CN103608012A

CN103608012A - 在癌症如骨髓增殖性肿瘤治疗中的帕比司他与鲁索利替尼的组合

Info

Publication number: CN103608012A
Application number: CN201280029599.0A
Authority: CN
Inventors: F·巴福特; T·拉迪莫斯基; B·嘉德宝
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2011-06-14
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2014-02-26
Also published as: WO2012174061A1; IL229766A; HK1193045A1; MX2013014805A; ES2595407T3; ZA201308815B; EP2720696B1; CA2844407A1; PE20140604A1; EA201490016A1; CL2013003577A1; BR112013032125A2; SG195141A1; AU2017204469A1; JP2014517039A; US20180085371A1; US20140113919A1; EP2720696A1; MX344580B; JP6200884B2

Abstract

本发明涉及一种组合，该组合包括：化学式(A)的化合物A((R)-3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基-3-环戊基丙腈)[此处应***纸质形式摘要中出现的化学式]或其药学上可接受盐、以及化学式(B)的化合物B(N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺)[此处应***纸质形式摘要中出现的化学式]或其药学上可接受盐；其同时、合并、单独或按序使用，特别是用于增生性疾病的治疗。本本发明还涉及包含这种组合的药物组合物、以及利用这种组合来治疗哺乳动物(特别是人中)的增生性疾病的方法。本发明还涉及包含这种组合的商业包装品或产品。

Description

在癌症如骨髓增殖性肿瘤治疗中的帕比司他与鲁索利替尼的组合

技术领域

本发明涉及一种组合，该组合包括：

(a)化学式(A)的化合物A(名称：(R)-3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈)：

或其药学上可接受盐；以及

(b)化学式(B)的化合物B(名称：N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺)：

或其药学上可接受盐；

其同时、合并、单独或按序使用，特别是用于增生性疾病的治疗。本发明还涉及包含这种组合的药物组合物、以及一种利用这种组合治疗哺乳动物(尤其是人)的增生性疾病的方法。本发明还涉及一种包含这种组合的商业包装品或产品。

背景技术

骨髓增殖性肿瘤(MPN)是导致骨髓中血细胞(血小板、白细胞和红细胞)过度产生的一组疾病。MPN包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性或特发性骨髓纤维化、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性中性粒细胞白血病(CNL)、幼年型粒单核细胞白血病(JML)、慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)/高嗜酸粒细胞综合症(HES)。将这些疾病分成一类是因为它们共同具有部分或全部的以下特征：多能造血祖细胞的参与、超越非转化造血祖细胞的转化克隆优势、在没有可定义刺激的情况下一个或多个造血系的过多造血、非生长因子依赖性集落体外形成、骨髓增生、巨核细胞增生和发育异常、主要涉及染色体1、8、9、13和20的异常、血栓性和出血性体质、过度骨髓外造血、向急性白血病的自发转化或者骨髓纤维化的形成(但发生率低于CML的发生率)。骨髓增殖性肿瘤的发病率有广泛的变化，从每年大约3例CML/100,000(60岁以上)个体到每年0.13例幼年型粒单核细胞白血病/100,000名(从出生到14岁)儿童(Vardiman JW等人，Blood100(7):2292-302,2002年)。

因此，对于骨髓增殖性肿瘤以及其它癌症的新治疗方法仍然存在着需求。

发明内容

本发明提供一种联合治疗，该联合治疗包含：化学式(A)的JAK抑制剂化合物A或其药学上可接受盐；以及化学式(B)的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂化合物B或其药学上可接受盐。该联合治疗可用于多种癌症的治疗。该联合治疗也可用于任意数量的JAK相关疾病和/或HDAC相关疾病的治疗。化学式(A)的化合物A也称为鲁索利替尼(ruxolitinib)。化学式(B)的化合物B也称为帕比司他(panobinostat)。

本发明所提供的联合治疗可用于受试对象中JAK相关疾病的治疗。因此，在一个方面，本发明提供一种在需要治疗的受试对象中的治疗癌症的方法，该方法包括给予受试对象有效量的上述组合物。在一个实施方式中，癌症是骨髓增殖性肿瘤。可以利用本发明联合治疗所治疗骨髓增殖性肿瘤的非限制性例子包括但不限于：慢性髓性白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性或特发性骨髓纤维化(PMF)、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病、幼年型粒单核细胞白血病、高嗜酸性粒细胞综合症、***性肥大细胞增生症、非典型慢性髓细胞性白血病。

在这些治疗方法的一个实施方式中，受试对象是人。

在另一个实施方式中，治疗包括化合物A与化合物B的联合给药。

在另一个实施方式中，化合物A和化合物B处于单一制剂或单位剂型中。

在又一个实施方式中，治疗包括在大致相同的时间或者不同的时间给予化合物A和化合物B。

在这些治疗方法的另一个实施方式中，将化合物A向受试对象给药，接着是化合物B的给药。

在又一个实施方式中，将化合物B向受试对象给药，接着是化合物A的给药。

在这些治疗方法的另一实施方式，化合物A和/或化合物B是以将这两种化合物中的一种或两种单独给药时无效但联合给药时却有效的量而给药。

附图说明

图1示出了在化合物A和/或化合物B治疗期内的体重。

图2和图3示出了在7天治疗(即细胞注射后第11天(治疗开始于细胞注射后的第4天))后BioL水平的治疗效果。

图4示出了在8天治疗后的脾脏重量。

图5和图6示出了治疗后2小时PD标记物分析的结果(脾脏提取物)。

图7和图8示出了用JAK2V617F骨髓转导细胞移植的Balb/c雌性小鼠接受载剂；按照M/W/F方案的8mg/kg剂量腹腔注射(游离碱等效物)的化合物B；60mg/kg的剂量(游离碱等效物)的化合物A，每12小时；或者这两种药物的组合，连续21天。将处死时的体重和脾脏重量变化表示为平均值±SEM。N=9/组。Balb/c雌性正常脾脏重量的平均值是在100mg的范围内)。在处死日，*p<0.05(单因素方差分析，接着执行Dunnett's检验或Tukey's检验。将脾脏重量值的倒数形式用于统计分析)。

图9-图12示出了用mJAK2V617F-IRES-GFP骨髓转导细胞移植的Balb/c雌性小鼠，其接受载剂；按照M/W/F方案的8mg/kg剂量腹腔注射(游离碱等效物)的化合物B；采用每日两次60mg/kg(游离碱等效物)的剂量的化合物A；或者这两种药物的组合，连续21天。在处死日，采集血液，用Sysmex血液分析仪进行分析。N=7-9/组(在化合物A/化合物B组合组中，一些血样不能接受分析。在处死日，基于Graph Pad Quick计算异常值程序(用所有的值来执行数据分析)中的分析，检测出载剂组(ID3)中的1个异常值以及化合物A组(ID27)中的1个异常值。图9：血细胞比容(Hct)；图10：网织红细胞计数；图11：血小板计数；图12：白细胞计数。在处死日,*p<0.05(单因素方差分析，接着执行用于对WBC和PLT计数的log10转换值进行多重比较的Dunnett's检验或Tukey's检验)。

图13-图16示出了Balb/c雌性小鼠的代表性骨髓染色图像，所述小鼠用mJAK2V617F-IRES-GFP细胞移植，并用按照M/W/F方案的化合物B以8mg/kg的剂量腹腔注射(游离碱等效物)、用化合物A以60mg/kg的剂量(游离碱等效物)每12小时、或者用两种药物的组合连续21天治疗。

图17-图19示出了Balb/c雌性小鼠的代表性脾脏染色图像，所述小鼠用mJAK2V617F-IRES-GFP细胞移植，并按照M/W/F方案用化合物B以8mg/kg的剂量腹腔注射(游离碱等效物)、用化合物A以60mg/kg的剂量(游离碱等效物)每12小时、或者用两种药物的组合连续21天治疗。

图20示出了研究设计和方法。

图21示出了在第1群中随时间推移的可感知脾脏长度。

图22示出了在第2群中随时间推移的可感知脾脏长度。

图23示出了在第3群中随时间推移的可感知脾脏长度。

具体实施方式

现已发现以下组合的给药：

(a)化学式(A)的化合物A((R)-3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-lH-吡唑-l-基)-3-环戊基丙腈)：

或其药学上可接受盐；以及

(b)化学式(B)的化合物B(N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺)：

或其药学上可接受盐；

在受试对象的癌症治疗中提供出人意料的协同效果。这种方法(两种类型药物的组合给药或联合给药)可以用于对目前可用治疗无反应或耐受的患癌症个体的治疗。本发明所提供的联合治疗也可用于提高目前可用的且个体对其产生反应的癌症治疗的疗效并且/或者减小其副作用。

下面对本文中使用的某些术语进行描述。本发明化合物是采用标准命名法加以描述。除非另有说明，本文中使用的所有科学技术术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解含义相同的含义。

化合物A及其药学上可接受盐描述于以下文献，例如美国专利7,598,257中。化合物A也称为鲁索利替尼。

化合物B及其药学上可接受盐描述于以下文献，例如美国专利6,833,384、7,067,551和6,552,065中。化合物B也称为帕比司他。

除非另有说明或者正文中明确指出，可用于本发明联合治疗的化合物同时包括化合物的游离碱、以及化合物的所有药学上可接受盐。

本文中使用的术语“药学上可接受盐”是指本发明嘧啶化合物的无毒酸或碱土金属盐。这些盐可以分别在这些嘧啶化合物的最终分离和纯化期间在原位制备，或者通过单独地使碱或酸官能团与合适的有机或无机酸或碱反应而制备。代表性的盐包括但不限于下列：醋酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、环戊烷丙酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐。另外，可以利用如下试剂使碱性含氮基季铵化：卤代烷，如氯代、溴代、碘代甲基、乙基、丙基、和丁基；硫酸二烷基酯，如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯、和硫酸二戊酯；长链卤化物，如氯代、溴代和碘代癸基、十二烷基、十四烷基、十八酰基；卤代芳烷基，如溴代苄基和溴代苯乙基，等。由此，可获得水或油溶性或分散性产品。

可用于形成药学上可接受酸加成盐的酸的例子包括：无机盐，如盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸和磷酸；以及有机酸，如甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、酒石酸、草酸、马来酸、甲磺酸、丁二酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酸性氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)。

碱加成盐可以在嘧啶化合物的最后分离和纯化期间在原位制备，或者单独地通过使羧酸基团与合适的碱(如药学上可接受金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或者与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应而制备。药学上可接受盐包括但不限于：基于碱金属和碱土金属(如钠、锂、钾、钙、镁、铝盐等)的阳离子的盐；以及基于无毒的铵、季铵、和胺阳离子(包括但不限于：铵、四甲基铵、四乙胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等)的盐。可用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺类包括：二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、吡啶、甲基吡啶、三乙醇胺等，以及碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和鸟氨酸)。

本发明提供一种包含JAK抑制剂化合物A和HDAC抑制剂化合物B的组合治疗。该组合的给药包括：经由任何合适途径，在单一制剂或单位剂型中的组合给药、组合中各药物的同时但分别给药、或者组合中各药物的按序给药。，组合中各药物剂量可以要求其中一种或多种药物与组合中的其它药物相比更频繁地给药。因此，为了实现适当的给药，包装的药物产品中可包括含有该药物组合的一个或多个剂型、以及含有该药物组合中的一种药物但不含有该组合中的另一种药物的一个或多个剂型。

本文中使用的术语“单一制剂”是指为了将有效量的两种治疗剂递送给患者而配制的单一载体或载剂。该单一载剂被设计成递送有效量的各药物连同任何药学上可接受载体或赋形剂。在一些实施方式中，载剂是片剂、胶囊、丸剂或贴剂。在其它实施方式中，载剂是溶液剂或悬浮剂。

本文中使用的术语“单位剂量”表示在一个剂型中向治疗的患者同时给予两种药物。在一些实施方式中，单位剂量是单一制剂。在某些实施方式中，单位剂量包含一各或多个载剂，使得各载剂含有有效量的至少一种药物连同药学上可接受的载体和赋形剂。在一些实施方式中，单位剂量是在相同时间给予患者的一个或多个片剂、胶囊、丸剂或贴剂。

本文中使用的术语“治疗”表示缓解、缓减或减轻受试对象中疾病的至少一种症状。在本发明的含义中，术语“治疗”还表示阻止、延迟发病(即，在疾病临床表现或疾病症状之前的时间段)以及/或者降低疾病症状发展或恶化的危险性。

术语“受试对象”意图包括动物。受试对象的例子包括哺乳动物，例如人、犬、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠，以及转基因非人动物。在某些实施方式中，受试对象是人；例如患有多发性骨髓瘤、有患上多发性骨髓瘤的危险性、或者有可能患上多发性骨髓瘤的人。

术语“大约”或者“近似”通常表示在给定的值或范围的20%内、更优选在10%内、最优选在5%内。可替换地，特别是在生物***中，术语“大约”表示在大约log(即，一个数量级)内、优选地在给定值的两倍内。

本文中所描述的药物组合显示协同作用。本文中使用的术语“协同作用”是指两种药物产生效果的作用(例如减慢癌症的症状进展或其症状)大于各药物单独给药的效果的简单相加。可以例如利用合适的方法如Sigmoid-Emax方程式(Holford，N.H.G.和Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet,6:429-453(1981))、Loewe相加作用的方程式(Loewe，S.和Muischnek，H.，Arch.Exp.Pathol Pharmacol.114：313-326(1926))以及中效方程式(Chou，T.C.和Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.22：27-55(1984))来计算协同效果。上述各方程式可应用于实验数据，以形成用于辅助评估药物组合效果的相应图表。与上述方程式有关的相应图表分别是浓度效应曲线(concentration-effect curve)、等效图曲线(isobologram curve)和组合指数曲线(combination index curve)。

药物组合的“有效量”是指足以提供用该组合所治疗疾病的临床可观察体征和症状的可察觉改善(相对于基线)的量。

“口服剂型”包括开处方或意欲用于口服给药的单位剂型。

利用化合物A与化合物B组合进行治疗的方法

本发明提供一种通过向个体给予化合物A与化合物B的组合而治疗个体中JAK相关疾病(例如癌症，例如骨髓增殖性肿瘤)的方法。

在一个实施方式中，本发明提供通过向需要治疗的个体给予治疗有效量或剂量的本发明组合或其药物组合物而治疗受试对象(例如，患者)中JAK相关疾病或病症的方法。JAK相关疾病可以包括与JAK的表达或活性(包括过表达和/或异常活性水平)直接或间接相关的任何疾病、病症或病情。JAK相关疾病也可以包括可以通过调节JAK活性而预防、减轻或治愈的任何疾病、病症或病情。

JAK相关疾病的例子包括与免疫***有关的疾病，包括例如器官移植排斥反应(例如，同种异体移植排斥和移植物抗宿主病)。

JAK相关疾病的其它例子包括：自身免疫性疾病(如多发性硬化症)、类风湿关节炎、幼年型关节炎、I型糖尿病、狼疮、银屑病、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、重症肌无力、免疫球蛋白肾病、自身免疫性甲状腺疾病等。在一些实施方式中，自身免疫性疾病是自身免疫性大疱性皮肤病，如寻常性天疱疮(PV)或大疱性类天疱疮(BP)。

JAK相关疾病的其它例子包括：过敏性疾病，如哮喘、食物过敏、特应性皮炎、鼻炎。JAK相关疾病的其它例子包括病毒性疾病，如EB病毒(EBV)、乙型肝炎、丙型肝炎、HIV、HTLV1、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人***瘤病毒(HPV)。

JAK相关疾病或病情的其它例子包括：皮肤病，如银屑病(例如，寻常型银屑病)、特应性皮炎、皮疹、皮肤刺激、皮肤致敏(例如，接触性皮炎或者变应性接触性皮炎)。例如，某些物质(包括一些药物)当局部使用会导致皮肤致敏。在一些实施方式中，利用至少一种本发明JAK抑制剂的局部给药来治疗皮肤病。

在其它实施方式中，JAK相关疾病是癌症，包括通过以下表征的那些：实体肿瘤(例如，***癌、肾癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、头颈部癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、卡波西氏肉瘤、巨***增生症、黑素瘤等)、血液癌症(例如，淋巴瘤、白血病(如急性淋巴细胞白血病)、或者多发性骨髓瘤)、皮肤癌(如皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)和皮肤B细胞淋巴瘤)。示例性的皮肤T细胞淋巴瘤包括Sezary综合症和蕈样肉芽肿。

JAK相关疾病还可以包括特征是表达突变JAK2，如在假激酶结构域具有至少一个突变(例如，JAK2V617F))的那些的疾病。

JAK相关疾病还可以包括：骨髓增生性疾病(MPD)，如真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、伴有骨髓纤维变性的髓样化生(MMM)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、高嗜酸性粒细胞综合症(HES)、***性肥大细胞病(SMCD)等。

其它JAK相关疾病包括炎症和炎性疾病。示例性的炎性疾病包括：眼睛的炎性疾病(例如，虹膜炎、葡萄膜炎、巩膜炎、结膜炎、或者相关疾病)、呼吸道的炎性疾病(例如，包括鼻和鼻窦的上呼吸道，如鼻炎或鼻窦炎；或者下呼吸道，包括支气管炎、慢性阻塞性肺病等)、炎性肌病如心肌炎、和其它炎性疾病。

本文中所描述的联合治疗还可以用于治疗缺血再灌注损伤、或者与炎性缺血事件相关的疾病或病情(例如脑卒中或心脏停搏)。本文中所描述的联合治疗还可以用于治疗如由于癌症所引起的或者与癌症相关的厌食症、恶病质或疲劳。本文中所描述的联合治疗还可以用于治疗再狭窄、硬皮病或纤维化。本文中所描述的联合治疗还可以用于治疗与缺氧或星形胶质化相关的疾病，例如糖尿病性视网膜病、癌症或神经退行性变。

本发明提供通过向患病个体给予有效量的化合物A和化合物B而治疗疾病(例如骨髓增生性疾病)的方法。该药物组合的量是指有效治疗疾病的量。重要的是要指出该药物组合具有协同效果：即使以特定剂量单独施用药物的一种或多种无效，但当联合给药时在各药物的相同剂量下，治疗却是有效的。因此该组合中一种或多种药物的剂量可以小于各药物的FDA批准剂量。

剂量

用于治疗疾病的药物组合的最佳剂量可以利用已知方法凭经验针对各个体来确定；该最佳剂量将取决于多种因素，包括但不限于：疾病的发展程度；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间和途径；以及该个体所服用的其它药物。可利用本领域所众所周知的常规测试和步骤来获得最佳剂量。

可与载体材料组合以制造单一剂型的药物组合的量将根据被治疗个体和具体给药方式而变化。在一些实施方式中，含有如本文中所描述药物组合的单位剂型将包含当药物单独给药时通常所采用量的组合中的各药物。

给药的频率可根据所使用化合物以及要治疗或预防的具体病症而变化。通常，优选的是采用足以提供有效治疗的最小剂量。通常可利用本领域技术人员所熟悉的适合于正在治疗或预防的病症的测定方法，来监测患者中的治疗有效性。

可以利用药物制剂化学领域的技术人员所熟知的各种常规的混合、粉碎和制造技术来制造剂型。

含有药物组合或者药物组合中单独药物的口服剂型，可采用包封在胶囊(例如明胶胶囊)中的微型片剂的形式。为此，可以使用明胶胶囊（因其用于药物制剂中），例如从Pfizer公司购得的名为CAPSUGEL的硬明胶胶囊。

可用于本发明的许多口服剂型包含采用颗粒形式的药物组合或者药物组合中的单独药物。可将这种颗粒压制成片剂，该片剂是包衣剂型(如遮味剂型、压制包衣剂型、或肠溶包衣剂型)的片芯部分，或者可容纳于胶囊、渗透泵剂型或其它剂型中。

本发明的药物化合物是以在100:1至1:100、更优选1:1至1:100、更优选1:10至1:100范围内的比率而存在于本文中所公开的组合、剂型、药物组合物和药物制剂中。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以5mg每日2次给药，帕比司他是以10mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以10mg每日2次给药，帕比司他是以10mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以15mg每日2次给药，帕比司他是以10mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以15mg每日2次给药，帕比司他是以15mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以15mg每日2次给药，帕比司他是以20mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以15mg每日2次给药，帕比司他是以25mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以15mg每日2次给药，帕比司他是以30mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以3-7mg每日2次给药，帕比司他是以8-12mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以8-12mg每日2次给药，帕比司他是以8-12mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以8-12mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以10-20mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以10-30mg每隔一周每周3次给药。

在一个实施方式中，当给予人时，鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以20-40mg每隔一周每周3次给药。

在不显示毒性的情况下产生疗效的最佳比率、单独和组合剂量、以及药物化合物的浓度基于可达到靶部位的活性成分的药代动力学，并可利用本领域技术人员所了解的方法来确定。

药物组合物

可以在临床研究中对本发明所提供的药物组合物或组合进行测试。合适的临床研究可以是例如：增生性疾病患者中的开放标签、剂量递增研究。这种研究尤其证明了本发明组合中活性成分的协同作用。可直接地通过本领域技术人员所了解的这些研究结果来确定针对增生性疾病的有利效果。这种研究尤其适合于对使用活性成分的单一治疗与本发明组合的效果进行比较。

本发明药物组合的给药不仅可以带来有利效果(例如协同的治疗效果，例如在缓解症状、延迟症状的发展或者抑制症状方面)，而且可以带来其它出人意料的有利效果(例如与仅使用本发明组合中所使用药学活性成分中的一种的单药治疗相比，副作用减少、生活质量提高或发病率下降)。

另一个利益可以是可使用较低剂量的本发明组合中的活性成分，例如所需的剂量不仅常常减小而且给药频率也减小，从而可以降低副作用的发生率或严重程度。这符合被治疗患者的愿望和要求。

本发明的一个目的是提供一种包括在靶向或预防癌症(例如骨髓增生性疾病)方面联合治疗有效量的药物组合物。在此组合物中，化合物A与化合物B可共同地、相继地或分开地在一个复合单位剂型中或者在两个单独的单位剂型中给药。单位剂型也可以是固定的组合。

用于两种化合物的分开给药或者用于以固定组合(即包含根据本发明的两种化合物的单个盖仑制剂组合物)给药的药物组合物，可以以已知方式来制备，并且适合于向哺乳动物(温血动物，包括人)进行肠内给药(例如口服给药或直肠给药)、以及胃肠外给药；该药物组合物包含单独的治疗有效量的至少一种药理学活性组合组分(如上所述)，或者与特别适合于肠内或胃肠外给药的一种或多种药学上可接受载体或稀释剂的组合。

制剂

可利用药物制剂领域技术人员所熟知的多种方法配制本发明所提供药物组合。可以以多种不同方式实现上述各种释放性能。合适的制剂包括例如片剂、胶囊、压制包衣制剂、以及其它容易给药的制剂。

合适的药物制剂可含有例如大约0.1%至大约99.9%、优选大约1%至大约60%的活性成分。用于肠内或胃肠外给药的联合治疗的药物制剂例如是采用单位剂型的制剂，例如糖衣片剂、片剂、胶囊剂或栓剂、或者安瓿剂。除非另有说明，这些制剂是以已知方式制备，例如通过常规的混合、制粒、包糖衣、溶解或冻干工艺。应当理解的是，各剂型的单独剂量中所包含组合组分的单位含量自身无需构成有效量，因为可以通过多个剂量单位的给药而达到必需的有效量。

特别是，治疗有效量的本发明组合中的各组合组分可以同时或按序地给药以及以任意顺序给药，各组分可以分开给药或者以固定组合给药。例如，根据本发明的疾病治疗方法可包括：同时或以任意顺序按序地，以联合治疗有效量优选地以协同有效量，例如以对应于本文中所描述量的每日剂量或间断剂量，给予(i)采用游离形式或药学上可接受盐形式的第一药物(a)、以及给予(ii)采用游离形式或药学上可接受盐形式的药物(b)。本发明组合中的各组合组分可以在治疗期间的不同时间分别地以分开的或单一组合形式合并地给药。此外，术语“给药”也包括组合组分的前体药物的使用，该前体药物在体内转变成该组合组分。因此，应理解的是本发明包括所有这种同时或交替治疗的方案，术语“给药”也应如此解释。

本发明组合中所使用各组合组分的有效剂量，可根据所使用具体化合物或药物组合物、给药方式、治疗的疾病、治疗疾病的严重程度而变化。因此，根据多种因素(包括给药途径以及患者的肾功能和肝功能)来选择本发明组合的给药方案。普通技术的临床医生或医师可以容易地确定并规定减轻、对抗或阻止疾病发展所需要的单个活性成分的有效量。

实施例

通过下面的非限制性实施例来进一步说明本发明。

实施例A

执行研究来测试化合物A与化合物B组合在用1×10⁶Ba/F3EpoRJAK2V617F-luc克隆8细胞静脉注射(尾静脉)的Scid-beige小鼠中的功效。

研究方案：

动物：

80只Scid-beige雌性小鼠，体重18-22g(8组，每组7只小鼠，在随机分组时排除了24只)

细胞：Ba/F3EpoR JAK2V617F-luc克隆8细胞。

在细胞注射后的第4、7、9和11日，执行全身Xenogen成像。在细胞注射后的第4天，基于生物发光(BioL)将动物随机分配入各治疗组。

Baffert等人在Mol.Cancer Ther;9(7),1945,2010年7月中描述了该小鼠模型和方案。

动物和细胞系：

细胞系：Ba/F3EpoR JAK2V617F-luc克隆8

基因：JAK2V617F

细胞数量/注射部位：1×l0⁶细胞，以200ul/尾静脉注射

种类：小鼠

品系：CB17/C.B-Igh-l^b/GbmsTac-Prkdc^scid-lyst^bgN7，Taconic farms公司(全名Taconic公司)

性别：雌性

年龄：22-24g

数量：80只小鼠

细胞制备和注射：

试剂：RPMI1640(胺化)

10%FCS(胺化)

L-谷氨酰胺2mM(胺化)

嘌呤霉素，1ug/ml(Sigma公司，批号036K4073)

潮霉素B，lOO ug/ml(invitrogen公司，批号B13871010)

使Ba/F3EpoR JAK2V617F-luc细胞在补充有10%FCS、1%谷氨酰胺、嘌呤霉素(1ug/mL)和潮霉素(lOO ug/mL)的RPMI1640中生长。在实验前不到2周的时间内，每3天***细胞(1:50)。在注射前一天，使细胞在无任何抗生素的情况下生长(以避免任何可能的细胞体内生长延迟)。

在注射日，收集细胞，将细胞再悬浮于HBSS缓冲液中(1×10⁶细胞，在200ul中)。用27G结核菌素注射器将细胞注射入尾静脉。

组的定义：

第1组(7只小鼠)：载剂组(0.5%HPMC口服+D5W5%腹腔注射)

第2组(7只小鼠)：化合物B5mg/kg，每周3次(M/W/F)腹腔注射+HPMC0.5%口服

第3组(7只小鼠)：化合物B1O mg/kg，每周3次(M/W/F)腹腔注射+HPMC0.5%口服

第4组(7只小鼠)：化合物B15mg/kg，每周3次(M/W/F)腹腔注射+HPMC0.5%口服

第5组(7只小鼠)：化合物A79.2mg/kg每日2次口服+D5W5%腹腔注射

第6组(7只小鼠)：化合物A79.2mg/kg每日2次口服+化合物B5mg/kg，每周3次(M/W/F)腹腔注射

第7组(7只小鼠)：化合物A79.2mg/kg每日2次口服+化合物B1O mg/kg，每周3次(M/W/F)腹腔注射

第8组(7只小鼠)：化合物A79.2mg/kg每日2次口服+化合物B15mg/kg，每周3次(M/W/F)腹腔注射

同时地给予治疗。

化合物：

化合物A是单磷酸盐，79.2mg/kg(等同于60mg/kg游离碱)，1O mL/kg，在0.5%HPMC Pharmacoat603中。

含有化合物A的制剂：522.7mg化合物A(采用单磷酸盐形式)，在66mlHPMC Pharmacoat6030.5%中。

化合物B是采用乳酸盐形式，15mg/kg(等同于11.90mg/kg游离碱)、1Omg/kg(等同于7.94mg/kg游离碱)和5mg/kg(等同于3.97mg/kg游离碱)、1O mL/kg，在D5W5%中(B.Braun，批号395147)。

含有化合物B的制剂：分别地，15mg化合物B(以乳酸盐的形式)，在10mlD5W5%中；10mg，在10ml D5W5%中；和5mg在10ml D5W5%中。

监测以及数据/样品收集：

利用应答器来确认动物并且每日监测动物。

在细胞注射后的第4天、第7天和第10天，在异氟醚（isofluran）麻醉(3-5体积%的异氟醚、空气流量0.8L/分钟)下，用Xenogen照相机(非入侵

成像***，Caliper)记录生物发光。用D-荧光素(Xenogen公司，ref XR-1001)以150mg/kg(1O ml/kg，Nacl)给动物腹腔注射。然后，在荧光素注射后将麻醉的小鼠置于成像室，执行15分钟成像。

Xenogen参数：D/10秒/med/15分钟。

基于载剂治疗动物的良好状态，在第4天对动物进行随机分组，并且开始至少6天的治疗。

在记分表中记录动物体重(BW)和良好状态。如果在连续2天中体重超过15%则将动物处死。如果每组中大于50%的动物死亡则将所有小鼠处死。

处死、样品收集：

在化合物A最后一次给药的2小时后；

化合物B最后一次给药的2小时后；

●在处死时记录脾脏重量。

●收集样品，在液氮中快速冷冻，然后于-80℃下保存，直到分析：

用于PK分析的脾脏、BM、血液和肝脏

用于PD标记物分析的脾脏(p-STAT5(化合物A)和蛋白质乙酰化(化合物B))，

用于PD标记物分析的胸骨(p-STAT5(化合物A)。

实施例A的结果：

剂量是以游离碱等效物来表示。

表1.1-1.8示出了随机分组时不同组的生物发光。

表1.1

表1.2

表1.3

表1.4

表1.5

表1.6

表1.7

表1.8

图1示出了化合物A和/或化合物B治疗期内的体重。当对化合物A与化合物B组合时，在耐受性方面没有大的变化。

图2和图3示出了在7天治疗后(即细胞注射后第11天(治疗开始于细胞注射后第4天))BioL水平的治疗效果。

图4示出了8天治疗后的脾脏重量。

图5和图6示出了治疗后2小时，PD标记物分析(脾脏提取物)的结果。

表2示出了对Biolux的部分增加的治疗效果。

表2

注释：

按以下方式计算部分变化：最后一天的biolux/第一天的biolux。

^*，p<0.05相对于载剂对照组

^#，p<0.05相对于化合物A

^$，p<0.05相对于相同剂量的化合物B

(单向方差分析，接着执行对用于与所有组进行多重比较的log转换值的Tukey's检验)

按以下方式计算T/C：(治疗组/对照组)×100

依照Clarke R在Breast Cancer Res Treat，1997中描述的方法：

^￥，表示微小的拮抗作用

⁺，表示微小的拮抗作用或相加作用

^&，表示微小的协同作用或相加作用

表3列出了治疗后2小时PK分析的结果。

所有剂量均以游离碱等效物形式给出。BLQ：低于定量限。

结果表示为平均值±SEM，^*由于色谱中的问题因而谨慎地采用BM水平。

以上结果表明，在Ba/F3EpoR JAK2V617F-luc细胞致白血病疾病的机械小鼠模型中，化合物A与化合物B的组合被耐受(在化合物B单药治疗组与化合物B+化合物A组合组之间，体重减轻相当)。

当对白血病细胞扩散进行评估时(Xenogen Biolux读出)，化合物A与化合物B的组合分别在60mg/kg和12mg/kg的剂量下与以单药治疗形式给药的这些药物相比显示显著性差异。

实施例B

在真性红细胞增多症样疾病的JAK2V617F骨髓移植模型中，对与JAKl/2抑制剂化合物A组合的去乙酰化酶抑制剂化合物B的活性和耐受性进行评估。在剂量为8mg/kg的化合物B和60mg/kg的化合物A条件下，对在此骨髓增殖性肿瘤疾病模型中的组合活性进行测试。如下面详细地示出，化合物B与JAKl/2抑制剂化合物A的组合，与各单独药物相比显示在脾肿大以及骨髓和脾脏组织学方面的显著改善。

骨髓移植和分析

骨髓感染和移植

以基本上如Wernig等人(Wernig,G,,Mercher，T,,OkabeR.等人(2006)Expressionof JAK2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosisin a murine bone marrow transplant model.Blood107：4274-4281)所描述的方法执行鼠科骨髓移植实验。简略地，在BM移植前5天，用5-氟尿嘧啶(150mg/kg，腹腔注射，Sigma-Aldrich，cat#F6627)对Balb/c供体小鼠(6-8周，Charles River，雄性或雌性)进行治疗。通过冲洗股骨和胫骨，从供体小鼠中采集骨髓细胞。在红细胞裂解(Stemcell Technologies，Grenoble，法国，产品编号07800)后，将有核细胞在移植培养基(RPMI+10%FCS+25ng/ml IL3(R&D Systems，Abington，英国，产品编号403-ML)、25ng/ml IL6(R&D Systems产品编号406-ML)、和50ng/ml干细胞因子(SCF，Bioconcept，Allschwill，瑞士，产品编号D-63120)中培养24小时。次日，在含有来源于用10μg p-MSCV-JAK2V617F-IRES-GFP载体(从Clontech公司购得的初始载体p-MSCV载体进行修饰)和10μg pCL-ECO载体(Imgenex，产品编号10045P)转染的293T的病毒粒子的1mL上清液存在下，以2×10⁶细胞/ml/孔将细胞转移到6孔板中。在2次旋转感染(在32℃以2500rpm旋转90分钟，Multifuge1S-R，Heraeus)后将未经选择的感染BM细胞再悬浮于Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中，然后将细胞注射(1-3xl0⁶，取决于感染率)入用BIOBEAM8000的γ射线辐照器(BEBIG GmbH，德国)致死性照射的Balb/c雌性受体小鼠((总剂量为9Gy或7Gy)相互间隔4小时以4.5或3.5Gy剂量照射)的尾静脉中。

每日监测动物，在主要体征恶化(连续2天以上的无改善的过度体重减轻，结合嗜睡和立毛)的情况下处死动物。

样品收集和分析

CBC和器官采集

在异氟烷麻醉下用20G针从尾静脉中抽血，或者在处死时从腔静脉抽血(终端手术)；利用自动完全和差分血细胞计数器(使用1：5稀释的在Sysmex血液分析仪器中的毛细管模式，XT2000iV，Sysmex Digitana AG，Norderstedt，德国)进行分析。对脾脏称重，以评价脾肿大。采集血液、脾脏、胸骨和肝脏，进行药代动力学、药效动力学分析。

利用流式细胞分析技术对血样中的GFP-阳性细胞进行检测

使用10微升全血来检测循环GFP-阳性细胞。简略地，将血液分配入96孔圆底板(Costar，产品编号3795)中，将红细胞(RBC)用200μl红细胞裂解缓冲液(Sigma，产品编号R-7757)裂解。在处于暗处的平板搅拌器上7分钟的培养期后，将细胞离心(5分钟，300g)，通过倒置平板而丢弃上清液。在FACS缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水(D-PBS)、3%FBS和0.02%叠氮化钠)中的3次清洗步骤后，将有核细胞再悬浮于200μl冷FACS缓冲液中，并进行处理以使用LSRII流式细胞仪(BDBiosciences，德国海德堡)进行GFP检测。

组织学(p-STAT5，乙酰化组蛋白H3，网硬蛋白)

采集胸骨和脾脏，在***中固定，修整，包埋入石蜡中，用显微切片机以4μm(标称)进行切片。

利用用于网硬蛋白纤维的银浸试剂盒(Bio-Optica，产品编号04-04080)，在胸骨上评估骨髓纤维化。

在脾脏和骨髓中，对化合物A的p-STAT5PD标记物和化合物B的乙酰化组蛋白H3PD标记物进行评估。简略地，取出全部脾脏，称重，置于解剖盘上。将脾脏横断地切成两半，利用解剖刀从中部取出两个相等部分。脾脏部分的厚度不允许超过3-4毫米。于室温下(pH=6.8-7.2)，将脾脏部分转移入经标记的组织盒（histocassettes）中，浸泡固定于中性缓冲***(NBF)中10%(v/v)(J.T.Baker，Medite，瑞士)。固定剂体积是组织体积的至少10倍。取出全部胸骨，于室温下在10%NBF中固定48小时，然后在PBS中清洗，在EDTA-柠檬酸缓冲液pH=7.5(Biocyc GmbH，Luckenwalde，德国)中于37℃下进行脱钙处理(3×24小时)。在PBS中进行最后一次清洗后，将组织切碎，以目标表面朝下的方式置于通用组织盒中，接着在TPC15Duo(Tissue Processing Center)中处理以便石蜡包埋。在滑动或旋转显微切片机(Mikrom International AG，瑞士)上，由各组织石蜡块切割将若干3μm厚度的切片，在45℃水浴中铺展开，固定在显微镜用载玻片上(Polysine，VWR International，Leuven，比利时)，在烘箱中于37℃下空气干燥过夜。从烘箱中取出干组织切片载玻片，置于线性染色机COT20(Medite，瑞士)的载物片架中进行全自动化H&E(苏木精和伊红)染色或者进行处理以便进行免疫组织化学(IHC)染色。为了IHC，用盖玻片覆盖并空气干燥的兔抗磷酸化STAT5抗体(克隆C11C5)和兔抗乙酰化组蛋白H3抗体(Millipore，MA，美国)对组织切片样品进行染色。

在组织学评价中，将BM细胞构成评价为细胞过多(3+)、正常细胞(2+)、和细胞过少(1+)。将脾脏结构评价为受损(1+)或保持原状(0)。基于细胞构成，将骨髓细胞、类红细胞和脂肪细胞的存在评价为0、1+、2+、3+。为了p-STAT5评价，利用Zeiss Mirax玻片扫描器(Scan Software version1.12，Zeiss AG，德国)以200×的最终放大倍数，由玻片生成数字玻片图像数据。利用Definiens eCognition软件(eCognition version XD1.5，Definiens AG，德国)执行p-STAT5-阳性和阴性细胞核的全玻片自动定量评估。将这些结果表示为阳性p-STAT5核相对于全部核的百分比。基于染色强度和阳性细胞的数量，将乙酰化组蛋白H3的染色记分为1+、2+、3+。

乙酰化赖氨酸的免疫印迹分析

利用Polytron均质机(IKA LaborTechnik，Ultra-Turra T25，全速1分钟)，将冷冻的脾脏样品在裂解缓冲液(RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl pH=7.2，120mMNaCl，1mM EDTA，6mM EGTA pH8.5，1%NP-40，20mM NaF，补充有0.1%SDS、2mM钒酸钠、10mM焦磷酸钠和一个抗蛋白酶混合物片(Roche，产品编号11836145001)中均质化，在均质化期间将样品保持在冰上。然后以10000rpm(15分钟，4℃)将匀浆离心，经过玻璃纤维过滤器过滤，于-80℃下冷冻。利用BCA蛋白测定试剂盒(Novagen，产品编号71285-3)测量匀浆的总蛋白含量。

利用4-12%Nupage凝胶(Invitrogen公司，产品编号WG1402BX10)将来自各样品的100μg总蛋白分解，利用半干印迹(BIORAD，半干转移***，产品编号170-3940)转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore Immobilon^TM，产品编号IPVH20200，Billerica，美国麻省)上。于室温下在封闭液(5%BSA，0.1%Tween-20溶解于PBS)中对膜进行1小时封闭，接着将膜在含有0.1%Tween-20的PBS中清洗30分钟，每10分钟更换一次。然后用以1:1000稀释于含有0.1%Tween-20和5%牛乳的PBS中的一级抗-乙酰化赖氨酸抗体(兔多克隆抗-乙酰化赖氨酸抗体，Cell Signaling公司，产品编号9441)于4℃下培养该膜过夜。次日，将膜在含有0.5%Tween-20的PBS中清洗30分钟，每10分钟更换一次，然后于室温下用抗-兔HRP偶联二级抗体(1：2000稀释于含有0.1%Tween-20和1%BSA的PBS中)培养1小时。再次以如上述方式将膜清洗，用ECL+(Amersham Biosciences，产品编号RPN2132)进行显影，以检测脾脏提取物中的乙酰化赖氨酸。

利用β微管蛋白或GAPDH检测总蛋白

为了检测总β微管蛋白的水平，于60℃下将膜在含有0.1%Tween20和2%SDS的PBS中剥离30分钟，在含有0.1%Tween20的PBS中清洗4到5次，于4℃下用一级抗P-微管蛋白抗体(小鼠单克隆抗P-微管蛋白抗体，Sigma，产品编号T-4026；1:5000稀释于含有0.1%Tween20和3%BSA的PBS中)中培养过夜。次日，将膜在含有0.5%Tween20的PBS中清洗30分钟(每10分钟更换一次)，然后于室温下用抗小鼠HRP偶联二级抗体(1：5000稀释于含有0.1%Tween20和1%BSA的PBS中)培养1小时。将膜再次以如上述方式清洗，用ECL进行显影，以检测β-微管蛋白。

按如下方式检测GAPDH水平：再加载样品(40μg总蛋白)，于4℃下将膜在一级抗GAPDH抗体(兔抗GAPDH抗体，Cell Signaling，产品编号2118；1：5000稀释于含有0.1%Tween-20和3%BSA的PBS中)中培养过夜。次日，在含有0.5%Tween20的PBS中将膜清洗30分钟(每10分钟更换一次)，然后于室温下用抗兔HRP偶联二级抗体(GE Healthcare，产品编号NA931；1:1000稀释于含有0.1%Tween20和1%BSA的PBS中)培养1小时。再次以如上述方式清洗膜，用ECL进行显影，以检测脾脏提取物中的GAPDH蛋白。

用于对化合物A和化合物B进行定量的生物分析法（Bioanalytics）(LC/MS-MS)

利用UPLC/MS-MS分析测定同时地测定化合物A和化合物B在血浆和组织中的浓度。利用***(M.P.Biomedicals，Irvine，CA，美国)在相同体积的HPLC-水(用于层析的水，Merck)中对组织进行均质化。在将25μl内标混合物(1μg/ml)添加到血液或组织匀浆的分析等分试样(25μl)中之后，通过添加200μl乙腈而使蛋白质沉淀。将上清液转移入清洁的小瓶中。在蒸发至干后，将样品再溶解于60μl乙腈/水(1/1v/v)中。在具有由0.1%甲酸的水溶液(溶剂A)与0.1%甲酸的乙腈溶液(溶剂B)的混合物所组成的移动相的ACQUITY UPLC BEH C18柱(Waters^TM，1.7μm粒径，2.1×50mm)上分离此溶液的等分试样(5μl)。采用梯度设计，流量为600μ1/分钟。在用95%溶剂A平衡后，注射5μl的样品。在0.25分钟反应时间后，用5-100%溶剂B的线性梯度对样品进行0.65分钟洗脱，接着保持0.35分钟。通过再平衡(0.25分钟)到起始条件，而制备用于下一个样品的柱。将柱洗脱液直接地导入由Masslynx4.1软件控制的三级四极质谱仪TQD(Waters公司，Milford，MA，美国)的离子源。利用电喷雾正电离(ESI+)多反应监测对分析物进行MS/MS检测。使用产生化合物A的307.0-->m/z186.0的离子跃迁的前体。同时地对产生化合物B的350.1-->m/z142.9的离子跃迁的前体进行记录。将两种化合物的血浆和组织定量限(LOQ)分别设定为9ng/ml和9ng/g(CV和总体偏差小于30%)。利用QuanLynx^TM4.1(Micromass)和Excel^TM2007(微软公司)执行回归分析和进一步的计算。基于分析物/来自校准曲线的IS的峰面积比倒算出未知样品的浓度，该校准曲线是使用从用载剂治疗动物中所获得空白血液或组织中掺加的校准样品而形成。

维持条件

将Balb/cByJIco小鼠(C.River，法国)保持在高压釜灭菌的笼(每笼最多5只动物)中。光/暗循环如下：12小时暗、12小时光照(从上午6：30至下午6：30光照)。给动物随意喂食湿润的γ射线辐照食物以及含抗生素(BACTRIM，最终浓度为4mg的Sulfamethoxazolime、0.8mg甲氧苄氨嘧啶，Roche Pharma AG，Reinach，瑞士，5ml溶解于250ml饮用水)的高压釜灭菌水，以帮助辐照后动物的恢复并且避免移植后前2周的感染。

测试化合物和制剂

化合物B是以乳酸盐的形式通过静脉或腹腔内注射而给药。分别以1.5mg/ml、1mg/ml和0.5mg/ml的浓度将化合物B的乳酸盐配制于等渗D5W(5%右旋糖；B.Braun，批号395147)中。该溶液于室温下稳定达10天。以10ml/kg的体积每周3次给予治疗药物。最终等效游离碱剂量分别为11.90、7.94和3.97mg/kg。在附图中，将这些剂量表示为完整数值。

以7.9mg/ml的浓度下，将化合物A的单磷酸盐配制于0.5%HPMC(Pharmacoat603，Dow Chemical Plaqueline，美国)中。溶液在室温下稳定4天。每日2次以10ml/kg体积给予治疗药物。最终等效游离碱剂量为60mg/kg。

这两种化合物同时地给药。

统计

附图和表格中所示的结果表示平均值±SEM。利用非配对t-检验或Rank-Sum检验，对体重变化百分比和脾脏重量、网织红细胞、WBC计数、Hct和组织学数据的绝对值或转换值(log10，或者如规定的其它)进行分析，从而对单药治疗组与载剂组进行比较；或者执行单因素方差分析接着进行Dunnett's检验从而对治疗组与载剂组进行比较。利用Tukey's检验进行多重比较。所有的比较是在处死日进行。将显著性水平设定为p<0.05。利用Windows的GraphPad Prism(GraphPad Software有限公司)执行计算。

实施例B的结果：

化合物A于化合物B组合的体内药效和耐受性

为了检测可利用与化合物A的组合提高化合物B的药效的假设，使用化合物A与JAK1/2抑制剂化合物A的组合对用JAK2V617F转导骨髓细胞移植的Balb/c小鼠进行治疗。选择化合物A的获得中间疗效的剂量，以便评估不同剂量化合物B与JAK抑制剂化合物A组合的效果。

在BMT后第27天，基于Hct值(在此实验中平均值为67%，N=9/组)将小鼠随机分组，以单一药物或组合的形式用化合物B(8mg/kg，每周3次MWF，腹腔注射)和化合物A(60mg/kg，ql2h，口服)进行治疗。单一的化合物B显示一些体重减轻(-5%，平均值)。当把化合物B与化合物A组合时此体重减轻明显较高(-10%，平均值，图7和表4)。化合物B单独给药减小脾脏重量但未减小到正常水平。化合物A显示脾脏重量减小的取向但有高差异性(在67至1153mg的范围内)。该组合提高在脾脏重量/体积方面的疗效，其在3周治疗后恢复正常或者甚至低于正常的历史范围(在6/9只动物中)(图8和表4)。该组合显示对网织红细胞计数具有较强效果的趋势(在一些动物中观察到非常低的值<0.1xl0¹²/L)，但此效果与单一药物治疗组无显著性差异。当化合物B单独给药以及与化合物A组合给药时，WBC计数减小(尽管在此实验中无白细胞增多，除了载剂组中的1只动物和化合物A组中的1只动物外)。PLT计数受化合物B单独治疗以及与化合物A组合的影响(图11)。在化合物B和组合组的此项研究中，观察到等位基因负荷替代物读数(GFP-阳性循环细胞)减小的趋势(表4)。

在所有药物治疗组中观察到骨髓细胞过多的减轻(组合>化合物A=化合物B)。治疗改善脾脏结构，在组合组中观察到最强效果(组合>化合物A>化合物B)。虽然有高差异性，化合物A和组合组显示减小纤维化记分的倾向，如通过胸骨切片上的网硬蛋白染色所评估地。

当以单一药物以及与化合物B组合形式用化合物A治疗时，利用IHC的PD标记物评估显示p-STAT5标记物的明显减小。当用单独的或者以组合的化合物B治疗时，观察到乙酰化组蛋白H3的明显增加，如去乙酰化酶抑制的替代物读数。

图13-图19示出了采用不同染色方法的骨髓和/或脾脏图像。

组合方案对化合物在组织中暴露没有大的影响(表5)。

该实施例表明，化合物A与化合物B组合改善在脾脏重量/体积方面的疗效。

表4.处死日的结果

用JAK2^V671F骨髓转导细胞移植的Balb/c雌性小鼠接受载剂；按照M/W/F方案，剂量为8mg/kg，腹腔注射(游离碱等效物)的化合物B；剂量为60mg/kg(游离碱等效物)，每12小时一次的化合物A；或者两种药物的组合，连续21天。将处死时体重和脾脏重量的变化描述为平均值±SEM。N=7-9/组。在处死日*p<0.05相对于载剂，#p<0.05相对于化合物A，

相对于化合物B(单因素方差分析，接着执行Dunnett's检验或Tukey's检验。将脾脏重量值的倒数形式以及WBC和PLT计数log₁₀转换值用于统计分析)。在载剂(388.3xl0⁹/L)和化合物A(139.9×l0⁹/L)组中检测到1个WBC计数的异常值，在括号之间给出无异常值的新平均值±SEM值。

表5.治疗后的水平

在化合物B和/或化合物A最后一次给药后2小时，将各给药组中的动物处死，对血液、脾脏、骨髓和肝脏进行采样进行PK分析。剂量是以游离碱等效物来表示。该表显示了血液[μmol/l]和组织[nmol/g]中的平均化合物B和化合物A水平±SEM。N=9/组。

实施例C

临床试验

1b期、非盲、多中心、单臂、剂量发现研究正在进行中，以在原发性骨髓纤维化(PMF)、真性红细胞增多症后骨髓纤维化(PP-MF)、或原发性血小板增多症后骨髓纤维化(PET-MF)患者中评估帕比司他与鲁索利替尼口服组合的安全性和药代动力学。

图20示出了研究设计和方法。

该试验旨在确定以下中的一个多个：

(1)确定MF患者中鲁索利替尼与帕比司他组合的MTD和/或RPIID；

(2)评价鲁索利替尼与帕比司他向MF患者口服联合给药的安全性；

(3)描述在变化剂量下鲁索利替尼，作为单一药物以及与帕比司他组合向MF患者给药时的药代动力学特征；以及/或者

(4)描述变化剂量下的帕比司他与鲁索利替尼的组合在MF患者中的药代动力学特征。

入选标准：

A.患者具有文件记载的PMF、PPV-MF或PET-MF的诊断，不考虑其JAK2V617F突变状态。

B.以PMF的世界卫生组织(WHO)标准作为指导，该研究包含根据国际预后评分***(IPSS)标准被指定为中等-1、-2，或者高危，并且具有前缘下≥5cm的可感知脾肿大的患者。

C.患者必须已经具有以下危险因素中的至少1个：

a.存在全身症状(在周期1第1天[C1D1]的前一年体重减轻>基线值的10%，不明原因的发热，或者持续超过1个月的过度盗汗)

b.明显的贫血(在筛选时显示血红蛋白<10g/dL0，)

c.白细胞增多(白细胞计数>25×10⁹/L的病史)

d.循环的幼淋细胞（Circulating blasts）>1%

D.剂量递增是以带超剂量控制的Bayesian逻辑回归模型作为指导，并且剂量递增将取决于第1周期中的剂量限制性毒性(DLT)以及其它安全性发现。

E.各给药群是由>3名可评估患者组成。

F.在任何给定剂量水平下将需要>9名患者的数据来确定RP2D和/或MTD。

G.在第1天在单剂量鲁索利替尼单独给药和在第2和第6天与帕比司他组合给药后采集的系列血样，利用液相色谱串联质谱法来评估血浆浓度。

H.利用非房室模型分析获得药代动力学参数。

结果：

在该研究中推荐采用7个群。该研究仍然在进行中，目前为止仅从第1-第3群中获得数据。

表6示出了第1-第3群中的患者数量和疾病亚型。

图21示出了第1群中随时间推移的可感知脾脏长度。

表7示出了第1群中的最佳可感知脾脏长度反应和症状反应。

图22示出了第2群中随时间推移的可感知脾脏长度。

表8示出了第2群中的最佳可感知脾脏长度反应和症状反应。

图23示出了第3群中随时间推移的可感知脾脏长度。

表9示出了第3群中的最佳可感知脾脏长度反应和症状反应。

表10报道了在第1-3群中怀疑与研究治疗有关的3/4级不良事件。在第1群或第3群中未观察到DLT或者SAE。在第2群中，报道了4级血小板减少症的1个DLT。也存在3级恶心和3级腹泻的1个SAE。目前为止未观察到临床显著性EKG异常。

表6.在第1、2和3群中的鲁索利替尼和帕比司他剂量

剂量递增是以带超剂量控制的Bayesian逻辑回归模型作为指导，并且剂量递增将取决于在各周期中的剂量限制性毒性(DLT)以及其它安全性发现。

各给药群是由≥3名可评估患者组成。

在任何给定剂量水平下将需要≥9名患者的数据来确定RP2D和/或MTD。

在第1天单剂量的鲁索利替尼单独给药，以及在第2和第6天与帕比司他组合给药后采集的系列血样通过LC-MS/MS来评估血浆浓度。

利用非房室模型分析获得PK参数。

表7.在第1群中的最佳可感知脾脏长度反应和症状反应

^a患者经历了幼淋细胞计数升高并且离开研究执行干细胞移植

表8.第2群中的最佳可感知脾脏长度反应和症状反应

^a患者经历4级血小板减少症并且由于DLT标准而离开研究

表9.在第3群中的最佳可感知脾脏长度反应和症状反应(虚线表示在基线处此症状不存在)

表10.第1、2、3群中怀疑与研究治疗^a,b有关的3/4级不良事件

PAN：帕比司他；RUX：鲁索利替尼

^a在全部排中对于主要器官***分类中的多发性AE患者仅进行一次计数。

^b在该治疗的AE类型中，在一次治疗中对AE多次复发患者仅进行一次计数。

·在第1群或第3群中未观察到DLT或SAE。

·在第2群中，报道了4级血小板减少症的1例DLT。

还存在3级恶心和3级腹泻的1例SAE。

·目前为止未尚观察到临床显著性EKG异常。

目前为止临床研究表明鲁索利替尼与帕比司他组合似乎耐受性良好并且具有前途的活性。在目前所采用鲁索利替尼和帕比司他给药中，观察到低发生率的3/4剂贫血症和血小板减少症。早期的数据提示在鲁索利替尼与帕比司他之间无潜在药物相互作用。其它的群将确定该有前途组合在MF患者治疗中的最佳给药方案。

缩写的列表：

Claims

1.一种组合物，该组合物包括：化学式(A)的化合物A((R)-3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基-3-环戊基丙腈)：

或其药学上可接受盐；以及

化学式(B)的化合物B(N-羟基-3-[4-[[[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)-乙基]-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺)：

或其药学上可接受盐。

2.如权利要求1所述的组合物，还包含药学上可接受载体。

3.如权利要求1所述的组合物，其处于单一制剂或者单位剂型中。

4.一种治疗需要治疗的受试对象中的癌症的方法，该方法包括给予所述受试对象有效量的如上述权利要求中任一项所述的组合物。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述癌症是骨髓增殖性肿瘤。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述骨髓增殖性肿瘤选自由以下组成的组：慢性髓性白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性或特发性骨髓纤维化(PMF)、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病、慢性粒单核细胞白血病、幼年型粒单核细胞白血病、高嗜酸性粒细胞综合症、***性肥大细胞增生症、非典型慢性髓细胞性白血病。

7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述受试对象是人。

8.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述治疗包括联合给予化合物A和化合物B。

9.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中化合物A和化合物B处于单一制剂或单位剂型中。

10.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述治疗包括基本上在同时给予化合物A和化合物B。

11.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述治疗包括在不同时间给予化合物A和化合物B。

12.如权利要求11所述的方法，其中将化合物B给予所述受试对象，接着给予化合物A。

13.如权利要求11所述的方法，其中将化合物A给予所述受试对象，接着给予化合物B。

14.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中化合物A和化合物B处于分开的制剂或单位剂型中。

15.如权利要求7所述的方法，其中鲁索利替尼是以3-7mg每日2次给药，帕比司他是以8-12mg每隔一周、每周3次给药。

16.如权利要求7所述的方法，其中鲁索利替尼是以8-12mg每日2次给药，帕比司他是以8-12mg每隔一周、每周3次给药。

17.如权利要求7所述的方法，其中鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以8-12mg每隔一周、每周3次给药。

18.如权利要求7所述的方法，其中鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以10-20mg每隔一周、每周3次给药。

19.如权利要求7所述的方法，其中鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以10-30mg每隔一周、每周3次给药。

20.如权利要求7所述的方法，其中鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以10-30mg每隔一周、每周3次给药。

21.如权利要求7所述的方法，其中鲁索利替尼是以10-20mg每日2次给药，帕比司他是以20-40mg每隔一周、每周3次给药。