CN102241778B

CN102241778B - PPA-linker-Thanatin融合蛋白及制法

Info

Publication number: CN102241778B
Application number: CN 201110162987
Authority: CN
Inventors: 徐涛; 吕正兵; 刘学锋; 田辉
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU; Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2031-06-17
Also published as: CN102241778A

Abstract

本发明公开了一种PPA-linker-thanatin融合蛋白，为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了上述PPA-linker-thanatin融合蛋白的制备方法：通过两步PCR的方法获得重组掌叶半夏凝集素和死亡素的目的基因，并用目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a-c(+)，通过IPTG诱导获得表达蛋白，该表达蛋白为PPA-linker-thanatin融合蛋白，也即掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物。该掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物具有生物学活性，且对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。

Description

PPA-linker-Thanatin融合蛋白及制法

技术领域

本发明涉及到用大肠杆菌表达重组蛋白的基因工程制备及其在临床应用中的价值。

背景技术

近年来国际顶级杂志Cell、Nature、Science等纷纷发表综述、专论、论著评述炎症与肿瘤之间关系的研究进展及其意义，引起了各国学者的兴趣和重视。研究表明：炎症与肿瘤关系密切，慢性炎症与1/4以上癌症发生相关。炎症微环境中细胞因子、自由基、***素、生长因子等炎性应答介质能诱导DNA甲基化、抑癌基因点突变和翻译后修饰等基因和表观学变化，引起维持正常细胞内环境稳定关键通路的改变并导致癌症的发生和演进。一般的抗肿瘤药物鲜有抗菌的作用。所以在新药的开发中，抗菌消炎的抗肿瘤药物的研发有巨大的应用价值。为了更好的发挥不同种类的多肽的药物效果，采用化学合成或者分子克隆生产重组多肽药物的技术已经非常成熟。Boman的研究小组通过化学合成的将其中一种抗菌肽-抗菌肽A(Cecropin)N端的1-7号氨基酸与蜂毒素的N端5-12号氨基酸连接起来，这样连接起来的杂合肽(CAM)的大小相当于抗菌肽A的40％，但抗菌活性并没有因此而降低，反而增强。李艳红等用基因工程的方法获得了这种杂合肽，将化学合成出来的杂合肽CA(1-7)M(5-12)基因通过接头连接到E.coli分泌表达载体pIN的外膜蛋白A(OmpA₂)信号肽的基因序列上，在Lpp启动子和Lac启动子/操纵子的调控下进行分泌表达。为了达到预定的多肽重组表达，天蚕抗菌肽和溶菌酶(Mdc-hly)的克隆基因被克隆到pET32a上，在E.coli菌株BL21(DE3)表达，重组蛋白的抗菌能力得到了显著的提高。总体来说，运用基因工程表达重组多肽是一种的可行方法。本发明利用基因克隆的方法在大肠杆菌中表达掌叶半夏凝集素和死亡素的融合蛋白，特异性的修饰掌叶半夏凝集素的抗菌效果，为新型的抗菌抗肿瘤药物的研究提供基础。

掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)是天南星科多年生草本植物，主要分布于中国、朝鲜和日本。在我国中药研究中，掌叶半夏主要以块茎入药，它具有凝血、镇咳、镇痛、抗溃疡、抗心律失常、降血脂、抗肿瘤、抗虫、镇静催眠等药理作用。掌叶半夏凝集素(Pinellia pedatisectaagglutinin，PPA)是一种从掌叶半夏中分离出来具有凝血活性的植物性掌叶半夏蛋白，具有与甘露糖及其聚合物专一结合的性质，有凝血、抗肿瘤、杀虫等重要的生理功能。抗菌肽(Protegrin)是生物体内一种具有抗菌活性的动物蛋白，广泛存在于植物和动物体中，它是最早发展的一类内生免疫原性的分子机制，它代表了寄主抵抗外来微生物第一层防御***。死亡素(Thanatin)，又称死亡肽，是在昆虫斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)中发现的由21个氨基酸残基组成的抗菌肽，结构简单，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌都有抑制作用，但是对酵母影响不大，对哺乳动物细胞也不表现出溶血性。

掌叶半夏凝集素和死亡素均以在大肠杆菌中表达成功：表达的掌叶半夏凝集素具有很好的凝血活性，并在体外抑制人肝癌细胞QGY7703-3生长；表达的死亡素具有很好的抗菌效果，分别对革兰氏阳性菌株和革兰氏阴性菌株有抑制生长的效果。这些都为本发明提供了技术基础。

在利用大肠杆菌表达掌叶半夏凝集素和死亡素的融合蛋白中，也克服了一些问题：三步PCR过程即融合基因的构建中，碱基的缺失、突变都会造成融合蛋白的表达，所以必须进行每一步PCR的退火温度的优化并且PCR结果要克隆到T载体上进行测序分析；在37℃利用IPTG诱导表达过程中，融合蛋白表达活性较低，尝试利用低温诱导表达，并且诱导时间和IPTG浓度适当加高后，融合蛋白的活性得到了明显的提高。同时，为了充分发挥掌叶半夏凝集素和死亡素各自不同的生物学功能，我们用柔性肽(Linker)来融合两个多肽。

总之，利用基因克隆的方法，将不同来源的两中蛋白进行融合表达，为新型的抗菌抗肿瘤药物的研究提供了一定的基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种PPA-linker-Thanatin融合蛋白及其制备方法，该掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物具有生物学活性，且对肿瘤细胞的生长具有抑制作用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种PPA-linker-thanatin融合蛋白，其为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还同时提供了上述PPA-linker-thanatin融合蛋白的制备方法：通过两步PCR的方法获得重组掌叶半夏凝集素和死亡素的目的基因，并用目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a-c(+)，通过IPTG诱导获得表达蛋白，该表达蛋白为PPA-linker-thanatin融合蛋白(也即掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物)。

作为本发明的PPA-linker-thanatin融合蛋白的制备方法的改进：掌叶半夏凝集素目的基因的获取是通过RT-PCR方法合成的，通过设计两对引物在掌叶半夏凝集素基因全长的ORF终止密码子前3’端扩增死亡素63bp基因；第二对引物设计引入酶切位点Nco I和Xho I，通过两步PCR方法将掌叶半夏凝集素和死亡素的编码基因连接重组，获得PCR目的基因产物，连接到T载体中保存。

作为本发明的PPA-linker-thanatin融合蛋白的制备方法的进一步改进：将pMD18-T载体质粒经Nco I、Xho I双酶切和pET-28a-c(+)质粒经双酶切后，连接成为重组表达载体质粒pET-28a-c(+)。

综合所述，本发明的优点如下：将植物性蛋白掌叶半夏凝集素和动物性蛋白死亡素首次在pET原核表达***中表达，并得到掌叶半夏凝集素-死亡素融合蛋白，这种融合蛋白兼有掌叶半夏凝集素抗肿瘤细胞的效果和死亡素广谱抗菌的效果，为抗肿瘤新药开发奠定基础，具有十分重大的新药市场开发应用前景。

为此，本发明采用pET原核表达***在大肠杆菌中表达具有极高临床应用价值的掌叶半夏凝集素-死亡素蛋白，在新西兰大白兔中做抗血清检测，为新型抗肿瘤药物打下坚定的基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是掌叶半夏块茎中总RNA反转录为cDNA的电泳图谱；

M：15kb DNA marker；1：cDNA；

图2是编码掌叶半夏ppa基因的克隆；

M：15kb DNA marker；1，2：Oligo组反转录cDNA组PCR结果；

4，5.6：随机组反转录cDNA组PCR结果；

图3是ppa基因酶切鉴定分析；

M：5kb DNA marker；1：pEasy T1-ppa(Oligo组)；2：pEasy T1-ppa(Random组)

图4ppa基因序列分析结果；

图5ppa基因序列BLAST结果；

图6是ppal1 PCR产物和ppal1-pMD18-T Hind III、EcoR I双酶切鉴定；

图7是ppal2-pMD18-T质粒和ppal2-pMD18-T的Hind III、EcoR I双酶切鉴定；

图8是ppal3 PCR产物和ppal3-pMD18-T Hind III，EcoR I双酶切鉴定；

图9是pET28a-pt的鉴定；

M：1kb Marker；1：以pET28a-pt为模板PCR产物；2：阴性对照；3：pET28a-pt的SalI，XhoI双酶切鉴定；

图10是ppa-linker-thanatin(pt)基因；

粗体(且带双下划线)的为编码thanatin的基因，斜体(且带单下划线)的为linker基因，其余为编码ppa基因；

图11是pET28a-ppa-linker-thanatin (pt)重组载体的表达形式鉴定；

M：低分子量蛋白marker；1：pET28a-pt/BL21诱导组；2：诱导组pET28a-pt/BL21上清；3：诱导组pET28a-pt/BL21沉淀；4：pET28a-pt/BL21未诱导组；

图12是掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的纯化；

M：低分子量蛋白marker；1：纯化后的蛋白；

图13是掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的凝血活性检测；

1：阴性对照；2：PPA-linker-Thanatin处理后凝血分析；

图14是掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的MTT法抗肿瘤效果检测。

具体实施方式

实施例1、掌叶半夏凝集素的cDNA基因的获得

从掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)块茎中提取总RNA，参照TransScript First-StrandcDNA Synthesis SuperMix使用说明书，掌叶半夏总RNA反转录成单链cDNA。

First-Strand cDNA的合成体系如下：

PCR仪温控50℃，30min；85℃，5min失活RT Enzyme。cDNA经电泳后(图1)显示，cDNA为1kb一下弥散条带，符合预期结果。以cDNA为模板，根据NCBI上已报道的Pinelliapedatisecta agglutinin (PPA)mRNA完整序列(GeneBank：HM593586.1)设计两对引物PPAL1，PPAL2，分别为：

其中PPAL1，PPAL2分别引入酶切位点Nco I、Xho I。参考引物Tm值，梯度PCR优化退火温度。PCR体系如下：

PCR产物进过1％琼脂糖凝胶电泳分析(图2)，oligo组和random组在750bp同时扩增出明亮的条带。PCR产物经Axygen胶回试剂盒回收，连接T载体，连接体系如下：

PCR Product 2μl

pEASY T1 1μl

25℃孵育15min，将连接产物转化到50μl T1感受态细胞中，转化后在LB固体培养基中培养12小时后，挑取白色克隆，接种于含有100μg/ml LB液体培养基中，37度恒温培养箱中摇菌12h，抽提质粒，经酶切鉴定分析(图3)，oligo组和random组重组成功。

菌液送至Sangon序列分析后，获得编码掌叶半夏凝集素基因(图4)。提交至NCBI进行序列比对(图5)，结果显示克隆ppa基因同NCBI上已报道的基因有99％的同源性。

实施例2、ppa-linker-thanatin重组基因的克隆

ppa编码掌叶半夏凝集素基因通过P1、P2、P3、P4引物经过三步PCR扩增重组基因ppa-linker-thanatin。重叠的基因分别通过P1、P2、P3连接到ppa ORF 5’端。每一步PCR产物经割胶纯化后克隆到T载体上，经质粒PCR、酶切鉴定后，委托Sangon测序。

PCR体系如下：

P1，P4产物(ppal1，引物P1，P4，退火温度55度)、P2，P4产物(ppal2，引物P2，P4，退火温度65度)、P3，P4产物(ppal3，引物P3，P4，退火温度56度)分别连接到pEasy T1载体，连接体系同实施例一，分别经PCR鉴定和酶切鉴定(图6，7，8)后测序，分析结果正确。通过引物P5、P6引入酶切位点SalI、XhoIPCR获得重组ppa-linker-thanatin基因。

同样经过测序分析，得到预期重组基因(图10，SEQ ID NO：1)。

实施例3、ppa-linker-thanatin原核表达载体的构建

ppa-linker-thanatin(pt)基因和pET28a基因通过SalI，XhoI双酶切后回收目的片段，在T4DNA连接酶的作用下，构建表达载体pET28a-pt，载体转化到T1感受态细胞中，37℃培养12h后抽提质粒，PCR鉴定和酶切鉴定(图9)显示构建载体成功。

该预期重组基因相对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(即序列表第2条)所示。

实施例4、掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物在大肠杆菌的表达：

pET28a-pt表达载体转化到大肠杆菌中BL21中，在37度培养12h后，挑取含重组质粒的菌体单斑到3ml LB(含Amp50μg/ml)液体培养基中37℃过夜培养。按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0。加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM，16℃震荡培养9h，诱导产物表达。取1.5ml表达产物到Eppendorf管中，经12000g离心3min弃上清，加150μl PBS缓冲液混匀，诱导组经超声波破碎，12000g，3min离心后分为上清很沉淀，分别取30μl的诱导组总蛋白、诱导组上清、沉淀、未诱导组，和2×的蛋白Loading Buffer混匀，变性后在SDS-PAGE蛋白胶中电泳(图11)显示融合蛋白在大肠杆菌BL21中表达成功。

实施例5、掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的纯化：

按实施例4所得描述的方法扩大培养诱导表达，2ml含有重组pET28a-pt的菌液接种于1000ml的培养液中，经IPTG过诱导表达蛋白，通过离心法收集菌体，重悬于40ml BindingBuffer(20mM PBS pH 7.8，500mM NaCl1％(v/v)Triton X-100和1％(w/v)蛋白酶抑制剂)，经过超声波破碎，3000g，30min，4度离心，沉淀的用Binding Buffer在同样条件洗涤三次。之后沉淀用40ml Bingding Buffer(含终浓度8M脲)溶解，经0.45uM的滤头过滤后上样Ni-NTA柱，平衡用Binding Buffer，His-tag蛋白用含有150mM咪唑和8M脲的WashingBuffer(20mM PBS pH 6.0，500mM NaCl)洗脱。之后蛋白经SDS-PAGE电泳(图12)，纯化后的蛋白呈现单一条带。

实施例6、掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物的抑菌活性的检测和凝血活性的分析：

实施例5中纯化后融合蛋白抗菌能力的分析在液体培养基中进行，将半对数期生长的细菌重悬于含有抗生素(链霉素浓度10ug/ml)的培养液中，细菌终浓度为10⁶个/ml。纯化后的样品溶解在10mM的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中，加上100ul细菌悬浮液混匀，在96孔板上37度孵育5h，用酶标仪测量650nm处吸光度。最小的抑制浓度(Minimal inhibitoryconcentrations，MIC)的测量通过培养液微量稀释的方法进行。每个测试的微生物用培养液稀释到10⁵CFU/ml，取100ul和等体积的抗菌肽溶液混匀，然后在96孔板上连续的用1％的细菌蛋白胨溶液稀释，37度孵育10h，测量650nm处的吸光度。受测试的有革兰氏阳性菌(芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌K12-594)和真菌(酵母菌)，阳性对照为天然Thanatin。纯化后的融合蛋白对于受测试的三种菌株的抗菌活性分析(表1)显示，表达的蛋白对受测试的细菌有明显的抗菌活性。

表1、掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物抗菌活性分析

PPA-linker-Thanatin的抗菌能力分析

实施例5中纯化后融合蛋白的凝血活性的分析采用等浓度稀释的方法进行，将纯化后的蛋白稀释至浓度为40μg·ml^-1，在96孔板上用0.85％生理盐水作2倍梯度稀释。在载玻片上加10μl样品，等体积混合2％兔血红细胞，室温放置5-10min左右，用生理盐水作空白对照。每次设3个平行实验，结果取平均值。高倍镜(40×)下检测融合蛋白血凝效果(图13)，结果显示融合蛋白具有明显的凝血效果。

实施例7、掌叶半夏凝集素-死亡素表达产物抗肿瘤的MTT法活性检测：

培养的肝癌hum7细胞接种子96孔培养板中，浓度为2×10⁵/ml.每孔接种180μl，继续培养24h后加入实施例5中纯化后的融合蛋白(样品用PBS溶解)。加样终浓度分为0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.25mg/ml(体积为20μl)。对照组每孔加20μl PBS，加入同提取液(终浓度0.05mg/ml)20μl。阴性对照加20μl DMSO。每组5孔。继续培养24h后每孔加入MTT溶液20μl，37℃孵育4h.小心吸去96孔板中的培养液后。每孔加入200μl DMSO。在恒温振荡器上振荡5min，测定各孔OD值。测定波长为792nm.计算各提取物对肿瘤细胞的生长抑制率。生长抑制率(％)＝(1-实验组OD值-对照组OD值/对照组OD值)×100％。从实验结果(图14)显示，纯化后的蛋白具有明显的抗肿瘤效果，其抑制肝癌hum7细胞的生长的抑制随着实验浓度的增加而增加。

上列举的仅为本发明的若干个具体实施例，本发明不限于以上实施例。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种PPA-linker- thanatin融合蛋白，其特征在于：为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种制备如权利要求1所述的PPA-linker- thanatin融合蛋白的方法，其特征在于：通过两步PCR的方法获得重组掌叶半夏凝集素和死亡素的目的基因，并用目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a-c(+)，通过IPTG诱导获得表达蛋白，该表达蛋白为PPA-linker- thanatin融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备PPA-linker- thanatin融合蛋白的方法，其特征在于：所述的掌叶半夏凝集素目的基因的获取是通过RT-PCR方法合成的，通过设计两对引物在掌叶半夏凝集素基因全长的ORF终止密码子前3’端扩增死亡素63bp基因；第二对引物设计引入酶切位点NcoⅠ和XhoⅠ，通过两步PCR方法将掌叶半夏凝集素和死亡素的编码基因连接重组，获得PCR目的基因产物，连接到T载体中保存。