CN103255096A

CN103255096A - 一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用

Info

Publication number: CN103255096A
Application number: CN2013101833342A
Authority: CN
Inventors: 丁毅; 王书珍
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2013-08-21

Abstract

本发明公开了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用，通过将重组质粒pET-28a-αMC转化到Escherichiacoli的Rosetta(DE3)pLys，可得到一种重组菌株，CCTCC NO.M2013174。该菌株耐Kanamycin和Chloromycetin，在LB液体培养基中生长良好，可以在低浓度IPTG诱导剂诱导的条件下大量合成活性蛋白并积累在细胞质中。本发明的重复性好，可操作性强，价格低廉，因此适合Alpha-苦瓜素蛋白的工业化生产和应用。本工程菌株所表达的Alpha-苦瓜素的产量为115mg/L，经下游纯化后得率为85mg/L，纯度为94.7%，回收率为73.9%。

Description

一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体涉及一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌，同时还涉及一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法和该基因工程菌的用途。不仅适合多种核糖体失活蛋白工程菌的构建，也有利于具活性的核糖体失活蛋白的简易化、规模化生产。该方法也为Alpha-苦瓜素蛋白及其他核糖体失活蛋白在体外的抑菌应用奠定了理论基础。

背景技术

植物在生长过程中会受到环境中各种细菌、真菌、病毒等各种病原菌的侵染。真菌和细菌病害是植物病害中最为严重的一类，占据总数的80%以上，几乎所有的高等生物都受到病原菌的危害。病原菌侵入到植物体内能够引起植物病害，往往导致农作物遭受重大的损失，甚至颗粒无收，因此病原菌对农业生产有着重要的影响。传统的化学药剂的应用常常导致农作物上有药物残留，同时也加剧了病原菌的变异速率和耐药性，因此在植物体中特别是食用植物中寻找广谱、高效、低毒、不耐药的的病原菌抑制剂已经成为国内外研究的热门领域之一。其中，克隆具有广谱抗菌活性的蛋白质基因，并利用基因工程的手段将其导入到植物中培育抗病品种，或者转入大肠杆菌或酵母细胞内生产抗微生物药物，已成为近几年的研究热点。此外，一些多肽抗生素在植物抗病原菌实验中取得了较好的效果。

在长期的进化过程中，植物自身抵抗病原菌的防御体系会合成一些相应的生物分子以拮抗外源侵袭物，而其中能够抑制病原菌生长或杀死病原菌的抗菌蛋白就是最为重要的一类。目前，已经从70多种植物中发现了170多种抗菌蛋白。随着对抗菌蛋白作用机制研究的深入，多个抗菌蛋白基因被鉴定出来，根据植物抗菌蛋白的作用机制、结构和序列特性，可将其大体分为以下几类：病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)、防御素(defensins)、类亲环素蛋白(cyclophilin-like proteins)、核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)、脂质转运蛋白(lipid-transfer proteins,LTPs)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitors)、2S清蛋白类(2S albumin proteins)及其他蛋白。

其中，核糖体失活蛋白的研究历史比较久远，距今已经有一百多年的历史。核糖体失活蛋白起初分别是从蓖麻中提取了蓖麻毒蛋白(ricin)和从相思子(Abrus precatorius)中提取的相思子毒蛋白(abrin)。除了几个真菌和细菌来源的RIPs外，几乎所有的RIPs都来自于高等植物。迄今已经发现了百余种RIPs，其抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤等活性引起了人们的广泛关注。RIPs分为三类：I型RIPs，由相对分子质量为30kDa左右的单肽链组成；II型RIPs，由具有酶活性的RTA链和凝集素活性的RTB链构成；III型RIPs目前只在玉米(Zea mays)和大麦(Hordeum vulgare)中发现，分别为b-32、JIP60，它们在移除了内部的一个短肽片段后，才具有酶活性。起初RIPs的酶活研究主要集中在RNA N-糖苷酶活性上，Endo等人（1988）首先检测到ricin作用在大鼠28S rRNA的α-sarcin/ricin区域(SRL)的GA⁴³²⁴GA序列，通过脱去A⁴³²⁴从而阻止延长因子EF-2与核糖体的结合，进而抑制蛋白质的生物合成。这个结论得到Stirpe等人的推广，认为所有具有RNA N-糖苷酶活性的RIPs都有类似的作用。此外，RIPs还被检测到具有脂肪酶活性、几丁质酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、磷酸酶活性、DNA糖基化酶活性，以及超螺旋DNA的解旋酶等活性。在20世纪20年代，人们将美洲商陆(Phytolacca heterotepala)叶子的粗提物擦拭在植物的表面作为抑制病毒的试剂进行检测。实验成功后，大量的生物技术试验证明了RIPs是植物防御病原菌的重要工具。目前，所有已发现的I型RIPs对植物、真菌、动物病毒均显示出广谱的抗菌活性，部分II型RIPs亦表现出此性质。RIPs的转基因植物（烟草、小麦、水稻、玉米等）均表现出较强的抗病毒活性。此外，部分RIPs在抗肿瘤细胞、HIV感染细胞、骨髓瘤细胞、破骨细胞分化、骨免疫学方面均显示出广范的应用前景。

Alpha-苦瓜素蛋白是从葫芦科植物苦瓜的籽内分离出来的I型RIP，具有广谱的抗肿瘤、抗病毒、抗菌作用，也可以抑制肿瘤细胞的增长并诱发肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无不良反应。传统的Alpha-苦瓜素蛋白分离技术依赖于硫酸铵沉淀、离子交换层析、分子筛层析、亲和层析、凝胶过滤等多种技术的综合，纯化步骤繁琐、周期长、成本较高，并且该方法受制于苦瓜种子的产量和季节的限制。此外，繁琐的纯化步骤容易导致蛋白质的大量损失，同时也会影响到Alpha-苦瓜素蛋白的酶活性。改进的提取方法包括HPLC层析和离子交换柱层析相结合，但是对高端的HPLC仪器设备要求比较高。Jesada Pitipanapong等人在2007年采用HPLC泵、高温烤箱、不锈钢抽提管、压力表和压力调节器等***组合，在400℃高温高压下提取苦瓜素，虽然得到了较高的提取率，但产生了大量的环境污染物，而且对仪器要求更为严格，不利于大规模的提取。传统的蛋白质提取方法限制了Alpha-苦瓜素蛋白在科学研究和农业上的大规模应用。原核表达技术不仅能够大量合成目的蛋白，也能通过密码子优化得到多种修饰蛋白，生产周期短，并且价格低廉，适合大规模工业化生产。

MAP30、curcin2、luffin-a等多种RIPs已经被克隆和表达，其活性实验显示原核***重组表达的RIPs与天然来源的RIPs活性基本上一致，这就为多功能性RIPs的原核重组表达奠定了理论基础。大肠杆菌不同株系的分离纯化以及如pET载体在内的多种表达载体的构建为RIPs的原核表达提供了技术基础。RIPs原核工程菌的构建不仅利于蛋白的规模化生产，也将进一步拓展其在科学研究和农业生产上的应用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌，该菌能够在优化出来的诱导条件下大量表达具有活性的Alpha-苦瓜素蛋白，并且绝大部分表达蛋白在菌体的细胞质内积累。该菌已于2013年5月6日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-28a-αMC，CCTCC NO.M2013174，地址：中国武汉武汉大学。表达的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还有一个目的是在于提供了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法，方法简单，易行，适于大规模生产。

本发明最后一个目的是在于提供了一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的应用。利用该菌大量表达具有活性的Alpha-苦瓜素蛋白，该重组的Alpha-苦瓜素蛋白能够显著抑制真菌茄病镰刀菌（Fusarium solani L.）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum L.），以及细菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa L.）的生长和增殖。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明构建了Alpha-苦瓜素蛋白的原核工程菌株并检测重组Alpha-苦瓜素蛋白的抗菌活性。通过分子克隆技术构建了Alpha-苦瓜素蛋白的工程菌株，并优化了重组蛋白的表达条件，得到了可以使蛋白以可溶的形式在菌体细胞质内积累的条件。本工程菌不仅适合大规模纯化Alpha-苦瓜素蛋白，也利于对Alpha-苦瓜素蛋白的深入研究以及应用，同时也为其他核糖体失活蛋白的合成以及研究提供了技术参考。

依据NCBI数据库内关于Alpha-苦瓜素蛋白的序列信息，采用Primer5.0软件设计引物，从苦瓜基因组DNA内扩增出Alpha-苦瓜素蛋白的开放读码框，经过双酶酶切后与pET-28(a)载体连接构成重组载体pET-MC；用密码子软件分析Alpha-苦瓜素蛋白基因的密码子特征，并挑选出适合度比较高的菌株Rosetta(DE3)pLysS进行转化以构建工程菌株；Blast序列比对后挑选出正确的重组子克隆；单因素分析法设置菌体生长的条件梯度，筛选出最优化的蛋白质诱导条件；扩大培养体积，按照优化的条件组合诱导蛋白质的合成，经亲和层析纯化后冷冻干燥保存；检测蛋白质的抑菌活性。

一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法，其步骤是：

第一部分：Alpha-苦瓜素蛋白工程菌的构建：

(1)Alpha-苦瓜素蛋白的引物合成。从NCBI数据库内下载由Ho等人于1991年上传的α-苦瓜素cDNA序列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/19527），分析其成熟肽片段，并采用Primer5.0设计扩增Alpha-苦瓜素蛋白的引物：上游引物MCF:

下游引物MCR：

其中加框的分别是限制性内切酶EcoR I、Xho I的酶切位点，酶切位点上游是3个酶切位点保护碱基，有下划线且加粗的位点分别表示第一个密码子和终止密码子。

(2)Alpha-苦瓜素蛋白成熟肽基因片段的获得。15μL的PCR体系包括：50ng基因组DNA、1.5μL10×pfu buffer、0.4μM引物组合、1.5mM MgCl₂、250μL dNTPs，以及0.5U pfu DNA聚合酶；PCR反应条件为：95°C预变性5min，30个PCR循环（94°C变性1min，51°C退火1min，72°C延伸1min），最后72°C条件下延伸7min；PCR产物用1%（w/v）琼脂糖凝胶检测（图1），并且采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。

(3)重组质粒的构建。采用EcoR I、Xho I双酶切：18μL PCR产物或pET-28a(+)质粒（30μg/ml）、1μL EcoR I（2.5U/μL，NEB）、1μL Xho I（2.5U/μL，NEB）、2μL10×H buffer，混匀后于37°C条件下温育6h；0.8%（w/v）的琼脂糖检测后回收目的片段。将回收的基因片段与pET-28a(+)经T4DNA连接酶连接，连接体系为：1μL酶切回收DNA片段（5nmol）、8μL酶切的pET-28a(+)载体（30nmol）、1μL T4DNA连接酶（20U）、1μL10×T4Ligase Buffer，于16°C低温恒温槽内处理6h，构建重组表达质粒pET-MC（图2）。

(4)阳性克隆子的构建。用密码子分析软件（https://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare _codon_analysis）分析Alpha-苦瓜素蛋白的序列信息（图3），确定苦瓜素基因适合的表达菌株为Rosetta(DE3)pLysS；将重组质粒pET-MC转化到Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞中，在含有Kanamycin和Chloromycetin的筛选培养基上筛选阳性克隆子，经菌液PCR扩增检测以及质粒提取后酶切验证，筛选出阳性重组子，进一步测序验证得到含有正确读码框的克隆子。

至此得到了一种能高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的的基因工程菌，该细菌已于2013年5月6日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-28a-αMC，CCTCC NO.M2013174。

该菌株是好氧及兼性厌氧型的，两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌，周身鞭毛、能运动且不具有芽孢。该工程菌可以用富含50μg/mL Kanamycin的LB固体和液体培养基进行培养，并且能够在37°C条件下快速生长，而在28°C条件下高效表达出积累在菌体细胞质内的重组Alpha-苦瓜素蛋白。

(5)蛋白诱导表达培养条件的优化。通过设置不同的培养时间（6、8、10、12、14、18h）、诱导剂加入后的培养温度（22°C、25°C、28°C、30°C、35°C、37°C）、诱导剂IPTG的浓度（0.5、0.75、1.0、1.25、1.5mM）、诱导时OD₆₀₀值（0.5、0.6、0.7、0.8）等培养条件梯度，并收集不同诱导条件下的菌体溶液。SDS-PAGE分析各种条件下培养的菌体内Alpha-苦瓜素蛋白的表达情况以确定最优的表达条件。

(6)蛋白质分离和纯化。扩大菌体培养体积至1L，在最优的表达条件下(当OD₆₀₀为0.6时加入0.75mM IPTG，在28°C培养条件下培养10h)诱导Alpha-苦瓜素蛋白的表达，12,000g离心10min收集菌体，并用50mL预冷的PBS重悬。在-78°C（30min）和37°C（30min）两个温度条件下反复冻融菌体细胞5次，恒功率超声破碎细胞（10mL/次，45W，15min，间隔10s），12,000g再次离心10min收集包含目的重组蛋白的菌体上清液，此时得到的蛋白浓度为115mg/L。

经Ni-NTA亲和层析纯化蛋白：按每40mg重组Alpha-苦瓜素采用1mL的Ni-NTA树脂的比例取适量的树脂进行装柱；用6倍Ni-NTA树脂柱体积的结合缓冲液（20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.8）平衡Ni-NTA柱子后将菌体上清液反复过柱3次；先用6倍树脂柱体积的结合缓冲液和4倍树脂柱体积的洗脱缓冲液（20mM PBS，0.5M NaCl，pH6.0）分别洗脱未结合的杂蛋白；再用5倍树脂柱体积浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液（10mM、25mM、50mM、75mM、100mM、150mM）逐次洗脱结合程度较低的杂蛋白；最后用5倍树脂柱体积富含175mM、200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱重组的Alpha-苦瓜素蛋白。将目的蛋白组分装入到处理过的透析袋（直径22mm，分子截留量14kDa）内用去离子水透析除去盐离子和小分子咪唑，4°C条件下每4h换一次水，共透析24h。透析过的蛋白质溶液用PEG20000进行浓缩至水分减少至原体积的10%左右。收集透析袋内的高浓度蛋白质溶液，分装至灭菌的1.5mL EP管内冷冻干燥除去剩余的水分，得到Alpha-苦瓜素蛋白干粉，于-78°C保存备用。

一种利用高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌制得的蛋白在抗菌中的应用，其过程是：

(1)抗真菌活性检测。将真菌菌种茄病镰刀菌（F.solani，CCTCC，AF93239）和尖孢镰刀菌（F.oxysporum，CCTCC，AF93230）在PDA斜面培养基上复苏48h，然后从斜面培养基的边缘挑取健壮的菌丝块接种在PDA平板培养基上进行继代培养。待真菌菌斑面积占据平板的50%时，在菌斑外边缘0.5cm的位置放置含有0μg、0.1μg、0.2μg、0.4μgAlpha-苦瓜素蛋白的滤纸片（直径为1cm），继续培养24h后观察抑菌圈的形成（图4）。在PDA培养基上培养F.solani和F.oxysporum真菌5-7天，然后用灭菌水收集孢子并调整至浓度为2×10⁴孢子/mL的菌悬液；用PD液体培养基培养F.solani和F.oxysporum的孢子至对数生长期，然后加入Alpha-苦瓜素蛋白至终浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，37°C条件下温育30min；分别取5μL不同浓度的Alpha-苦瓜素蛋白处理过的F.solani菌液取接种在PDA平板中央，于28°C条件下进行培养并观察蛋白对真菌的生长抑制情况（24h、48h、72h）。

(2)抗细菌活性检测。在无抗生素的LB固体平板上活化铜绿假单胞菌（P.aeruginosa细菌菌株）12h，挑取单克隆并用无抗生素的LB液体培养基在37°C条件下培养6h得到长势旺盛的对数期菌体细胞，然后调整浓度得到1.0-2.0×10⁵细胞/mL的细菌悬液。制备含有不同浓度Alpha-苦瓜素蛋白(0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL）的LB平板，然后将2μL活化的铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）细菌悬液（1.0-2.0×10⁵细胞/mL)涂布在平板上，37°C培养12h后统计菌落形成单位（colony-forming units，CFUs)；观察α-苦瓜素蛋白的抑菌效果，结果见表1。

表1Alpha-苦瓜素蛋白对细菌P.aeruginosa的抑制效果。

与现有技术相比，具有以下优点：

1.Escherichia coli Rosetta(DE3)/pET-28a-αMC工程菌株是将重组质粒pET-28a-αMC转化到Escherichia coli的Rosetta(DE3)pLys菌株内得到的，不仅具有耐Kanamycin的抗性，也能够耐受抗生素Chloromycetin。此外，该工程菌株可以在低浓度IPTG诱导剂诱导的条件下表达重组蛋白。

2.现有的纯化Alpha-苦瓜素蛋白的方法是通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、分子筛层析、亲和层析、凝胶过滤等多种技术的综合得到的，纯化步骤繁琐、周期长、成本较高，并且该方法受制于苦瓜种子的产量和季节的限制。本发明所构建的工程菌能够在LB液体培养基中生长良好，可以在优化的条件下大量合成活性蛋白并积累在细胞质中，通过简便的亲和纯化技术可以快速分离出目的蛋白。本发明的重复性好，可操作性强，价格低廉，不受季节和苦瓜产量的限制，因此适合Alpha-苦瓜素蛋白的工业化生产和应用。

3.本发明所得到的重组Alpha-苦瓜素蛋白的活性与从苦瓜果实和种子中提取出来的Alpha-苦瓜素活性相当。本工程菌株所表达的Alpha-苦瓜素的产量为115mg/L，经下游纯化后得率为85mg/L，纯度为94.7%，回收率为73.9%。

4.适用范围广。本发明适用于多数对细胞有毒害作用的蛋白在原核体系内的表达也比较适合于密码子偏好型较强的蛋白质的表达。

5.操作简便。本发明使用的仪器和试剂都是分子生物学实验室常规的，操作性比较强；所采用的技术都是《分子克隆实验指南》上详细阐述的，技术比较长成熟，难度系数也比较小；所用的常规技术很多学者都比较熟悉，便于交流合作；实验的可重复性好，灵敏度较高，而且结果也比较可靠。

6.性价比高。本发明对试剂要求比较低，大规模的菌体培养只需要提供胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl即可；而蛋白质的诱导只需要毫摩尔级别的IPTG即可；蛋白质的提取只需要采用Ni-NTA树脂亲和层析，该树脂可以重复利用多次，还可以采用常规的试剂进行树脂的再生，理论上可以无限制的使用。

7.实际应用性强。本发明提供了Alpha-苦瓜素蛋白的具体应用实例，不仅为RIPs家族蛋白的后续科学研究提供了技术和理论基础，同时也为Alpha-苦瓜素蛋白的体外抗菌药剂的研发以及转基因植株的构建提供了依据。

附图说明

图1为一种Alpha-苦瓜素蛋白基因的扩增示意图。

用高保真的pfu DNA聚合酶扩增基因组得到Alpha-苦瓜素蛋白成熟肽目的片段的琼脂糖凝胶检测结果，左侧的“M”则是DNA分子量marker(东盛生物技术公司)；右侧的则是PCR扩增的单一性产物。

图2为一种Alpha-苦瓜素蛋白重组质粒的构建示意图。

图3为一种Alpha-苦瓜素蛋白基因的密码子分布情况分析表。

图3显示了在线密码子分析软件（https://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis）对Alpha-苦瓜素蛋白密码子的分析结果：横坐标代表了基因的密码子在宿主中的使用率，而纵坐标表示的是在宿主菌中使用频率在特定范围的密码子所占的比率；其中“100”指的是在宿主菌中对特定的氨基酸使用频率最高的密码子，而小于“30”的密码子则被认为是在宿主菌中使用频率较低的稀有密码子。

图4为一种Alpha-苦瓜素蛋白对F.solani和F.oxysporum的抑制作用示意图。

图4显示的是Alpha-苦瓜素蛋白对F.solani和F.oxysporum的生长抑制作用：“Control”只含有10μL PBS缓冲液；“A”、“B”、“C”则包含0.1μg、0.2μg、0.4μg的Alpha-苦瓜素蛋白。

图5为一种Alpha-苦瓜素蛋白处理过的F.solani菌的生长状态示意图。

图5显示的是用Alpha-苦瓜素蛋白处理过的F.solani的生长和形态学的改变，3个平板分别是经0μg/mL(“Control”)、20μg/mL(“A”)、40μg/mL(“B”)的Alpha-苦瓜素蛋白处理的F.solani菌液重新涂布平板后24h、48h、72h后的生长状况。

具体实施方式

本发明所采用的实验条件和方法参照相关试剂公司的说明书或者是《分子克隆实验指南（第三版）》（萨姆布鲁克等主编，2001）。

实施例1：

一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法，其步骤如下：

下游引物MCR：

其中加框的分别是限制性内切酶EcoR I、Xho I的酶切位点，酶切位点上游是3个酶切位点保护碱基，有下划线且加粗的位点分别表示第一个密码子和终止密码子位点。

(2)Alpha-苦瓜素蛋白基因成熟肽基因片段的获得。5μL的PCR反应体系包括：50ng基因组DNA、1.5μL10×pfu buffer、0.4μM引物组合、1.5mM MgCl₂、250μl dNTPs，以及0.5U pfu DNA聚合酶；PCR反应条件为：95°C预变性5min，30个PCR循环（94°C变性1min，51°C退火1min，72°C延伸1min），最后72°C条件下延伸7min；PCR产物用1%(w/v)琼脂糖凝胶检测（附图1），并且采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。

(3)重组质粒的构建。采用EcoR I、Xho I双酶切：18μL PCR产物或pET-28a(+)质粒（30μg/ml）、1μL EcoR I（2.5U/μL，NEB）、1μL Xho I（2.5U/μL，NEB）、2μL10×H buffer，混匀后于37°C条件下温育6h；0.8%的琼脂糖检测后回收目的片段。将回收的基因片段与pET-28a(+)经T4DNA连接酶连接，连接体系为：1μL酶切回收DNA片段（5nmol）、8μL酶切的pET-28a(+)载体（30nmol）、1μL T4DNA连接酶（20U）、1μL10×T4Ligase Buffer，于16°C低温恒温槽内处理6h，构建重组表达质粒pET-MC（图2）。

(4)阳性克隆子的构建。用密码子分析软件（https://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis）分析Alpha-苦瓜素蛋白的序列信息（图3），确定苦瓜素基因适合的表达菌株为Rosetta(DE3)pLysS；将重组质粒pET-MC转化到Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞中，在含有Kanamycin的筛选培养基上筛选阳性克隆子，经菌液PCR扩增检测以及质粒提取后酶切验证，筛选出阳性重组子，进一步测序验证得到含有正确读码框的克隆子。

实施例2：

Alpha-苦瓜素蛋白的诱导及纯化：

(1)蛋白诱导表达培养条件的优化。通过设置不同的培养时间（6、8、10、12、14、18h）、诱导剂加入后的培养温度（22°C、25°C、28°C、30°C、35°C、37°C）、诱导剂IPTG的浓度（0.5、0.75、1.0、1.25、1.5mM）、诱导时OD值（0.5、0.6、0.7、0.8）等培养条件梯度，并收集不同诱导条件下的菌体溶液。SDS-PAGE分析各种条件下培养的菌体内Alpha-苦瓜素蛋白的表达情况以确定最优的表达条件。蛋白的最佳表达条件是当菌体浓度即OD600达到0.6时加入IPTG至终浓度为0.75mM，然后在28°C培养条件下继续培养菌体10h。

(2)蛋白质分离和纯化。扩大菌体培养体积至1L，在最优的表达条件下(当OD600为0.6时加入0.75mM IPTG，在28°C培养条件下培养10h，诱导Alpha-苦瓜素蛋白的表达，12,000g离心10min收集菌体，并用50mL预冷的PBS重悬。在-78°C（30min）和37°C（30min）两个温度条件下反复冻融菌体细胞5次，恒功率超声破碎细胞（10mL/次，45W，15min，间隔10s），12,000g再次离心10min收集包含目的蛋白的菌体上清液。

经Ni-NTA亲和层析纯化蛋白：按照每40mg重组Alpha-苦瓜素使用1mL的Ni-NTA树脂的比例取适量的树脂进行装柱；用6倍Ni-NTA树脂体积的结合缓冲液（20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.8）平衡Ni-NTA柱子后将蛋白质上清液反复过柱3次；先用6倍树脂柱体积的结合缓冲液和4倍树脂柱体积的洗脱缓冲液（20mM PBS，0.5M NaCl，pH6.0）分别洗脱未结合的杂蛋白；再用5倍树脂柱体积浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液（10mM、25mM、50mM、75mM、100mM、150mM）逐次洗脱结合程度较低的杂蛋白；最后用5倍树脂柱体积富含175mM、200mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱重组的Alpha-苦瓜素蛋白。将目的蛋白组分装入到透析袋（直径22mm，分子截留量14kDa）内用去离子水透析除去盐离子和小分子咪唑，4°C条件下每4h换一次水，共透析24h。透析过的蛋白质溶液用PEG20000进行浓缩至水分减少至原体积10%左右。收集透析袋内的高浓度蛋白质溶液，此时将得到的Alpha-苦瓜素蛋白溶液分装至灭菌的1.5mL EP管内冷冻干燥去除剩余的水分，得到Alpha-苦瓜素蛋白干粉，于-78°C保存备用。对全菌的SDS-PAGE分析发现重组的Alpha-苦瓜素蛋白在菌体内的浓度为115mg/L菌液，而最终得到的蛋白量是85mg/L菌液，回收率为70±3.9%。

实施例3：

(1)将真菌菌种茄病镰刀菌（F.solani）和尖孢镰刀菌（F.oxysporum）在PDA斜面培养基上复苏48h；

(2)从斜面培养基的边缘挑取健壮的菌丝块接种在PDA平板培养基上进行继代培养；

(3)待菌斑面积占据平板的50%时在菌斑外边缘0.5cm的位置分别放置含有0μg、0.1μg、0.2μg、0.4μg的Alpha-苦瓜素蛋白的滤纸片（直径为1cm），24h后观察抑菌现象，发现随着蛋白浓度的增加抑菌圈是逐渐增大的；

(4)在PDA培养基上培养F.solani和F.oxysporum真菌5-7天，然后用灭菌水收集孢子并调整至浓度为2×10⁴孢子/mL的菌悬液；

(5)用PD液体培养基培养F.solani和F.oxysporum的孢子至对数生长期，然后加入Alpha-苦瓜素蛋白至终浓度为0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，37°C条件下温育30min；

(6)分别取5μL用0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的Alpha-苦瓜素蛋白处理过的F.solani菌液取接种在PDA平板中央，于28°C条件下进行培养，24h、48h、72h后观察蛋白对真菌的生长抑制情况；

结果发现与对照菌丝（0μg/mL的Alpha-苦瓜素）相比，Alpha-苦瓜素蛋白不仅能够影响F.solani菌丝的生长和增殖，也能够影响菌体的形态特征，低浓度的Alpha-苦瓜素（20μg/mL）只部分影响了菌体的形态结构，但是高浓度的Alpha-苦瓜素却完全影响了菌体的内部结构；

实施例4：

一种利用高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌制得的蛋白在抗菌中的应用：其过程是：

(1)在无任何抗生素的LB固体平板上活化铜绿假单胞菌（P.aeruginosa细菌菌株）12h；

(2)挑取单克隆并用LB液体培养基在37°C条件下培养6h得到长势旺盛的对数期菌体细胞，调整细胞浓度得到浓度为1.0-2.0×10⁵细胞/mL的菌悬液；

(3)制备含有不同α-苦瓜素蛋白浓度(0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL）的平板；

(4)将2μL菌悬液涂布在平板上，每个平板重复3次以上；

(5)在37°C条件下培养12h，然后统计菌落形成单位（colony-forming units，CFUs)，与含有416±10个CFUs的对照相比，含有10μg/mL的Alpha-苦瓜素蛋白的平板上含有248±18个CFUs，而含有50μg/mL的Alpha-苦瓜素蛋白的平板上只含有56±7个CFUs。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用

<130> 一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 苦瓜

<400> 1

Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Asp Pro Arg Ser Tyr Gly Met

1 5 10 15

Phe Ile Lys Asp Leu Arg Asn Ala Leu Pro Phe Arg Glu Lys Val Tyr

20 25 30

Asn Ile Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Ala Gly Arg Tyr Leu

35 40 45

Leu Met His Leu Phe Asn Tyr Asp Gly Lys Thr Ile Thr Val Ala Val

50 55 60

Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Ala Asp Thr Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Phe Phe Asn Glu Pro Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Tyr Val Phe

85 90 95

Arg Asp Ala Arg Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu

100 105 110

Arg Leu Gln Ile Ala Ala Gly Lys Pro Arg Glu Lys Ile Pro Ile Gly

115 120 125

Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Ser Thr Leu Leu His Tyr Asp Ser

130 135 140

Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Thr Thr Ala Glu

145 150 155 160

Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gln Gln Ile Gln Glu Arg Ala Tyr

165 170 175

Arg Asp Glu Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp

180 185 190

Ser Gly Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Gly Asn Asn Gly Ile

195 200 205

Phe Arg Thr Pro Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Gly Asn Arg Val Gln

210 215 220

Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val Thr Ser Asn Ile Gln Leu Leu

225 230 235 240

Leu Asn Thr Arg Asn Ile Ala Glu Gly Asp Asn Gly Asp Val Ser Thr

245 250 255

Thr His Gly Phe Ser Ser Tyr

260

<210> 2

<211> 1044

<212> DNA

<213> 苦瓜

<400> 2

aattccctgt gaaagatgag tagattctca gttctctcat ttctaattct cgcaatcttc 60

cttggaggtt ctattgtcaa aggcgatgtt agctttcgtt tgtcgggtgc tgatcctaga 120

tcctatggga tgttcatcaa agatttgagg aatgctcttc catttcgaga gaaagtgtac 180

aatatacctc tcttacttcc ttccgtttca ggagcaggac gatacttact aatgcatctc 240

ttcaattacg acggaaaaac catcacagtg gccgtagatg taacaaacgt ttacattatg 300

ggctatcttg ccgatacaac atcctacttt tttaacgagc ctgctgctga attagcttct 360

caatatgtat tccgagacgc taggaggaag attacacttc catattctgg caattacgaa 420

aggcttcaaa ttgctgcagg caagccaaga gaaaaaatcc ccattggact cccagcgttg 480

gatagtgcaa taagcacctt gctgcattat gactccacag ctgccgctgg ggcactgctt 540

gtactcattc agaccactgc ggaggctgcg agatttaagt atattgagca acaaattcaa 600

gaaagagctt acagagacga ggtcccgagt ctagcaacta taagtttaga aaacagttgg 660

tctggtctct ccaaacaaat ccagttagcg cagggcaata atggaatatt tagaactcct 720

attgtgcttg tggataacaa aggaaatcga gtccagataa ccaacgttac ttcaaaagtt 780

gtaacctcca acatacagtt attgttaaac acacgaaata ttgcagaggg tgacaacggc 840

gatgtttcta caacacatgg cttttcgagc tactagaatg ccctaaagat ggtgaatatg 900

gaaaatatgt tacaactttg aggtagcaac tacaactcca cttgaagaat aatgttcctt 960

cgatgctttg taagtgtgtt ttatttccct ttatcaataa aaaaatgtgg aaccttttaa 1020

tgctttcaaa aaaaaaaaaa aaaa 1044

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于：大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3) / pET-28a-αMC，CCTCC NO.M2013174。

2.权利要求1所述的一种基因工程菌表达的蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求2所述的一种蛋白的制备方法，其步骤是：

1）液体培养细菌体积至1 L，当OD600为0.6时加入0.75 mM IPTG，在28°C培养条件下培养10 h诱导Alpha-苦瓜素蛋白的表达，12,000g离心10 min收集菌体，并用50 mL预冷的PBS重悬；

所述的细菌为：大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3) / pET-28a-αMC，CCTCC NO.M2013174；培养基为含50 μg/mL Kanamycin的LB液体培养基；

2）在-78°C 30 min和37°C 30 min两个温度条件下反复冻融菌体细胞5次，按照10 mL/次，45 W，15 min，间隔10 s的条件对菌体进行超声破碎，12,000g再次离心10 min，收集包含115 mg/L的Alpha-苦瓜素蛋白的菌体上清液；

3）经Ni-NTA亲和层析纯化蛋白：按照每40 mg重组Alpha-苦瓜素蛋白使用1 mL的Ni-NTA树脂的比例取适量的树脂进行装柱；用含20 mM PBS，0.5 M NaCl，pH 7.8的结合缓冲液平衡Ni-NTA柱子后将菌体上清液反复过柱3次；先用6倍柱体积的结合缓冲液和4倍柱体积的含20 mM PBS，0.5 M NaCl，pH 6.0的洗脱缓冲液分别洗脱未结合的杂蛋白；再用5倍体积浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液逐次洗脱结合程度较低的杂蛋白；最后用5倍体积含175 mM、200 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱与Ni-NTA树脂结合的Alpha-苦瓜素蛋白；

所述的浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液其浓度分别为：10 mM；25 mM；50 mM；75 mM；100 mM；和150 mM；

4）将洗脱下来的目的蛋白装入到直径 22 mm，分子截留量14 kDa的透析袋内，在4°C条件下用去离子水透析除去盐离子和小分子咪唑，每4 h换一次水，透析24 h；

5）透析过的蛋白质溶液用PEG20000进行浓缩至水分减少至原体积的10%，收集透析袋内的高浓度蛋白质溶液，分装至灭菌的1.5 mL EP管内冷冻干燥法除去剩余的水分，得到Alpha-苦瓜素蛋白干粉，于-78°C保存备用。

4.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制茄病镰刀菌生长中的应用。

5.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制尖孢镰刀菌生长中的应用。

6.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制铜绿假单胞菌生长中的应用。