CN102994430A

CN102994430A - 一株细菌纤维素产生菌株及其应用

Info

Publication number: CN102994430A
Application number: CN2012105228392A
Authority: CN
Inventors: 朱宏阳; 李泳宁; 林伟铃; 黄芳玲; 冯珊; 林小兰
Original assignee: FUJIAN HEALTH COLLEGE
Current assignee: FUJIAN HEALTH COLLEGE
Priority date: 2012-12-08
Filing date: 2012-12-08
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2032-12-08
Also published as: CN102994430B

Abstract

本发明提供了一株细菌纤维素产生菌株，该菌株命名为解淀粉芽孢杆菌ZF-7(BacillusamyloliquefaciensZF-7)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.6266，该菌株是一株全新的细菌纤维素产生菌株。本发明还提供了一种利用上述菌株制备细菌纤维素的方法，利用该菌株动态摇瓶发酵4-10天，可产生细菌纤维素2.5～10.0g/L；静置发酵4-10天，可产生细菌纤维素1.8～6.4g/L；本发明提供的细菌纤维素产生菌株具有高产、稳定等特性。

Description

一株细菌纤维素产生菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株细菌纤维素产生菌株及其应用。

背景技术

细菌纤维素(Bacterial Cellulose, 简称BC)是一种天然高分子材料，其具有良好的生物相容性、生物可降解性、较强的持水能力和较高的力学性能等优良特性。与植物纤维相比，细菌纤维素具有高结晶度，高持水性，高杨氏模量，高纯度，优秀生物相容性等特点，因此细菌纤维素在医用敷料等生物医学材料、食品、造纸、纺织等领域有着广阔的应用。但是细菌纤维素的髙生产成本限制了它的工业规模，因此降低细菌纤维成本是当前工业生产的一个亟待解决的问题。细菌纤维素成本高的一个主要原因是培养基中碳源的成本高。

采用微生物发酵方法合成细菌纤维素，目前的细菌纤维素产生菌种类较少，细菌纤维素微生物合成方法有动态发酵或静态发酵法，而多数菌种只能采用动态发酵或静态发酵中的一种进行细菌纤维素的合成。动态发酵法耗能相对较高、工艺也较复杂，但比较适合大规模生产，且细菌纤维素产量可能较高；静态发酵法耗能低、工艺简单，但产量可能不高，较适合小规模生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株细菌纤维素产生菌株及其应用，该细菌纤维素产生菌株可采用动态发酵法或静态发酵法生产细菌纤维素，且两种方法的细菌纤维素得率均较高。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) ZF-7，该菌株于2012年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册编号为：CGMCC No. 6266。该菌株以下简称：解淀粉芽孢杆菌 ZF-7。

解淀粉芽孢杆菌ZF-7菌株具有下述性质：

(1) 菌落形态学特征：

在BPY培养基(葡萄糖5g，蛋白胨1g，牛肉膏5g，酵母粉5g，氯化钠5g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，调pH值至7.0~7.2)上生长48小时，形成的菌落细小，菌落直径不超过3mm，呈圆形，凸起，边缘整齐，呈乳白色或微黄色，能形成皮革状菌膜，显微镜16×100倍观察菌体形态为单细胞、短杆状，染色均匀，可形成内生芽孢

(2) 生理与生化特性：

a. 培养温度：25~35℃，最适温度为30℃；

b. 在pH2~8范围内生长；

c. 色素产生：产黄色素；

d. 耐NaCl浓度：在5%浓度可以生长。

(3) 营养特征：

解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株的培养基中不需要添加生长因子。有机氮源或无机氮源都可以作为氮源使用。

(4) 16S rDNA序列分析

ZF-7菌株的遗传学特征：采用16S rRNA测序进行分类学分子鉴定。提取ZF-7菌株基因组。采用两种合成的通用引物PCR扩增16S rDNA单一条带，引物如下：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定，通过测序分析得到该菌株的16S rDNA序列，全长为1460bp（其序列如SEQ ID No.1所示）。将所测序列送GenBank数据库中得相关种进行比较，构建以16S rDNA全序列为基础的***发育树。结果表明：ZF-7菌株与Bacillus amyloliquefaciens subsp. (GenBank登录号为：JF899275)菌株同源性最高，同源性达99.5％。结合形态、生理生化特征试验及16S rDNA全序列分析的***发育研究结果，可以将ZF-7菌株的分类定位为解淀粉芽孢杆菌，具体为B. amyloliquefaciens ZF-7。

本发明利用解淀粉芽孢杆菌ZF-7菌株生产细菌纤维素的方法是将该菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行三角瓶振荡发酵（动态摇瓶发酵）或静置发酵产生细菌纤维素。

本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株生产细菌纤维素的方法，其特点是用解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株做发酵菌株，利用葡萄糖或其他碳源作为主要发酵原料进行发酵，动态摇瓶发酵4-10天，可产生细菌纤维素2.5~10.0g/L；静置发酵4-10天，可产生细菌纤维素1.8~6.4g/L。

利用解淀粉芽孢杆菌ZF-7菌株发酵生产细菌纤维素的具体工艺过程如下：

将解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株斜面活化一天后(斜面成分除含有碳源、氮源、无机盐等之外，还含有2%的琼脂)，接种于含碳源、氮源、无机盐和水的发酵培养基中（或先接种于无菌种子培养基上，再接种于发酵培养基中）。各培养基中各组分的含量均为重量体积比，即g/L培养基。斜面培养基碳源用量为10~50g/L，氮源用量为5~25 g/L，无机盐用量为0.1~30 g/L，其余为水。种子培养基碳源用量为10~50 g/L，氮源用量为5~25 g/L，无机盐用量为0.1~10 g/L，其余为水。发酵培养基碳源用量为10~200 g/L，氮源用量为5~80 g/L，无机盐用量为0.1~20 g/L，其余为水。斜面培养基、种子培养基、发酵培养基中的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、无水乙醇和淀粉水解液中的一种或几种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl中的一种或几种；无机盐为钠盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或几种。斜面培养基、种子培养基和发酵培养基的初始pH值范围为4.0~8.0，培养温度为25~35℃。

接种于种子培养基上的振荡(转速为50~150r/min)或静置培养时间为1~2d。

接种于发酵培养基上的动态摇瓶发酵时的摇床转速为10~150 r/min，发酵4-10d（发酵期间可根据碳源的消耗情况间歇补充浓度为10~50%的无菌碳源）可产生细菌纤维素2.5~10.0g/L；静置发酵4-10d（发酵期间可根据碳源的消耗情况间歇补充浓度为10~50%无菌碳源），可产生细菌纤维素1.8~6.4g/L。

发酵完毕的发酵液经提取工艺既得细菌纤维素产物。由于细菌纤维素在发酵完毕的发酵液中呈凝胶状固形物，因此提取细菌纤维素产物只需按以下步骤即可：发酵完毕的发酵液进行固液分离，固体为细菌纤维素凝胶，液体为发酵废液，取出细菌纤维素凝胶，蒸馏水多次冲洗，除去残存的菌体和培养基。将细菌纤维素凝胶用0.1~1 mol/L NaOH溶液浸泡，60~100℃保温30~90min，然后用去离子水反复冲洗。此时凝胶呈乳白色半透明状，再将细菌纤维素凝胶于60~80℃干燥至恒重，即得到细菌纤维素。

本发明的显著效果：本发明提供了一株能高产细菌纤维素的菌株——解淀粉芽孢杆菌ZF-7菌株，采用本发明的制备细菌纤维素的方法，细菌纤维素最高产率可达10.0g/L，由于该菌株具有良好的性能及生产效率，利于工业化大规模生产，具备显著的经济效益和社会效益。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

斜面培养基：葡萄糖 50g/L，酵母膏 15g/L，Na₂HPO₄ 10g/L，玉米浆10g/L，pH6.5，琼脂20g/L。

发酵培养基：葡萄糖 50g/L，酵母膏 5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 10g/L，NaH₂PO₄ 5g/L，玉米浆10g/L，无水乙醇 1.0%，pH6.5。

把解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株在斜面培养基上30℃培养24h，得到活化培养物，于4℃冰箱保藏备用。挑取一环上述斜面菌种，接种于装有50ml摇瓶发酵培养基的250ml三角瓶中，于30℃静置培养4d，停止发酵，将发酵液进行固液分离，取出细菌纤维素凝胶，称重得258g/L。用蒸馏水将细菌纤维素凝胶冲洗2次，将细菌纤维素凝胶浸入0.1 mol/L的NaOH溶液中，60℃保温90min，然后用去离子水冲洗2次后，再将细菌纤维素凝胶于80℃干燥至恒重，用天平称重，得出细菌纤维素凝胶的产量为2.5g/L。

实施例2：

斜面培养基：葡萄糖 50g/L，酵母膏 5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 4g/L，玉米浆10g/L，pH8.0，琼脂20g/L。

发酵培养基：麦芽糖 200g/L，牛肉膏 25g/L，蛋白胨30g/L，NaH₂PO₄ 10g/L，无水乙醇 2.0%，pH8.0。

将解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株在斜面培养基中30℃培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌于接种于装有50ml摇瓶发酵培养基的500ml三角瓶中，28℃培养，摇瓶转速为100r/min，发酵过程中取样检测糖浓度，当糖浓度低于5g/L时，补充浓度为30%的新鲜葡萄糖无菌溶液，每次补10ml，共补加5次，发酵培养7d，停止发酵，将发酵完毕的发酵液进行固液分离，取出细菌纤维素凝胶，称重得518g/L。用蒸馏水将细菌纤维素凝胶冲洗3次，将细菌纤维素凝胶浸入1 mol/L的NaOH溶液中，100℃保温30min，然后用去离子水冲洗3次后，再将细菌纤维素凝胶于80℃干燥至恒重，用天平称重，得出细菌纤维素凝胶的产量为5.3 g/L。

实施例3：

斜面培养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨 15g/L，Na₂HPO₄ 10g/L，玉米浆10g/L，pH4.0，琼脂20g/L。

发酵培养基：蜜糖 10g/L，豆粕粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 10g/L，NaH₂PO₄ 5g/L，玉米浆10g/L，无水乙醇 1.5%，pH4.0。

把解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株在斜面培养基上30℃培养24h，得到活化培养物，于4℃冰箱保藏备用。挑取一环上述斜面菌种，接种于装有50ml摇瓶发酵培养基的250ml三角瓶中，于25℃静置培养10d，停止发酵，将发酵液进行固液分离，取出细菌纤维素凝胶，称重得561g/L。用蒸馏水将细菌纤维素凝胶冲洗4次，将细菌纤维素凝胶浸入0.1 mol/L的NaOH溶液中，80℃保温40min，然后用去离子水冲洗5次后，再将细菌纤维素凝胶于70℃干燥至恒重，用天平称重，得出细菌纤维素凝胶的产量为5.9g/L。

实施例4：

斜面培养基：葡萄糖 40g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄ 5g/L，碳酸钙20g/L，pH6.5，琼脂20g/L。

种子培养基：葡萄糖20 g/L，果糖 20g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 0.5 g/L，玉米浆10g/L，无水乙醇 1.5%，pH6.5。

摇瓶发酵培养基：果糖 50g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 20g/L，玉米浆10g/L，无水乙醇 1.5%，pH4.0。

把解淀粉芽孢杆菌 ZF-7菌株在斜面培养基上30℃培养24h，得到活化培养物，于4℃冰箱保藏备用。挑取一环上述斜面菌种，接种于装有40ml种子培养基的250ml三角瓶中，于35℃ 50 r/min振荡培养2d。取上述培养好的种子液，按5%接种量接种到装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃静置培养3d，停止发酵，将发酵液进行固液分离，取出细菌纤维素凝胶，称重得363g/L。用蒸馏水将细菌纤维素凝胶冲洗2次，将细菌纤维素凝胶浸入1 mol/L的NaOH溶液中，60℃保温90min，然后用去离子水冲洗2次后，再将细菌纤维素凝胶于60℃干燥至恒重，用天平称重，得出细菌纤维素凝胶的产量为3.7g/L。

实施例5：

种子培养基：蔗糖20 g/L，果糖 20g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 0.5 g/L，玉米浆10g/L，无水乙醇 2.0%，pH8.0。

摇瓶发酵培养基：果糖 50g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨12g/L，Na₂HPO₄ 0.5 g/L，无水乙醇 1.5%，pH8.0。

将解淀粉芽孢杆菌ZF-7菌株在斜面培养基上30℃培养24h，后用接种环挑取一环上述斜面菌种，接种于装有40ml种子培养基的250ml三角瓶中，于30℃ 150r/m振荡培养1.5d。取上述培养好的种子液，按7%接种量接种到装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于30℃ 50 r/min振荡培养，发酵过程中取样检测还原糖浓度，当糖浓度低于5g/L时，补充浓度为30%的新鲜葡萄糖无菌溶液，每次补10ml，共补加5次，发酵培养10d，停止发酵，将发酵液进行固液分离，取出细菌纤维素凝胶，称重得657g/L。用蒸馏水将细菌纤维素凝胶冲洗3次，将细菌纤维素凝胶浸入0.1 mol/L的NaOH溶液中，80℃保温60min，然后用去离子水冲洗2次后，再将细菌纤维素凝胶于70℃干燥至恒重，用天平称重，得出细菌纤维素凝胶的产量为8.4g/L。

实施例6：

种子培养基：糖蜜25 g/L，果糖 25g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨10g/L，Na₂HPO₄ 0.5 g/L，玉米浆10g/L，无水乙醇 2.0%，pH7.0。

摇瓶发酵培养基：果糖 50g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨12g/L，Na₂HPO₄ 20g/L，玉米浆15g/L，无水乙醇 1.5%，pH7.0。

将解淀粉芽孢杆菌ZF-7菌株在斜面培养基上30℃培养24h，后用接种环挑取一环上述斜面菌种，接种于装有40ml种子培养基的250ml三角瓶中，于25℃静置培养2d。取上述培养好的种子液，按6%接种量接种到装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，于25℃ 150r/m振荡培养，发酵过程中取样检测还原糖浓度，当糖浓度低于5g/L时，补充浓度为30%的新鲜葡萄糖无菌溶液，每次补10ml，共补加5次，发酵培养4d，停止发酵，将发酵液进行固液分离，取出细菌纤维素凝胶，称重得698g/L。用蒸馏水将细菌纤维素凝胶冲洗2次，将细菌纤维素凝胶浸入0.5 mol/L的NaOH溶液中，100℃保温30min，然后用去离子水冲洗4次后，再将细菌纤维素凝胶于80℃干燥至恒重，用天平称重，得出细菌纤维素凝胶的产量为10.0g/L。

<110> 福建卫生职业技术学院

<120>一株细菌纤维素产生菌株及其应用

<160>3

<210> 1

<211>1460

<212> DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

gaaatggcgg cgtgtcctat acatgcaagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga 60

tgttagcggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc 120

cgggaaaccg gggctaatac cggatggttg tctgaaccgc atggttcaga cataaaaggt 180

ggcttcggct accacttaca gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag 300

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc 360

tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg 420

gaagaacaag tgccgttcaa atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg 480

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt 540

gggcgtaaag ggctcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg 600

gggagggtca ttggaaactg gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct 720

gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta 840

acgcattaag cactccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960

caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020

caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140

gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200

cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260

caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320

agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380

tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aacctttatg gagccagccg 1440

ccgatggtga atccagaaag 1460

<210> 2

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag

<210> 3

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt

Claims

1.一株细菌纤维素产生菌株，其特征在于：所述细菌纤维素产生菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌ZF-7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCC No. 6266。

2.如权力要求1所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌ZF-7应用于生产细菌纤维素。

3.根据权力要求2所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌ZF-7用于生产细菌纤维素的方法如下：将解淀粉芽孢杆菌ZF-7接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中进行振荡发酵或静置发酵，即产生出细菌纤维素。

4.根据权力要求2所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌ZF-7用于生产细菌纤维素的方法如下：将解淀粉芽孢杆菌ZF-7先接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌种子培养基中振荡培养或静置培养，再接种于发酵培养基中进行振荡发酵或静置发酵，即产生出细菌纤维素。

5.根据权利要求3所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养基中，各组分用量为：碳源用量为10～200 g/L，氮源用量为5～80 g/L，无机盐用量为0.1～20 g/L，其余为水。

6.根据权利要求4所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述种子培养基中，各组分用量为：碳源用量为10～50 g/L，氮源用量为5～25 g/L，无机盐用量为0.1～10 g/L，其余为水。

7.根据权利要求5或6所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、无水乙醇和淀粉水解液中的一种或几种；所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、棉籽饼粉、尿素、(NH₄)₂SO₄和NH₄Cl中的一种或几种；所述无机盐为钠盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或几种。

8.根据权利要求2或3所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌ZF-7用于生产细菌纤维素的条件如下：发酵培养基的初始pH值范围为4.0～8.0，发酵温度25～35℃，振荡发酵时摇床转速为50～150 r/min，发酵4～10d；静置发酵时，发酵4～10d。

9.根据权利要求2或4所述的一株细菌纤维素产生菌株的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌ZF-7用于生产细菌纤维素的条件如下：种子培养基的初始pH值范围为4.0～8.0，培养温度25～35℃，振荡培养时摇床转速为50～150r/min，培养时间为1～2d；静置培养时，培养1～2d。