CN104371994A

CN104371994A - 一种结合常压室温等离子体诱变方式高通量筛选重组酶高产枯草芽孢杆菌宿主的方法

Info

Publication number: CN104371994A
Application number: CN201410550898.XA
Authority: CN
Inventors: 杨海泉; 马樱芳; 宋江宁; 陈坚; 堵国成; 沈微; 陈献忠; 樊游; 刘龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-10-16
Filing date: 2014-10-16
Publication date: 2015-02-25

Abstract

本发明阐述了一种新型结合诱变与高通量筛选高产重组酶菌株的方法，属于基因工程、酶学及发酵技术领域。采用ARTP诱变技术对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600宿主进行诱变，利用筛选平板初筛、96孔板高通量复筛、摇瓶发酵筛选验证的方式获得一株高产重组酶的突变株。以碱性淀粉酶为筛选模式酶，高通量筛选出产酶酶活力较高的突变株B.subtilis WB600-mutl2，发酵得酶活力为186.4U/mL，为出发株酶活的130.3％。过氧化氢酶在B.subtilis WB600-mut12中异源表达后，酶活力提高至出发宿主酶活的135.0％。该发明具有重要的实用与经济价值。

Description

一种结合常压室温等离子体诱变方式高通量筛选重组酶高产枯草芽孢杆菌宿主的方法

技术领域

本发明涉及基因工程、酶学以及发酵技术领域，特别是涉及结合ARTP诱变技术和高通量筛选一株高产重组酶B.subtilis菌株的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种简单的革兰氏阳性菌，产芽孢，遗传学特性研究较为清楚。此外，由于具有非致病性、易于发酵和具有较强的蛋白分泌和生产能力等优点，是目前原核表达***中分泌表达外源蛋白的理想宿主。

工业酶制剂作为生物催化的中心，在大宗生化品的生产中发挥着重要的作用。常用的工业酶制剂可以基本分为二类：一类是水解酶类，包括淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、乳糖酶等，占市场销售额的75％以上，目前约有60％以上的酶制剂已用基因改良菌株生产；第二类为水解酶，占市场销售额10％左右，并有逐年增加的趋势，主要为分析试剂用酶和医药工业用酶。在食品供应站，淀粉加工所以的酶仍然占最大比例，为15％；其次是乳制品工业，占14％。工业酶广泛应用于食品、纺织、制革等工业及环境保护，因此工业酶制剂产量的提高有助于实现更大的经济效益。

近几年，利用ARTP诱变筛选突变菌株的技术发展比较迅速，已成为相当活跃的一个交叉学科研究领域。与传统的诱变技术及其他的等离子体技术相比，ARTP生物诱变具有多种优点：在常压下可以产生多种分布均匀的高活性粒子，能瞬时作用于微生物使其产生致畸突变；采用低压射频，有较高的安全性；产生的等离子体温度接近室温，可以避免温度过高对微生物造成的热损伤；另外，ARTP设备简单、操作简易、运行成本较低。目前获得重组酶高产菌株的方法主要有：从自然界中筛选、利用传统的物理化学方法诱变、发酵过程优化及构建重组菌等。因此，可以尝试结合ARTP诱变技术及96孔板高通量筛选获得重组酶高产菌株，解决当前工业酶产量偏低的现状。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于ARTP诱变技术和高通量筛选高产重组蛋白B.subtilis宿主的方法，有效提高重组酶酶活(本专利以碱性淀粉酶为筛选模式酶，以过氧化氢酶为宿主验证酶)。

本发明的技术方案是：将出发株B.subtilis WB600经等离子体诱变后，将碱性淀粉酶重组质粒转化B.subtilis WB600突变库，利用淀粉-台盼蓝营养平板进行筛选，基于透明圈大小比对进行初筛，然后采用96孔板进行高通量复筛，将筛选获得高产重组碱性淀粉酶的菌株采用摇瓶培养再进行复筛验证，最终获得重组碱性淀粉酶高产菌株。

其具体步骤如下：

1)出发株活化：将B.subtilis WB600进行划线培养，挑单菌落于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养8～12h后，再转接新鲜LB培养基，进行同步培养；

2)ARTP诱变处理：用无菌生理盐水洗涤菌体，加生理盐水重悬菌体，稀释菌体浓度至10^6～8个/mL，吸5～15μL均匀涂于载片上，置于处理源下，进行诱变处理；

3)后培养：将诱变处理过的菌液(连同载片一起)，立即放入新鲜的LB培养基中，经2～3h后培养，稀释菌体浓度至10^5～7个/mL，涂布于新鲜LB平板上培养；

4)重组酶高产菌株筛选：将含有重组酶基因的重组质粒转化步骤3)中诱变获得的突变体文库，得到含有重组酶质粒的B.subtilis WB600突变体文库；将文库中的突变体转接于淀粉-台盼蓝营养平板上，培养后观察透明圈的大小，筛选菌落小透明圈大的突变株；进一步进行96孔板高通量筛选，最终通过摇瓶发酵验证。

以上所述的菌体用无菌生理盐水洗涤2～6次，然后再重悬于生理盐水中，制得菌悬液(OD₆₀₀约为1.5～4.5)；适当稀释OD₆₀₀在1.0～3.0之间，以免重叠效应影响诱变的均匀性。步骤2)中ARTP诱变处理的参数设置为：气流量6～14slm、射频功率60～140W、时间20～40s、距处理源距离2mm。等离子体诱变后进行2～3h后培养，使DNA损伤在SOS修复中得到突变，并使突变更加稳定。

在上述筛选方法中，通过后培养涂布平板得到突变体文库。将含有碱性淀粉酶基因的重组质粒转化突变体文库，获得含有碱性淀粉酶重组质粒的B.subtilis WB600突变体文库。将突变体转移至淀粉-台盼蓝营养平板进行筛选，通过透明圈的大小筛选高产重组酶突变株，然后进行96孔板高通量复筛，获得少量(<20个)高产突变体，最后采用摇瓶发酵验证高产菌株。所用的淀粉-台盼蓝营养培养基成分为：可溶性淀粉 0.5～1.5％、台盼蓝 0.02～0.08％、NaCl 0.5～1.5％、Yeast Extract 0.2～0.8％、Tryptone 0.5～2.0％、琼脂 1.0～2.5％。

种子培养基为LB培养基，37℃培养8～12h后，按0.5～3.0％的接种量接种于发酵培养基中。高通量筛选采用96孔板，每孔装液量500～1000μL，所用发酵培养基其成分及配制步骤为：先配磷酸缓冲液，称取1.5～3.0g KH₂PO₄和10.0～15.0g K₂HPO₄，定容至100mL；Yeast Extract 18.0～30.0g、Tryptone 8.0～16.0g，甘油2.0～6.0mL，溶于900mL水中；灭菌，待磷酸缓冲液冷却至60℃左右时，加入900mL培养基中，摇匀，待用。摇瓶发酵培养基成分为：可溶性淀粉 0.2～0.8％、大豆蛋白胨 0.5～2.5％、NaCl 0.5～1.5％、豆饼粉 1.0～2.0％，装液量为15～80mL/250mL，发酵温度为37℃，发酵培养时间为48～72h。用DNS法测定碱性淀粉酶酶活。

附图说明

图1淀粉-台盼蓝营养平板初筛透明圈

图2 96孔板高通量筛选结果

图3 12号和20号突变菌株摇瓶验证结果

具体实施方式

为了对本发明有更深入的了解，现结合具体的应用实例对本发明做进一步的说明。

实施例1：利用常压室温等离子诱变方式对B.subtilis WB600进行诱变

将出发株B.subtilis WB600在LB平板进行活化培养，挑取单菌落于新鲜LB液体培养基中，培养温度设定为37℃，装液量为250mL三角瓶装20mL培养基，卡那霉素的工作浓度为50μg/mL，转速200rpm，培养时间10h；按50％的接种量转接新鲜LB培养基，2～3h后待菌体处于同步对数生长状态时，吸取1mL菌液，离心后用无菌生理盐水洗涤3～5次，适当稀释至细胞浓度OD₆₀₀＝1.5～2.0；吸取10μL菌液均匀涂在灭菌冷却后的载片上；以He为工作气体，射频功率为100W，气体流量10slm，处理时间30s。

对等离子体诱变后的菌体进行后培养操作，将处理过的菌(连同载片)，立即放入5mL装有新鲜LB液体培养基的离心管中，装液量为1mL，封口膜封口，充分震荡后于37℃，200rpm，后培养2～3h，使DNA在SOS修复中产生种类丰富的突变位点，并使突变稳定遗传。

实施例2：诱变后碱性淀粉酶高产菌株的筛选

(1)淀粉-台盼蓝营养平板初筛

将后培养的菌液梯度稀释至10^-4，每个梯度分别涂两个LB平板，37℃培养12h得到的突变体文库，将含有碱性淀粉酶基因的重组质粒转化突变体文库，得到含有碱性淀粉酶重组质粒的B.subtilis WB600文库，用无菌牙签逐个点种淀粉-台盼蓝营养平板，37℃培养8～10h，挑选出透明圈大于出发菌的菌落(图1)。

(2)96孔板高通量筛选

将上一步骤挑选出来的菌落分别接于种子培养基中，进行96孔板高通量筛选，每株做3个平行实验，在37℃下，发酵48h，测定酶活，酶活测定结果如图2。其中，12号和20号酶活产量提高最为显著，分别提高至出发菌株的130.0％和121.0％。

(3)摇瓶发酵筛选验证

将高通量筛选得到的12号和20号菌进行摇瓶发酵，200rpm，培养12h，按2％的接种量转接于发酵培养基中，250mL三角瓶装液量30mL，发酵温度37℃，转速200rpm，发酵60h后，取样离心后，用DNS法测酶活。结果显示，摇瓶结果与96孔板复筛结果相似，12号突变株(12#)酶活提高至出发株(ck)的130.3％，酶活达到186.4U/mL(图3)。

实施例3：过氧化氢酶在诱变宿主B.subtilis WB600-mut12中的过量表达

将含有碱性淀粉酶重组质粒的B.subtilis WB600-mut12宿主，采用培养基中添加SDS至其最终浓度为0.002～0.005％的方法消除质粒，获得不含有重组质粒的B.subtilis WB600-mut12宿主。将已构建好的过氧化氢酶重组质粒转化已消除质粒的B.subtilis WB600-mut12宿主，获得可表达重组过氧化氢酶的重组菌。发酵后测定酶活，结果显示，诱变后的B.subtilis WB600-mut12较出发宿主产过氧化氢酶能力提高至135.0％。

Claims

1.一种结合常压室温等离子(ARTP)诱变方式高通量筛选高产重组酶(如碱性淀粉酶)B.subtilis突变株的方法，其特征为：

1)出发菌活化：将B.subtilis WB600进行划线培养，挑单菌落于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养8～20h后，转接新鲜LB培养基，进行同步培养；

2)ARTP诱变处理：用无菌生理盐水洗涤菌体后再重悬菌体，适当稀释菌体浓度至10^6～8个/mL，吸5～15μL均匀涂于载片上，置于处理源下，进行诱变处理；

3)后培养：诱变处理过的菌液，立即放入新鲜的LB培养基中，后培养2～3h后，适当稀释菌体浓度为10^5～7个/mL，涂布于新鲜的LB平板上培养；

4)重组酶高产菌株筛选：将含有重组酶基因的重组质粒转化步骤3)中诱变获得突变体文库，得到含有重组酶重组质粒的B.subtilis WB600突变体文库；将文库中的突变体逐个点种于筛选平板(对于该专利中突变宿主筛选采用的重组碱性淀粉酶，其筛选平板为淀粉-台盼蓝营养平板)上，培养8～12h后观察透明圈大小，菌落小透明圈大的可能为高产碱性淀粉酶突变株；缩小筛选范围后，进行96孔板高通量筛选，最终进行摇瓶发酵验证高产菌株。

2.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，其特征在于所述的2)中用无菌生理盐水洗涤2～6次，重悬制备菌悬液(OD₆₀₀约为15～45)；适当稀释OD₆₀₀在1.0～3.0之间，不致重叠效应影响诱变处理的均匀性；处理参数设置为：气流量6～14slm、射频功率60～140W、时间20～40s、距处理源距离2～3mm。

3.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，其特征在于：所述3)中，进行2～3h后培养，使突变中伴随产生的DNA损伤获得修复，并使突变更加稳定。

4.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，该专利中突变宿主筛选采用重组碱性淀粉酶作为模式酶，其特征在于：转化得到含有碱性淀粉酶重组质粒的B.subtilis WB600突变体文库，根据淀粉-台盼蓝营养平板周围透明圈大小得到高产突变株，所用的培养基成分为：可溶性淀粉0.5～1.5％、台盼蓝0.02～0.08％、NaCl 0.5～1.5％、Yeast Extract 0.2～0.8％、Tryptone0.5～2.0％、琼脂1.0～2.5％，酶活测定方法选用DNS法。

5.根据权利要求1所述的结合ARTP诱变和高通量筛选重组酶高产B.subtilis突变株的方法，其特征在于：利用96孔板进行文库中高产突变体的高通量筛选，所用发酵培养基成分及配制步骤为：先配磷酸缓冲液，分别称取1.5～3.0g KH₂PO₄和10.0～15.0g K₂HPO₄，定容至100mL；Yeast Extract 18.0～30.0g、Tryptone 8.0～16.0g，甘油2.0～6.0mL，溶于900mL水中；灭菌，待磷酸缓冲液冷却至60℃左右时，加入900mL培养基中，摇匀，待用。