酶切鉴定并测序。酶切实验结果见图4，测序结果与实验预期一致，构建成功的pHLX101真核表达载体的质粒图谱见图5。
实施例2 CHO细胞基因整合表达***的构建及抗体的表达
1.pHLX101-HLX01-HC、pHLX101-HLX01-LC重组质粒及CHO表达***的构建
首先构建了分别含有抗体重链和抗体轻链序列及相关功能元件的真核表达载体2009-HLX01-HC（含有由PromoterA、抗体重链序列以及SV40 poly A组成的HLX01-HC表达单元）及真核表达载体2009-HLX01-LC（含有由CMVPromoter、抗体轻链序列以及SV40polyA组成的HLX01-LC表达单元）。
通过PCR的方法分别从2009-HLX01-HC载体和2009-HLX01-LC载体中扩增各自的外源基因表达单元，然后通过酶切、连接的方法将外源基因表达单元***pHLX101载体，转染CHO-K1细胞，最后筛选稳定表达的细胞株作为符合要求的CHO表达***。
1.1.载体构建
1.1.1.外源基因表达单元的PCR扩增
1.1.1.1.HLX01-LC表达单元的扩增
从2009-HLX01-LC载体中通过PCR的方法扩增出包含HLX01-LC表达单元的基因片段，PCR反应体系如表5：
表5PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 2×iProofHF Master Mix（BioRad） | 25μL |
| 模板：2009-HLX01-LC | 1μL |
| 引物#39（10μmol） | 2μL |
| 引物#40（10μmol） | 2μL |
| ddH20 | 20μL |
PCR反应条件为：预变性95℃3min；变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃3min30s，31循环；延伸：72℃10min，PCR结果的电泳图谱见图6。
引物#39序列为：caaggacggtgactgcagtgaa（SEQ ID NO：8）
引物#40序列为：gtcgcggccgccagacatgataag（SEQ ID NO：9）
含HLX01-LC表达单元的PCR扩增产物的基因序列如SEQ ID NO：10所示。
1.1.1.2.HLX01-HC表达单元的扩增
从2009-HLX01-HC载体中通过PCR法扩增出含有HLX01-HC表达单元的基因片段，PCR反应体系如表6：
表6 PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 2×iProof HF Master Mix（BioRad） | 25μL |
| 模板：2009-HLX01-HC | 1μL |
| 引物#50（10μmol） | 2μL |
| 引物#51（10μmol） | 2μL |
| ddH20 | 20μL |
PCR反应条件为：预变性95℃3min；变性94℃30s，退火60℃30s，延伸72℃3min30s，31循环；延伸：72℃10min，PCR产物的电泳图谱见图6。
引物#50序列为：tatGCGGCCGcgaatttatgttacttggcaga（SEQ ID NO：11）
引物#51序列为：ctttaagatacattgatgagtttg（SEQ ID NO：12）
含HLX01-HC表达单元的PCR扩增产物的基因序列如SEQ ID NO：13所示。
1.1.2.含有外源基因表达单元的pHLX101重组载体的构建
1.1.2.1.酶切
含有HLX01-HC表达单元的PCR产物、含有HLX01-LC表达单元的PCR产物、pHLX101载体的酶切反应体系分别见表7-9。
表7含有HLX01-HC表达单元的PCR产物的酶切反应体系
表8含有HLX01-LC表达单元的PCR产物的酶切反应体系
表9pHLX101载体的酶切反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 10×H缓冲液 | 2μL |
| pHLX101载体 | 12μL |
| NotⅠ | 2μL |
| EcoRV | 2μL |
| BSA | 4μL |
| 总反应体系 | 20μL |
1.1.2.2.连接
HLX01-HC表达单元与pHLX101片断连接的连接反应体系见表10，连接反应温度为16℃，连接过夜。HLX01-LC表达与pHLX101片断连接的连接反应体系见表11，连接反应温度为16℃，连接过夜。
表10连接酶反应体系
| 试剂 | 体积 |
| TaKaRa DNA ligation Kit Ver.2.0 | 5μL |
| HLX01-HC表达单元片段（NotⅠ酶切） | 4μL |
| pHLX101片断（NotⅠ酶切） | 1μL |
表11连接酶反应体系
| 试剂 | 体积 |
| TaKaRa DNA ligation Kit Ver.2.0 | 5μL |
| HLX01-LC表达单元片段（NotⅠ酶切） | 4μL |
| pHLX101片断（NotⅠ与EcoRV酶切） | 1μL |
1.1.2.3.转化
将HLX01-HC表达单元片段与pHLX101片断的连接产物，以及HLX01-LC表达单元的片段与pHLX101片断的连接产物分别转化入大肠杆菌TG1感受态细胞，具体步骤如下：从-80℃取出TG1感受态细胞，冰上放置15分钟溶解；将连接产物加入到感受态细胞中，用枪吹吸混匀；冰上放置30min；42℃水浴90s；冰上放置2min；加入1ml 30℃预热的LB培养基入离心管中；37℃放置1小时；5000g离心5min，弃上清，留少量液体，将细胞重悬后后涂布于Amp抗性的LB平板上，过夜培养。
1.1.2.4.鉴定
挑取单克隆，进行菌落PCR，菌落PCR的引物分别为引物#39与#40（转染含HLX01-LC表达单元的重组质粒）、引物#50与#51（转染含HLX01-HC表达单元的重组质粒）两对引物，阳性菌落用LB培养基培养，并抽取质粒DNA，酶切鉴定并测序，电泳实验结果如图7-8所示，构建的重组质粒pHLX101-HLX01-HC及pHLX101-HLX01-LC的质粒图谱如图9-10所示。
1.2.转染及稳定细胞株筛选
1.2.1.表达的质粒制备
用质粒大量抽提试剂盒分别提取含有重链和轻链目的基因的表达载体质粒pHLX101-HLX01-HC和pHLX101-HLX01-LC，乙醇沉淀DNA，在生物安全柜中自然风干后，用无菌水溶解DNA，用紫外分光光度计在260nm波长下测定DNA浓度。
1.2.2.转染
1.2.2.1.细胞准备
复苏CHO-K1细胞，用含有10%FBS的DMEM/F12培养基培养细胞。
转染前一天，收集处于对数生长期的CHO-K1细胞（5×106Cells/mL），用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤一次，胰蛋白酶消化后，用培养基重悬，调整细胞密度为5×105Cells/mL，分别取2mL细胞悬液，加入到6孔细胞培养板中，过夜培养。
1.2.2.2.转染
对于每一种转染样品，均按如下步骤准备转染混合液：
1）将线性化的pHLX101-HLX01-HC载体及pHLX101-HLX01-LC载体DNA各5μg和250μLOpti-MEM培养基加入无菌的离心管，用移液器轻柔混合，制成混合DNA溶液。
2）将10μL lipofectamin 2000和250μLOpti-MEM培养基加入到无菌离心管中，用移液器轻柔混合，制成脂质体溶液；
3）将上述DNA溶液和脂质体溶液轻轻混合，室温赋予20分钟；
4）将DNA和脂质体混合溶液加入到细胞中。
1.2.3.GS基因瞬时表达测定
转染24个小时后，荧光显微镜下镜检，对照细胞表达GFP的比例约为50%（对照细胞为转染有pcDNA3.1-eGFP的CHO-K1细胞，pcDNA3.1-eGFP质粒购自Invitrogen公司）。转染48h后通过谷氨酰胺合成酶(GS)测试盒（购自南京建成生物工程研究所）测定本发明CHO细胞谷氨酰胺合成酶的表达水平，实验结果见图结果表明，谷氨基酰胺合成酶酶活力为91.5U/mL，为对照细胞的5.1倍。表明本研究所用GS基因及启动子等功能元件能发挥筛选功能。
1.2.4.稳定细胞株筛选
转染48小时后，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤一次，胰蛋白酶消化后，用含有10%FBS的DMEM/F12培养基重悬，并分别按1:3、1:6的比例稀释后置于6孔细胞板中培养。培养24小时后，更换为含有10%DFBS新鲜的DMEM/F12培养基（添加蛋氨酸亚氨基代砜，methionine sulfoximine,MSX,终浓度50μmol）。
每周更换新鲜的DMEM/F12培养基（添加蛋氨酸亚氨基代砜，methionine sulfoximine,MSX,终浓度50μmol）。加压筛选3周后，可观察到实验孔有阳性克隆产生。
当克隆大小长到约0.3cm的直径后，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤一次，胰蛋白酶消化后，用含有10%DFBS的DMEM/F12培养基（MSX终浓度50μmol）重悬，调整细胞密度为1×104Cells/mL，然后取15块96孔半孔细胞培养板，向每个孔中添加50μL上述稀释细胞液；将96孔半孔细胞培养板在二氧化碳培养箱中静置培养10-14天，直到肉眼可以看到克隆为止。当最大的克隆长到大约孔径的1/3时，用定量ELISA方法筛选阳性克隆。通过Elisa定量分析法从中筛选获得表达量约为1.5g/L的阳性克隆2个，同时通过体外活性分析确证了稳定细胞株所表达的HLX01单克隆抗体具有良好的生物活性，这表明该表达***适用于稳定细胞株筛选。
实施例3 CHO细胞基因整合表达***的构建及外源蛋白的表达
1.pHLX101-eGFP表达载体构建及稳定细胞株筛选
1.3.表达载体构建
首先构建eGFP表达单元，该表达单元5’至3’方向依次含有SmaI内切酶识别位点序列、CMV启动子序列（基因序列同Genebank登陆序列：JQ302818.1、AB609714.1、GU937742.1、BK000394.5等序列）、eGFP基因序列（基因序列同Genebank登陆序列：JQ809330.1、JN038403.1、JQ733047.1、AB673329.1等序列）、BGHpA序列（基因序列同Genebank登陆序列：EF437956.1、U90717.1、X90639.1、JF313342.1等序列）以及SmaI内切酶识别位点序列。用SmaI内切酶酶切eGFP表达单元、胶回收制备外源基因表达单元。
eGFP表达单元的基因序列如SEQ ID NO：14所示。
将pHLX101载体用SmaI及XmaI内切酶酶切，酶切后用T4 DNA polymerase处理、胶回收制备了载体片段。
将经过处理的载体及***片段连接，转化DH5α感受态细胞，并挑选阳性克隆，通过PCR鉴定及测序鉴定，获得了pHLX101-eGFP表达载体，pHLX101-eGFP表达载体图谱见图12。
1.4.细胞株筛选
1.4.1.表达载体质粒制备
用质粒大量抽提试剂盒分别提取含eGFP表达单元的质粒，乙醇沉淀DNA，在生物安全柜中自然风干后，用无菌水溶解DNA，用紫外分光光度计在260nm波长下测定DNA浓度。
1.4.2.转染
1）将5μg线性化eGFP表达载体DNA和250μLOpti-MEM培养基加入无菌的离心管，用移液器轻柔混合，制成DNA溶液；
2）将10μL lipofectamin 2000和250μLOpti-MEM培养基加入到无菌离心管中，用移液器轻柔混合，制成脂质体溶液；
3）将上述DNA溶液和脂质体溶液轻轻混合，室温赋予20分钟；
4）将DNA和脂质体混合溶液加入到细胞中。
1.4.3.稳定细胞株筛选
转染48小时后，用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤一次，胰蛋白酶消化后，用含有10%FBS的DMEM/F12培养基重悬，并分别按1:3、1:6的比例稀释后置于6孔细胞板中培养。培养24小时后，更换为含有10%DFBS新鲜的DMEM/F12培养基（添加蛋氨酸亚氨基代砜，methionine sulfoximine,MSX,终浓度50μmol）。
每周更换新鲜的DMEM/F12培养基（添加蛋氨酸亚氨基代砜，methionine sulfoximine,MSX,终浓度50μmol）。加压筛选3周后，可观察到实验孔有阳性克隆产生。
2.外源蛋白的合成
将筛选板置于荧光显微镜下镜检并拍照（见图13），实验结果说明所获得的克隆具有较强的荧光信号，表明pHLX101-eGFP表达载体能用于稳定细胞株筛选，表达外源蛋白。
Claims (12)
1.一种pHLX101真核表达载体，包括GS表达单元，所述GS表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的TK启动子基因序列、谷氨酰胺合成酶基因序列以及SV40 poly A基因序列。
2.如权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述GS表达单元的基因序列如SEQ IDNO:4所示。
3.如权利要求1所述的真核表达载体，其特征在于，所述pHLX101真核表达载体是由pUC19质粒改造获得。
4.如权利要求3所述的真核表达载体，其特征在于，所述pHLX101真核表达载体是在pUC19质粒的SmaI酶切位点和HindⅢ酶切位点之间，***所述GS表达单元构建获得。
5.一种pHLX101-CHO真核表达***，包括权利要求1-4任一权利要求所述的pHLX101真核表达载体以及中国仓鼠卵巢细胞。
6.如权利要求5所述的真核表达***，其特征在于，所述中国仓鼠卵巢细胞为CHO-K1细胞。
7.利用权利要求5或6任一权利要求所述pHLX101-CHO真核表达***制备重组蛋白的方法，步骤如下：
1）重组质粒的构建：将表达重组蛋白的外源基因表达单元***pHLX101真核表达载体，构建获得重组质粒；
2）表达***的筛选：重组质粒转化CHO细胞，筛选稳定表达的细胞株作为pHLX101-CHO真核表达***；
3）采用上一步筛选的pHLX101-CHO真核表达***表达重组蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1）具体为：将表达重组蛋白的外源基因表达单元通过酶切、连接的方法***pHLX101真核表达载体，连接产物转化感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的重组质粒。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1）所述外源基因表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的启动子序列、外源基因序列以及终止信号和polyA加尾信号序列。
10.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤2）具体为：重组质粒转化CHO细胞后，通过MSX进行加压筛选，获得稳定表达的细胞株。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述MSX加压筛选的终浓度为10～100μmol。
12.权利要求1-4任一权利要求所述pHLX101真核表达载体和/或权利要求5-6任一权利要求所述pHLX101-CHO真核表达***在重组蛋白表达中的应用。
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