CN104087628A - 一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,包括菌种的活化、种子液制备及液体摇瓶发酵,在所述液体药瓶发酵中,向液体发酵培养基加入高浓度KCl,所述高浓度KCl为0.5-30g/L;所述菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCCNO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心。该方法在发酵初期在液态发酵培养基中添加质量体积浓度为0.5-30g/L的KCl,在保持高分子量高产量γ-聚谷氨酸的基础上,将粘度降为原来的10-80%,解决γ-PGA发酵生产发酵液粘度大的瓶颈问题,有很好的应用前景;且成本低,为工业化生产中产物的分离纯化降低成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域,特别涉及到一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是由L-谷氨酸或者D-谷氨酸通过γ-酰胺基结合形成的一种水溶性的生物高分子聚合物。具有很强的吸水性,可降解性,水解性等众多特性,因此被广泛用于食品、农业、医药、绿化以及水处理等多个领域,具有极大的开发价值和应用前景。
根据现在文献报道,γ-PGA是某些细菌荚膜的主要成分,其作用是为了保护菌体免受外界恶劣环境的影响。故其合成一般是在菌体发酵的中后期,大量代谢废物积累,营养物质缺乏促进了细菌分泌合成γ-PGA进行自身保护。因此可以认为合成分泌γ-PGA是细菌应对外界恶劣环境的一种适应机制。目前研究的热点多集中于微生物发酵生产,提高产量,对如何提高分离提取收率的相关报道非常少。
一般认为γ-PGA发酵液的粘度随着产量和分子量的增加而增大,因此在液态发酵的后期由于γ-PGA浓度增大导致发酵液粘度大大增加,影响氧的传质,进而影响γ-PGA的合成,这也是提高γ-PGA浓度的一个最大的瓶颈问题。通过加酸或碱调节发酵液pH<5或pH>8可明显降低发酵液的粘度(其中pH3.5时粘度仅为pH6.5时的1/50左右)。将pH3.5的发酵液离心除菌(10000g,10min)后超滤浓缩(滤膜孔径0.45μm,平均压力0.08Mpa)1倍,再加入95%乙醇提取γ-PGA,与pH中性时相比,可减少50%以上的能量消耗及40%的溶剂,但γ-聚谷氨酸损失约10%。加酸或加碱处理可使发酵液中γ-PGA的分子结构发生改变,分子质量降低,这对生产高分子质量的γ-聚谷氨酸不利的。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,该方法在发酵初期在液态发酵培养基中添加质量体积浓度为0.5-30g/L的KCl,在保持高分子量高产量γ-聚谷氨酸的基础上,将粘度降为原来的10-80%,解决γ-PGA发酵生产发酵液粘度大的瓶颈问题,有很好的应用前景;且成本低,为工业化生产中产物的分离纯化降低成本。
为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,包括菌种的活化、种子液制备及液体摇瓶发酵,其特征在于:在所述液体药瓶发酵中,向液体发酵培养基加入高浓度KCl,所述高浓度KCl为0.5-30g/L;所述菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCC NO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心。
以上所述高浓度KCl为5-30g/L。
以上所述液体发酵培养基成分还包括葡萄糖30-50g/L、谷氨酸钠20-40g/L、酵母膏2.5-4.0g/L、KH2PO40.5-1g/L、MgSO40.1-0.15g/L,pH6.5-7.5,蒸馏水配制。
以上所述液体摇瓶发酵的发酵条件为:种子液按体积比1-6%的接种量接入已灭菌的液体发酵培养基中,在40-50℃摇瓶培养20-30h。
以上所述菌种的活化,是将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上,40~50℃培养8-16h,于2~8℃作短期保藏;所述固体斜面培养基的组成为:葡萄糖8~12g/L,酵母膏3~6g/L,谷氨酸钠3~6g/L,MgSO4·7H2O0.1~0.2g/L,KH2PO40.3~0.5g/L,琼脂10~15g/L,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制。
以上所述种子液制备,是将斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160~250rpm,42℃-50℃摇瓶培养16h-18h;所述液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10~50g/l,酵母膏2~10g/l,谷氨酸钠5~20g/l,MgSO4·7H2O0.1~0.5g/l,KH2PO40.5~2g/l,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1.本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28为出发菌株,在高浓度KCl条件下发酵生产γ-PGA,一方面K+增加了基质的渗透压,另一面K+是γ-PGA合成酶的促进离子,因此给γ-PGA合成提供了有利的环境,结果是在保持甚至提高产量的基础上,使分子量提高到了3000-4000kDa,将粘度降为原来的10-80%,解决了γ-PGA浓度增大导致发酵液粘度增大的技术问题,有很好的应用前景。
2.本发明添加KCl成本低,可以为工业化生产中产物的分离纯化降低成本。
附图说明
图1为γ-聚谷氨酸的分子量电泳图,
图上从左到右依次为γ-聚谷氨酸标品、实施例1-3γ-聚谷氨酸对照组以及加入KCl浓度0.5、1、5、10、15、20g/L后得到的γ-聚谷氨酸。
序列表是菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28,CCTCC M2012347的16S rDNA核苷酸序列信息。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
本发明所利用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28性状特征为:
(1)菌体形态特征:
菌株CCTCC NO:M2012347在固体斜面培养基上50℃培养16h后电镜观察,菌体呈杆状,大小0.7-0.9×2.0-3.0μm,可运动,革兰氏染色阳性。菌株CCTCC NO:M2012347在固体斜面培养基上50℃培养30h后芽孢染色观察,可见明显芽孢。
(2)菌落形态特征:
菌株CCTCC NO:M2012347在固体分离培养基平板上50℃培养24h后,在添加谷氨酸的平板上,菌落圆形、表面呈树突状、边缘分泌粘稠物、菌落直径达1.5-2.0cm;在不添加谷氨酸的平板上,菌落干燥、扁平、中央凹陷、边缘不规则。
菌株CCTCC NO:M2012347在液体分离培养基中培养,在液体表面可形成菌膜,培养液略显浑浊。
(3)CCTCC NO:M2012347生理生化性质如下表3所示。
表1
注:所列表中的“+”为生长良好或呈阳性;“-”为不生长或呈阴性。
(4)CCTCC NO:M2012347的16S rDNA序列分析
利用通用扩增引物1492r(5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’,Y=T or C)和27f(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)对该菌株16S rDNA进行扩增测序,测得序列长度1365bp。将所得序列提交至GenBank数据库,获得序列编号GenBank ID:JN815234,与GenBank所提供的基因序列进行Blast比对分析,构建***发育树。结果表明CCTCC NO:M2012347与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源性为99%。目标菌株经菌体、菌落形态特征,生理生化特征和16S rDNA序列分析确定该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28,该菌株已在中国典型培养物保藏中心进行保藏,其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCC NO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
实施例1:
(1)菌种的活化
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上,40℃培养16h,于4℃作短期保藏;固体斜面培养基的组成为:葡萄糖8g/L,酵母膏3g/L,谷氨酸钠3g/L,MgSO4·7H2O0.1g/L,KH2PO40.3g/L,琼脂10g/L,pH值6.5,蒸馏水配制。
(2)种子液的制备
将斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160rpm,42℃摇瓶培养16h;液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏2g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO4·7H2O0.1g/l,KH2PO40.5g/l,pH值6.5,蒸馏水配制。
(3)液体摇瓶发酵
种子液按体积比1%的接种量接入已灭菌的液体发酵培养基中,在40℃摇瓶培养20h,转速160r/min,。发酵培养基的成分:葡萄糖30g/L、谷氨酸钠20g/L、酵母膏2.5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO40.1g/L、KCl5g/L,pH6.5,其余为蒸馏水。
对照组和实验组条件相同,其中实验组添加了KCl,对照组不加KCl。
(4)γ-PGA的检测结果如表1、图1所示。
表1
组别 | 实验组 | 对照组 |
产量(g/L) | 18.51 | 16.36 |
分子量(Da) | 2.1*106 | 2.0*106 |
(5)发酵液粘度的检测如表2所示。
表2
组别 | 实验组 | 对照组 |
粘度(mPa/s) | 2368 | 4289 |
降低率 | 44.8% |
由表1和表2得出,本发明方法使得γ-PGA浓度增大的情况下,不仅不会提高发酵液粘度,反而会使粘度大大降低,同时还能得到高分子量的γ-PGA。
实施例2:
实施例2同实施例1的区别在于发酵培养基的成分中KCl变为10g/L。
对照组和实验组条件相同,其中实验组添加了KCl,对照组不加KCl。
(4)γ-PGA的检测结果如表3、图1所示。
表3
组别 | 实验组 | 对照组 |
产量(g/L) | 20.41 | 16.36 |
分子量(Da) | 3.0*106 | 2.0*106 |
5)发酵液粘度的检测如表4所示。
表4
组别 | 实验组 | 对照组 |
粘度(mPa/s) | 932 | 4289 |
降低率 | 78.3% |
由表3和表4得出,本发明方法使得γ-PGA浓度增大的情况下,不仅不会提高发酵液粘度,反而会使粘度大大降低,同时还能得到高分子量的γ-PGA。
实施例3:
实施例3同实施例1的区别在于发酵培养基的成分中KCl变为15g/L。
对照组和实验组条件相同,其中实验组添加了KCl,对照组不加KCl。
(4)γ-PGA的检测结果如表5、图1所示。
表5
组别 | 实验组 | 对照组 |
产量 | 17.55 | 16.36 |
分子量 | 4.0*106 | 2.0*106 |
(5)发酵液粘度的检测如表6所示。
表6
组别 | 实验组 | 对照组 |
粘度(mPa/s) | 640 | 4289 |
降低率 | 85.1% |
由表5和表6得出,本发明方法使得γ-PGA浓度增大的情况下,不仅不会提高发酵液粘度,反而会使粘度大大降低,同时还能得到高分子量的γ-PGA。
实施例4:
(1)菌种的活化
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上,45℃培养10h,于6℃作短期保藏;固体斜面培养基的组成为:葡萄糖10g/L,酵母膏4g/L,谷氨酸钠6g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,KH2PO40.4g/L,琼脂12g/L,pH值7.0,蒸馏水配制。
(2)种子液的制备
将斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速200rpm,45℃摇瓶培养17h;液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖30g/l,酵母膏8g/l,谷氨酸钠10g/l,MgSO4·7H2O0.3g/l,KH2PO41g/l,pH值7.0,蒸馏水配制。
(3)液体摇瓶发酵
种子液按体积比4%的接种量接入已灭菌的液体发酵培养基中,在45℃摇瓶培养25h,转速160r/min,。发酵培养基的成分:葡萄糖40g/L、谷氨酸钠30g/L、酵母膏3.0g/L、KH2PO40.8g/L、MgSO40.15g/L、KCl0.5g/L,pH7.0,其余为蒸馏水。
对照组和实验组条件相同,其中实验组添加了KCl,对照组不加KCl。
(4)γ-PGA的检测结果如表7所示。
表7
组别 | 实验组 | 对照组 |
产量 | 18.13 | 17.11 |
分子量 | 2.0*106 | 1.5*106 |
(5)发酵液粘度的检测如表8所示。
表8
组别 | 实验组 | 对照组 |
粘度(mPa/s) | 1005 | 4255 |
降低率 | 76.4% |
由表7和表8得出,本发明方法使得γ-PGA浓度增大的情况下,不仅不会提高发酵液粘度,反而会使粘度大大降低,同时还能得到高分子量的γ-PGA。
实施例5:
(1)菌种的活化
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上,50℃培养8h,于8℃作短期保藏;固体斜面培养基的组成为:葡萄糖12g/L,酵母膏6g/L,谷氨酸钠6g/L,MgSO4·7H2O0.2g/L,KH2PO40.5g/L,琼脂15g/L,pH值7.5,蒸馏水配制。
(2)种子液的制备
将斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速250rpm,50℃摇瓶培养18h;液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖50g/l,酵母膏10g/l,谷氨酸钠20g/l,MgSO4·7H2O0.5g/l,KH2PO42g/l,pH值7.5,蒸馏水配制。
(3)液体摇瓶发酵
种子液按体积比1-6%的接种量接入已灭菌的液体发酵培养基中,在50℃摇瓶培养30h,转速160r/min,。发酵培养基的成分:葡萄糖50g/L、谷氨酸钠40g/L、酵母膏4.0g/L、KH2PO41g/L、MgSO40.15g/L、KCl30g/L,pH7.5,其余为蒸馏水。
对照组和实验组条件相同,其中实验组添加了KCl,对照组不加KCl。
(4)γ-PGA的检测结果如表9所示。
表9
组别 | 实验组 | 对照组 |
产量 | 20.41 | 17.58 |
分子量 | 4.2*106 | 2.5*106 |
(5)发酵液粘度的检测如表10所示。
表10
组别 | 实验组 | 对照组 |
粘度(mPa/s) | 932 | 4380 |
降低率 | 78.7% |
由表9和表10得出,本发明方法使得γ-PGA浓度增大的情况下,不仅不会提高发酵液粘度,反而会使粘度大大降低,同时还能得到高分子量的γ-PGA。
Claims (6)
1.一种降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,包括菌种的活化、种子液制备及液体摇瓶发酵,其特征在于:在所述液体药瓶发酵中,向液体发酵培养基加入高浓度KCl ,所述高浓度KCl为0.5-30g/L;所述菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCC NO:M 2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心。
2.根据权利要求1所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,其特征在于:所述高浓度KCl为5-30g/L。
3.根据权利要求1或2所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,其特征在于:所述液体发酵培养基成分还包括葡萄糖30-50g/L、谷氨酸钠20-40 g/L、酵母膏2.5-4.0 g/L、KH2PO4 0.5-1 g/L、MgSO4 0.1-0.15 g/L,pH 6.5-7.5,蒸馏水配制。
4.根据权利要求3所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,其特征在于:所述液体摇瓶发酵的发酵条件为:种子液按体积比1-6%的接种量接入已灭菌的液体发酵培养基中,在40-50℃摇瓶培养20-30h。
5.根据权利要求3所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,其特征在于:所述菌种的活化,是将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上,40~50℃培养8-16h,于2~8℃作短期保藏;所述固体斜面培养基的组成为:葡萄糖8~12g/L,酵母膏3~6g/L,谷氨酸钠3~6g/L,MgSO4·7H2O 0.1~0.2g/L,KH2PO4 0.3~0.5g/L,琼脂10~15g/L,pH 值6.5 ~ 7.5,蒸馏水配制。
6.根据权利要求5所述的降低γ-聚谷氨酸发酵液粘度的方法,其特征在于:所述种子液制备,是将斜面上1.0cm2的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160 ~ 250rpm,42℃-50℃摇瓶培养16h-18h;所述液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10-30g/L、谷氨酸钠5-10 g/L、酵母膏5-8 g/L、KH2PO4 0.5-1 g/L、MgSO4 0.1-0.15 g/L、pH 6.5-7.5。
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