CN113699118A - 一种杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 - Google Patents

一种杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用，所述杂交瘤细胞株1C10 1E3，已依次于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22342。该细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价为1:11259000，所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry3A蛋白及转基因玉米中的内源Cry3A蛋白，分泌抗Cry3A抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。

Description

一种杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及到一种杂交瘤细胞株1C10 1E3及其 产生的抗体和应用。
背景技术
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性 菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照 氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ-内毒素。其中Cry蛋白对多种 有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒 性。Cry毒素已经被转入农作物使其具有抗虫性。Cry3A蛋白是Cry毒素中 的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。
转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满 足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜 在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过 敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研 究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费 者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转 基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的 进一步研究。为了对转基因作物及其衍生物中Cry3A蛋白进行快速分析，研 究并得到抗Cry3A蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株1C10 1E3及其产生的抗体和制 备方法，其分泌的单抗为实现抗虫蛋白Cry3A在转基因作物中的检测奠定基 础。
为实现上述目的，本发明提供了一种杂交瘤细胞株1C10 1E3，该杂交瘤 细胞株已于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，分类命名：Cry3A单抗杂交瘤细胞株，保藏地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.22342。
该杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
a)通过原核表达得到Cry3A重组蛋白；
b)免疫动物：将Cry3A重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检 测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
上述制备方法在一种实施方式中，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例 为1:5-1:10。
本发明还提供了上述杂交瘤细胞株1C10 1E3所产生的单克隆抗体，杂交 瘤细胞株1C10 1E3所产生的单克隆抗体的类型为IgG2b。上述单克隆抗体通 过间接ELISA检测所得到的效价依次为1:11259000。
本发明的单克隆抗体的制备方法包括将杂交瘤细胞株1C10 1E3接种到小 鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆 抗体。
本发明提供的单克隆抗体的可变区序列如下表1所示。
表1
Figure BDA0003285392620000021
Figure BDA0003285392620000031
本发明还提供了上述单克隆抗体在检测Cry3A抗虫蛋白中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请利用工程菌株表达、 纯化得到的高纯度抗虫蛋白Cry3A作为抗原，通过杂交瘤技术制备了1株分 泌抗Cry3A的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株1C10 1E3，所述细胞株分泌单 抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价为1:11259000，抗体亚型为IgG2b， 所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry3A蛋白及转基因玉米中的内源 Cry3A蛋白，分泌抗Cry3A抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因 作物中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
附图说明
图1是本发明的Cry3A重组蛋白SDS-PAGE电泳结果图；
图2是本发明的Cry3A重组蛋白单抗筛选western结果图；
图3是本发明的杂交瘤细胞株1C10 1E3纯化的单克隆抗体的SDS-PAGE 电泳结果图；
图4是本发明的杂交瘤细胞株1C10 1E3所产生的单克隆抗体滴度；
图5是本发明的杂交瘤细胞株1C10 1E3所产生的单克隆抗体特异性检测 Cry3A重组蛋白和转基因玉米中的Cry3A Western结果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本 发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可 购得。
实施例1杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
1.免疫抗原的制备
1.1重组蛋白Cry3A表达菌株构建、菌体培养及裂解
Cry3A编码基因扩增：以转基因玉米基因组DNA为模板，用高保真Fastpfu 以下表1的引物进行PCR扩增.
表1
Cry3A-NdeI F gcagc CATATGACGGCCGACAACAACACC SEQ ID NO.3
Cry3A-SalI R cacaca ctcgag CTAGTTCACG GGGATGAACT C SEQ ID NO.4
扩增到的PCR产物经(1.0％)琼脂糖凝胶电泳鉴定后，酶切、连接到 pET28a质粒，转化Trans10感受态细胞(北京全式金)，挑取克隆，进行菌 落PCR鉴定，阳性克隆由北京六合华大基因公司进行测序。
将鉴定正确的重组表达载体pET28a-Cry3A转化大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培 养。次日在平板上挑取单克隆接种含相同浓度卡那霉素的液体LB培养基中， 于37℃过夜培养。所得的表达菌株菌液与50％的甘油溶液等体积混匀，于 -80℃冻藏。
将保存的重组蛋白Cry3A表达菌株复苏培养，菌液涂布于含卡那霉素的 LB平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆接种液体LB(含卡那霉素)培养基 中37℃过夜培养。第二天以1％接种量接种，于37℃培养至OD600为0.8左右， 加入IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白。诱导结束将菌液冰浴，于4℃，4000rpm， 10min离心收集菌体，弃上清，菌体经PBS洗涤后用裂解液悬浮；超声破碎 (2s on/4s off，Amp：45％，Time：3min)；4℃15000rpm离心1hr，收集上清。
1.2重组蛋白纯化
菌体裂解液上清与经裂解液平衡的Ni Sepharose 6FF Beads(GE Healthcare)混合，于4℃结合2-3hrs，3000rpm离心3min弃上清；已结合蛋白 的Ni Sepharose 6FF beads经清洗液洗2-3次；再用洗脱液洗脱。收集洗脱液 即为蛋白粗纯溶液。
将亲和纯化得到的蛋白样品透析至蛋白储存溶液，并用经相同溶液平衡 的Superdex 200Increase 10/30GL(GE Healthcare)进一步纯化，收集蛋白峰组 分并经SDS-PAGE检测蛋白样品的纯度，通过图1可得，经过凝胶过滤最后 获得电泳纯的Cry3A蛋白，分子量约为70kDa。
2.免疫动物
用步骤1.2质控合格的Cry3A重组蛋白作为抗原免疫8只8周龄的SPF 级BALB/c雌性小鼠(购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号： SCXK(鄂)2015-0018)，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)和不完全弗氏佐 剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫， 2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000 后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μL的PBS中，具 体免疫次数及免疫剂量如表2所示。
表2免疫次数及免疫剂量
Figure BDA0003285392620000051
Figure BDA0003285392620000061
免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于PBS，然后与佐剂按体积1:1混合。
3.细胞融合
末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于 对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)， 50％PEG1450作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再 用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先 准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO2，37℃下培养。
4.细胞建株
1)融合板检测：
待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在 ELISA质控合格(即阴性对照OD450<0.2，阳性对照OD450>1.0)后挑选阳性 孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。
2)亚克隆方法及检测：
挑出融合板中检测阳性值高(OD450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板60％ 的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限 稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分 泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。
3)细胞株建立：
将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔 板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及western-blotting 验证其稳定性，通过图2可知，Cry3A单抗杂交瘤细胞株1C10 1E3分泌的 单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Cry3A，收集细胞扩大于10cm培养 皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出OD450>2.0的2株细胞 株培养于细胞瓶中，进行冻存，即杂交瘤细胞株1C10 1E3，已依次于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏编号依次为CGMCC No.22342。
4)细胞株冻存鉴定在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴 定，鉴定标准：
①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株； ③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体 等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺 板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清 也需作ELISA(OD450>2.0)，以确定是否分泌阳性抗体的同时做 western-blotting的鉴定，通过图5可知，Cry3A单抗杂交瘤细胞株1C101E3 分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白Cry3A。
5.制备腹水
先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将杂交瘤细胞株 1C10 1E3接种到小鼠腹腔中，细胞定株后扩大培养选用10％胎牛血清培养 基，当细胞密度达到以1×106-2×106/mL时，800rpm离心，收集沉淀，并用 PBS重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备 纯化。
6.抗体纯化
收集后的腹水经过预处理后选用Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步 骤如下：
1)缓冲液：起始缓冲液为pH7.0，20mM磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.7 0.1mM甘氨酸盐酸。
2)准备收集管：取1.5mL离心管，每支离心管加70μL pH9.0 1M Tris-HCl。
3)样品准备：经50％SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜， 并经0.22μm微孔滤膜滤过。
4)纯化过程：用足够的起始缓冲液(8-10mL)平衡Protein A-琼脂糖亲和层 析柱(HiTrap Protein A 1mL，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升 样品含蛋白10.2-21.1mg)15-25mL上柱，流速为0.5mL/min，然后以同样的 流速依次用起始缓冲液7-8mL、洗脱缓冲液6-7mL、起始缓冲液5mL洗涤， 每管1mL收集洗脱液。
5)纯度及活性鉴定纯化的单克隆抗体(McAb)用SDS-PAGE鉴定其纯度， 详见图3，通过图3可知，杂交瘤细胞株1C10 1E3单克隆抗体经纯化去除几 乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带(55kDa和25kDa)。
7.单克隆抗体的亚类鉴定和效价测定
将纯化好的单抗与sigma公司的标准抗BALB/c小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b， IgG3，IgM抗体进行ELISA检测，检测结果(见表3)表明：单抗类型为IgG2b， 以重组蛋白Cry3A为抗原，用间接ELISA方法检测纯化单抗效价，通过图4 可知，经ELISA测定，纯化得到的1C10 1E3单抗滴度为1:11259000。
表3杂交瘤细胞株1C10 1E3所产生的单克隆抗体的浓度及亚型
Figure BDA0003285392620000081
Figure BDA0003285392620000091
8.单克隆抗体特异性检测
分别提取转基因玉米及其其转化亲本内源蛋白，跑SDS-PAGE胶，转膜 用纯化单抗(1C10 1E3)作为一抗，Alexa FlurorTM 680goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)为二抗，用Odyssey infrared740 imager(9120,Li-COR Biosciences,Lincolin,NE)红外扫描仪western检测结果，通过图5可知，纯化 得到的1C10 1E3单抗能特异识别内源样本中的Cry3A。
其中，转基因玉米蛋白提取方法:
组织液氮速冻，磨碎，加1mL(按样品量，一般0.5g加1-2mL)蛋白提 取液，4℃混匀30分钟，(12,000rpm 4℃离心15min，取上清)，蛋白提取 液配方见表4：
表4蛋白提取液配方
Figure BDA0003285392620000092
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种杂交瘤细胞株及其产生的抗体和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Glu Lys Thr Tyr Tyr Gly Leu Ala Tyr Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Phe Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Arg Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcagccatat gacggccgac aacaacacc 29
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacacactcg agctagttca cggggatgaa ctc 33

Claims (6)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2021年05月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22342。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤：
a)通过原核表达得到Cry3A重组蛋白；
b)免疫动物：将Cry3A重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
3.根据权利要求2所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5-1:10。
4.根据权利要求1-3任一项所述的杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，杂交瘤细胞株1C101E3所产生的单克隆抗体可变区重链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示序列，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示序列。
6.根据权利要求4或5所述的单克隆抗体在检测Cry3A抗虫蛋白中的应用。
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