CN106701644A - 一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ‑聚谷氨酸中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ‑聚谷氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ‑聚谷氨酸中的应用。本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2，其保藏编号为CGMCC NO.12426。本发明还保护枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2在生产γ‑聚谷氨酸中的应用。本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2生产γ‑PGA，以工业葡萄糖为底物，以0.96‑1.20克/升/小时的转化率高效发酵生产γ‑PGA，γ‑PGA浓度最高可达46.0克/升，其中γ‑D‑PGA所占比例为84％‑86％，生产能力高，培养基成分简单，同时也可以控制γ‑PGA的生产成本。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体之间通过α-氨基和β-羧基形成肽键之后生成的同聚酰胺(γ-L-PGA，γ-D-PGA，γ-DL-PGA)，通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，分子质量一般在100～1000kD。γ-PGA是一种水溶性和可生物降解的生物高分子物质，对人体和环境无毒害作用，在食品、化妆品、医药和水处理等领域具有非常广泛的用途。
γ-PGA的生产方法主要有化学合成法、提取法和发酵法等。化学法合成路线长，副产物多，而且化学合成的γ-PGA在土壤中分解速度慢，因此被列为环境污染的原因之一。早期日本生产γ-PGA多采用提取法，用乙醇将纳豆中的γ-PGA分离提取出来。提取法获得的γ-PGA浓度较低，且有波动，工艺复杂，生产成本高，因此也不能被广泛接受。目前主要采用微生物发酵法生产γ-PGA。微生物发酵法生产γ-PGA具有生产过程容易控制，发酵产量稳定，提取率高，目标产物产量较高，以及产物分子量适宜，环境友好等优点，是大规模生产γ-PGA的主要方法，正成为国内外γ-PGA行业的研究热点。
生产成本是制约γ-PGA应用的关键因素之一。现有生产工艺中的氮源和各种生物素大大提高了γ-PGA的生产成本。降低成本的两条途径，一为降低培养基成本，二为提高菌株的生产能力。目前虽然菌种的生产能力有很大的提高，但其生产成本高、周期长、生产效率地，均是工业化规模生产γ-PGA的障碍。因此，寻找高效、低成本的γ-PGA生产菌株及其工艺条件仍是今后研究的方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌及其在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2，已于2016年05月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.12426。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2简称为枯草芽孢杆菌KH2。
本发明保护枯草芽孢杆菌KH2在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
本发明还保护一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：培养枯草芽孢杆菌KH2。
本发明还保护一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2。
所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在7L发酵罐中进行。所述培养的培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为700rpm)，整个过程通气量为1L/min。
所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在5L发酵罐中进行。所述培养的培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为300rpm)，整个过程通气量为1L/min，旋转半径为33mm。
所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在三角瓶中进行。所述培养的培养条件为：32.5-37℃，220rpm培养48小时。
所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在三角瓶中进行。所述培养的培养条件为：32.5℃，220rpm培养48小时。
所述“采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2”具体可在三角瓶中进行。所述培养的培养条件为：37℃，220rpm培养48小时。
本发明还保护一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子培养基培养枯草芽孢杆菌KH2，得到种子液；
步骤(b)：将步骤(a)的种子液接种至发酵培养基进行培养。
本发明还保护一种培养枯草芽孢杆菌KH2的方法，包括如下步骤：采用发酵培养基培养枯草芽孢杆菌KH2。
本发明还保护一种枯草芽孢杆菌KH2的方法，依次包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子培养基培养枯草芽孢杆菌KH2，得到种子液；
步骤(b)：将步骤(a)的种子液接种至发酵培养基进行培养。
以上任一所述步骤(b)可在7L发酵罐中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为700rpm)，整个过程通气量为1L/min。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝10-14。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶5。
以上任一所述步骤(b)可在5L发酵罐中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：37℃培养48小时(第0-24小时转速为500rpm，第25-48小时转速为300rpm)，整个过程通气量为1L/min，旋转半径为33mm。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝10-14。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶5。
以上任一所述步骤(b)可在三角瓶中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：32.5-37℃，220rpm培养48小时。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝7-12。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶100。
以上任一所述步骤(b)可在三角瓶中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：37℃，220rpm培养48小时。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝7-12。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶100。
以上任一所述步骤(b)可在三角瓶中进行。所述步骤(b)中，培养条件为：32.5℃，220rpm培养48小时。所述步骤(b)中，所述种子液OD600nm＝7-12。所述种子液和所述发酵培养基的体积比具体可为1∶100。
以上任一所述步骤(a)中，所述培养条件具体可为：37℃，220rpm培养。
以上任一所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下：葡萄糖10-40g/L，酵母粉2-7g/L，谷氨酸钠5-15g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L；所述溶剂为水。
所述种子培养基的pH为6.5-7.0。所述种子培养基的pH具体为7.0。
所述所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度具体可为：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，谷氨酸钠10g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.25g/L。
以上任一所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：碳源20-80g/L，谷氨酸钠20-50g/L，酵母提取物2-15g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，磷酸氢二钾1-3g/L；所述溶剂为水。
所述碳源为工业葡萄糖或甘油。
所述发酵培养基的pH为6.5-7.5。
所述发酵培养基的pH为7.0。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖60g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖60g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母提取物2g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：甘油40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖20g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖60g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖80g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠50g/L，酵母提取物5g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物7g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物10g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
以上任一所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体为：工业葡萄糖40g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母提取物15g/L，硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L。
本发明还保护一种用于培养枯草芽孢杆菌KH2的试剂盒，包括以上任一所述发酵培养基。
本发明还保护一种用于生产γ-聚谷氨酸的试剂盒，包括以上任一所述发酵培养基。
以上任一所述试剂盒还包括以上任一所述种子培养基。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2。本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2生产γ-PGA，以工业葡萄糖为底物，以0.96-1.20克/升/小时的转化率高效发酵生产γ-PGA，γ-PGA浓度最高可达46.0克/升，其中γ-D-PGA所占比例为84％-86％。本发明利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2生产γ-PGA，生产能力高，培养基成分简单，同时也可以控制γ-PGA的生产成本。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2生产γ-PGA构型液相检测图。图1A为标准品高效液相色谱图。图1B为枯草芽孢杆菌KH2发酵液水解后的高效液相色谱图。
图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2生产γ-PGA发酵曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
γ-PGA标准品：喀斯玛商城，货号：94791。
L-谷氨酸标准品：喀斯玛商城，货号：LGC.MM133300。
D-谷氨酸标准品：喀斯玛商城，货号：D810325。
工业葡萄糖：淄博虹宇工业糖有限公司。
甘油：山东玉玲化工有限公司。
斜面培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在斜面培养基中的浓度如下：蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠10克/升，琼脂粉15克/升；所述溶剂为水。斜面培养基的pH为7.0。121℃灭菌15分钟。
种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在种子培养基中的浓度如下：葡萄糖20克/升，酵母粉5克/升，谷氨酸钠10克/升，磷酸氢二钾2克/升，硫酸镁0.25克/升；所述溶剂为水。所述种子培养基的pH为7.0。115℃条件下灭菌20分钟。
以下实施例中葡萄糖含量和谷氨酸含量采用生物传感分析仪SBA-40C(山东省科学院生物研究所)测定。
以下实施例中样品溶液中的γ-PGA含量的检测方法为：取2mL样品溶液，加入2mLCTAB溶液，充分震荡并尽量避免反应液产生泡沫，然后静置3分钟，250nm下检测吸光度值。配制不同浓度γ-PGA标准品溶液，采用相同方法进行检测，根据标准曲线计算样品中γ-PGA的含量。
以下实施例中样品溶液中γ-L-PGA和γ-D-PGA纯度的测定方法为：
(1)取样品溶液，去离子水透析24小时(每4小时换一次水)。
(2)将步骤(1)透析后的溶液冷冻干燥，然后将冷冻干燥得到粉末用6M HCl溶液溶解，105℃水解10小时，然后加入6M NaOH溶液中和，得到水解物。
(3)将步骤(2)得到的水解物用HPLC检测L-谷氨酸和D-谷氨酸的含量。HPLC检测条件为：手性柱，流动相为2mmol/L CuSO4水溶液，流速0.5mL/min，柱温25℃，进样5μL，紫外检测器检测，检测波长254nm。
L-谷氨酸标准品的保留时间为23.05min，在相同条件下出峰位置为±1min以内，可以认定为同一物质。
D-谷氨酸标准品的保留时间为15.31min，在相同条件下出峰位置为±1min以内，可以认定为同一物质。
γ-L-PGA占比按以下公式计算：L-谷氨酸÷(L-谷氨酸+D-谷氨酸)×100％。
γ-D-PGA占比按以下公式计算：D-谷氨酸÷(L-谷氨酸+D-谷氨酸)×100％。
实施例1、菌种的分离、诱变筛选和鉴定
一、菌种的分离
从北京某豆制品生产厂附近筛选取得土样，称取5克土样于250ml三角瓶中，加入100ml生理盐水，充分混均后用无菌水稀释10000倍涂布于LB固体培养基上，37℃培养，待长出单菌落后，挑选形态大、黏度高的单菌落，接种于10m1种子培养基中，37℃，220转/分钟震荡培养48小时，测定发酵液中γ-PGA浓度，挑取一株γ-PGA产量最高的菌株，接种于LB培养基斜面上冷藏备用。
二、离子束诱变筛选
将步骤一得到的菌株接种于LB液体培养基中培养至对数中期(OD600nm＝0.5-0.6)，将培养体系离心后将菌体沉淀用生理盐水悬浮，制成菌悬液。吸取100μL菌悬液涂布于直径为3.5cm的无菌空白培养皿上(涂布直径约1.5cm)，无菌风吹干制成菌膜后进行离子注入，功率为120W，通气量为8slpm，通气时间分别为1分钟、2分钟、2.5分钟、3分钟、4分钟。离子注入后的平皿用1mL生理盐水洗脱。各不同注入剂量分别吸取100μL，稀释后涂布在LB固体培养基上，待长出单菌落后，挑选黏度较大的菌落，接种于10ml发酵培养基中，37℃，200转/分钟震荡培养48小时，测定发酵液中γ-PGA浓度。经过多次筛选，获得一株γ-PGA产量显著提高的菌株，将其命名为菌株KH2。
三、菌株KH2的鉴定
按照“伯杰细菌鉴定手册”(第九版)中描述的方法对菌株KH2进行形态特征观察和生理生化特性鉴定。
菌株KH2为革兰氏阳性菌，有芽孢，细胞直杆状，大小为(0.7-0.9)μm×(1.5-3.0)μm。菌株KH2可利用麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖。不能利用乳糖、木糖、***糖、***糖，柠檬酸盐试验阴性。
为准确鉴定菌株KH2，对其16S rDNA基因进行测序，将测得的序列与NCBI数据库中的多株枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列进行对比，证实菌株KH2为枯草芽孢杆菌，将其命名为枯草芽孢杆菌KH2。
枯草芽孢杆菌KH2生理生化特征比较结果见表1。表1中，+表示实验阳性或生长，-表示实验阴性或不生长。
表1枯草芽孢杆菌KH2生理生化特征
生理生化特征 枯草芽孢杆菌KH2
淀粉水解试验 +
明胶水解试验 +
石蕊牛奶 +
葡萄糖 +
果糖 +
木糖 -
蔗糖 +
乳糖 -
麦芽糖 +
***糖 -
过氧化氢酶 +
硝酸盐还原 +
柠檬酸盐 -
四、枯草芽孢杆菌KH2的保藏
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2，已于2016年05月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.12426。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2简称为枯草芽孢杆菌KH2。
五、枯草芽孢杆菌KH2的遗传稳定性
将枯草芽孢杆菌KH2进行传代培养以考察其遗传稳定性，每24小时传代一次，传代15代，每一代进行摇瓶发酵测定γ-PGA产量均无明显变化，具有良好的遗传稳定性。
实施例2、利用枯草芽孢杆菌KH2在三角瓶中发酵生产γ-PGA
一、实验一
1、将枯草芽孢杆菌KH2接种至斜面培养基中，37℃静置培养24小时。
2、完成步骤1后，在无菌条件下用接种环接2环，置于装有20m1种子培养基的100ml三角瓶中，37℃，220rpm培养12小时，得到种子培养液(OD600nm＝7-12)。
3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液接种至装有50ml发酵培养基(1)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。
发酵培养基(1)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(1)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(1)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
4、完成步骤3后，取发酵液，6000rpm离心5min，取上清液。向上清液中加入4倍上清液体积的冰乙醇，4℃静置过夜。然后8000rpm、4℃离心12min收集沉淀，将沉淀重新溶解在与发酵液等体积的去离子水中，得到样品溶液。检测样品溶液中的γ-PGA含量和γ-D-PGA所占比例。经过测定，γ-PGA含量为23.4克/升，γ-D-PGA所占的比例为84％-86％(图1)。
二、实验二
1、同实验一的步骤1。
2、同实验一的步骤2。
3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液接种至装有50ml发酵培养基(2)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。
发酵培养基(2)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(2)中的浓度如下：甘油40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(2)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量为15.1/升。
三、实验三
1、同实验一的步骤1。
2、同实验一的步骤2。
3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液接种至装有50ml发酵培养基(3)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。
发酵培养基(3)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(3)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升，柠檬酸13.5克/升，氯化铵6.8克/升，硫酸锰0.03克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(3)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量为8/升。
四、实验四
1、同实验一的步骤1。
2、同实验一的步骤2。
3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(4)-(7)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。
发酵培养基(4)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(4)中的浓度如下：工业葡萄糖20克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(4)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
发酵培养基(5)：将发酵培养基(4)中的工业葡萄糖浓度替换为40克/升，其余组分不变。
发酵培养基(6)：将发酵培养基(4)中的工业葡萄糖浓度替换为60克/升，其余组分不变。
发酵培养基(7)：将发酵培养基(4)中的工业葡萄糖浓度替换为80克/升，其余组分不变。
4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量如表2所示。
表2γ-PGA含量
五、实验五
1、同实验一的步骤1。
2、同实验一的步骤2。
3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(8)-(11)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。
发酵培养基(8)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(8)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠20克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(8)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
发酵培养基(9)：将发酵培养基(8)中的谷氨酸钠浓度替换为30克/升，其余组分不变。
发酵培养基(10)：将发酵培养基(8)中的谷氨酸钠浓度替换为40克/升，其余组分不变。
发酵培养基(11)：将发酵培养基(8)中的谷氨酸钠浓度替换为50克/升，其余组分不变。
4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量如表3所示。
表3γ-PGA含量
六、实验六
1、同实验一的步骤1。
2、同实验一的步骤2。
3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(12)-(15)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培养48小时。
发酵培养基(12)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(12)中的浓度如下：工业葡萄糖40克/升，谷氨酸钠40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(12)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
发酵培养基(13)：将发酵培养基(12)中的酵母提取物浓度替换为7克/升，其余组分不变。
发酵培养基(14)：将发酵培养基(12)中的酵母提取物浓度替换为10克/升，其余组分不变。
发酵培养基(15)：将发酵培养基(12)中的酵母提取物浓度替换为15克/升，其余组分不变。
4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量如表4所示。
表4γ-PGA含量
七、实验七
1、同实验一的步骤1。
2、同实验一的步骤2。
3、将0.5ml步骤2得到的种子培养液分别接种至装有50ml发酵培养基(16)的250ml三角瓶中，37℃，220rpm培养48小时。
发酵培养基(16)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(16)中的浓度如下：工业葡萄糖60克/升，谷氨酸钠30克/升，酵母提取物2克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(16)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
4、同实验一的步骤4。经过测定，γ-PGA含量为41.4克/升。
实施例3、利用枯草芽孢杆菌KH2在5L发酵罐中发酵生产γ-PGA
1、将枯草芽孢杆菌KH2接种至含有20ml种子培养基的100ml三角瓶中，37℃，220rpm震荡培养12小时，取4ml接种至装有400ml种子培养基的1L三角瓶中，37℃，220rpm培养12小时，得到种子液(OD600nm＝10-14)。
2、将400ml步骤1得到的种子培养液接种至装有2L发酵培养基(16)的5L发酵罐(上海保兴BIOTECH 5升发酵罐)中，37℃培养48小时，前24小时转速为500rpm，后24小时转速为300rpm，整个过程通气量为1L/min。旋转半径为33mm。
发酵培养基(16)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(16)中的浓度如下：工业葡萄糖60克/升，谷氨酸钠30克/升，酵母提取物2克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(16)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
3、完成步骤2后，取发酵液，6000rpm离心5min，取上清液。向上清液中加入4倍上清液体积的冰乙醇，4℃静置过夜。然后8000rpm、4℃离心12min收集沉淀，将沉淀重新溶解在与发酵液等体积的去离子水中，得到样品溶液。检测样品溶液中的γ-PGA含量。
结果显示，γ-PGA产量达到32.5克/升。生产速率为0.68g/L×h。
实施例4、利用枯草芽孢杆菌KH2在7L发酵罐中发酵生产γ-PGA
1、将枯草芽孢杆菌KH2接种至20m1种子培养基的100ml三角瓶中，37℃，220转/分震荡培养12小时，然后取6ml接种至装有600m1种子培养基的1L三角瓶中，37℃，220rpm培养12小时得到种子液(OD600nm＝10-14)。
2、将600ml步骤1得到的种子培养液接种至装有3L发酵培养基(17)的7L发酵罐(德国艾本德Eppendorf7升发酵罐)中，37℃培养48小时，前24小时转速为500rpm，后24小时转速为700rpm，整个过程通气量为1L/min。
发酵培养基(17)由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基(17)中的浓度如下：工业葡萄糖60克/升，谷氨酸钠30克/升，酵母提取物5克/升，硫酸镁0.25克/升，磷酸氢二钾2克/升；所述溶剂为水。发酵培养基(17)的pH为7.0。使用前115℃灭菌10分钟。
3、完成步骤2后，取发酵液，6000rpm离心5min，取上清液。检测上清液中的葡萄糖和谷氨酸含量。向上清液中加入4倍上清液体积的冰乙醇，4℃静置过夜。然后8000rpm、4℃离心12min收集沉淀，将沉淀重新溶解在与发酵液等体积的去离子水中，得到样品溶液。检测样品溶液中的γ-PGA含量。
结果如图2所示。结果显示，γ-PGA产量达到46.0克/升。生产速率为1.20g/L×h。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2，其保藏编号为CGMCC NO.12426。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2在生产γ-聚谷氨酸中的应用。
3.一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2。
4.一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤：采用发酵培养基培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2；
所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：碳源20-80g/L，谷氨酸钠20-50g/L，酵母提取物2-15g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，磷酸氢二钾1-3g/L；所述溶剂为水；
所述碳源为工业葡萄糖或甘油。
5.一种生产γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子培养基培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2，得到种子液；
步骤(b)：将步骤(a)的种子液接种至权利要求4中所述的发酵培养基进行培养；
所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述种子培养基中的浓度如下：葡萄糖10-40g/L，酵母粉2-7g/L，谷氨酸钠5—15g/L，磷酸氢二钾1-3g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L；所述溶剂为水。
6.一种培养权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2的方法，包括如下步骤：采用权利要求4中所述的发酵培养基培养所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2。
7.一种培养权利要求1所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KH2的方法，依次包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用权利要求5中所述的种子培养基培养枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2，得到种子液；
步骤(b)：将步骤(a)的种子液接种至权利要求4中所述的发酵培养基进行培养。
8.一种用于培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KH2的试剂盒，包括权利要求4中所述的发酵培养基。
9.一种用于生产γ-聚谷氨酸的试剂盒，包括权利要求4中所述的发酵培养基。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括权利要求5中所述的种子培养基。
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