CN101486977A - 枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents

枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法 Download PDF

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一种枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ－聚谷氨酸的方法，该菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus substilis) XN01，并于2008年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为：CCTCC NO：M 208044；用该菌株通过菌种培养保藏、制备种子液、摇瓶液体发酵以及提取γ－聚谷氨酸步骤制备γ－聚谷氨酸，该方法可在低成本的液体培养基中高效合成γ－聚谷氨酸，且方法简单，可操作性强。

Description

枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种芽胞杆菌及用该菌制备γ-聚谷氨酸的方法，具体涉及一种枯草芽胞杆菌及用该菌制备γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-Poly glutamic acid，γ-PGA)是由D-型或L-型谷氨酸单体以γ-羧基与α-氨基相缩合的一种聚氨基酸，它是具有生物可降性的高分子材料，其结构如下(Shih I，Van Y.Bioresour Technol，2001，79：207～225)：
Figure A200810150830D00041
γ-聚谷氨酸相对分子量一般在10万至100万，其主链上存在大量肽键和游离羧基，因此它具有良好的生物可降解性、水溶性和可食用性，可用作增稠剂、保湿剂、防冻剂、药物载体、可降解纤维、高效保水剂、絮凝剂、饲料添加剂等，在食品、化妆品、医药及水处理等领域具有广泛的应用前景(Shih I，VanY.Bioresour Technol，2001，79：207～225)。
γ-聚谷氨酸的制备方法主要有化学合成法和微生物合成法。化学合成法采用传统的多肽合成法，将谷氨酸逐个连接或采用片段组合连接成肽，这个过程一般包括基团保护、活化、偶联和脱保护等步骤，此法合成路线长、副产物多、收率低。早在1937年由Ivánovics等首先在Bacillus anthracis的荚膜中发现了γ-聚谷氨酸(Ivánovics G，Bruckner V.Z 
Figure A200810150830D0005155222QIETU
，1937，90：304～318)，1942年Bovarnick等研究发现有些芽胞杆菌属细菌能在发酵培养基中累积γ-聚谷氨酸(Bovarnick M.J Biol Chem，1942，145：415～424)。
由于微生物发酵生产聚谷氨酸具有生产过程易控制、发酵产量稳定、提取率高以及便于大规模生产等优点，因此微生物合成法已逐步成为研究和生产γ-聚谷氨酸的主要方法。至今发现的γ-聚谷氨酸产生菌主要集中在芽胞杆菌属的不同菌株之间，包括枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)和短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)。20世纪90年代以来，有关微生物合成γ-聚谷氨酸的研究一直十分活跃。
地衣芽胞杆菌(Bacillus lichemiformis)ATCC 9945是研究较多的菌种之一，该菌在谷氨酸20g/L、甘油80g/L、柠檬酸12g/L的最适培养基中通过4天的培养，可以获得17～23g/L的γ-聚谷氨酸(Cromwick A M，Gross R A.Biotechnol Bioeng，1996，50：222～227)。日本对枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)IFO 3335合成γ-聚谷氨酸开展了大量研究，该菌株在谷氮酸30g/L、柠檬酸20g/L的培养基中通过2天的培养能合成10-20g/L的γ-聚谷氨酸(Kunioka M，Goto A.Appl Microbiol Biotechnol，1994，40：867～872)。
1993年Kubota et al等报道，以枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)F-2-01为菌株，在含有70g/L谷氨酸的液体培养中通过4天的发酵获得了48g/L的γ-聚谷氨酸，这是国外报道的最高产量(Kubota H，et al.Biosci Biotech Biochem，1993，57(7)：1212～1213)。在我国也有部分单位相继开展了γ-聚谷氨酸微生物合成方面的研究工作，其中所涉及的菌种的生产能力不尽相同。CN200410010509.0介绍了浙江大学从酱油生产废料中分离选育得到了一株高产γ-聚谷氨酸的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis zju-7，其在含有150g/L谷氨酸、80g/L蛋白胨的培养基中培养24小时能合成54g/L的γ-聚谷氨酸。
目前，虽然菌种的生产能力有很大的提高，但其成本高、周期长及生产效率低均是工业化规模生产γ-聚谷氨酸的障碍。因此寻找高效、低成本合成γ-聚谷氨酸的生产菌株及工艺条件仍是今后研究的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枯草芽胞杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法，其可在低成本的液体培养基中高效合成γ-聚谷氨酸，且方法简单，可操作性强。
本发明的技术解决方案是：
一种产γ-聚谷氨酸的菌株，其特征在于所述菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus substilis)XN01，所述枯草芽胞杆菌是从豆制食品中分离所得，所述枯草芽胞杆菌于2008年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为：CCTCC NO：M 208044。
为准确鉴定该菌株，对其16s rRNA基因进行测序。其中扩增引物分别为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1527R(5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)。将测得的序列与GenBank所提供的基因序列比对，证实该微生物为枯草芽胞杆菌(Bacillus substilis)。
上述枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01的生理生化特性如下表所示。
其中所述列表中的“+”为阳性，“-”为阴性。
一种用枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01制备γ-聚谷氨酸的方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤：
1)菌种培养保藏
将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01的菌种在固体斜面培养基于25～40℃恒温培养，然后于2～4℃短期保藏；所述固体斜面培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中蛋白胨0.8～1.0％、酵母膏0.5～1.0％、NaCl 1.0～2.0％以及琼脂1.5～2.0％，其pH值为6.0～8.0；
2)制备种子液
将上述斜面上约1cm2的菌株接入装有液体培养基的250ml的三角瓶中，装液量50ml/250ml摇瓶，于25～40℃下恒温培养10～24小时，转速为180～220rpm；所述液体培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中葡萄糖0.1～1.0％，蛋白胨0.8～1.0％，酵母膏0.5～1.0％，NaCl 1.0～2.0％，pH值为6.5～8.0；
3)摇瓶液体发酵
将种子液转入灭菌后的液体发酵培养中，接种量为1～10％，装液量50ml/250ml摇瓶，于30～40℃恒温培养12～48小时，转速180～220rpm；所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中糖质碳源1～10％，氮源0.4～3％，L-谷氨酸或谷氨酸钠5～12％，NaCl 0～5％，MgSO4·7H2O 0.01～0.1％，MnSO4·H2O 0.005～0.05％，K2HPO4 0.05～0.5％，CaCl2 0.02～0.2％，pH值为6.5～8.0；
4)提取γ-聚谷氨酸
离心除去发酵液中的菌体，在上清液中加入3～4倍体积的无水乙醇，冷藏24小时后离心并收集沉淀，透析除去小分子后，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸。
上述步骤3)中糖质碳源为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖为宜。
上述步骤3)氮源的含量为0.8～1.5％为宜。
上述步骤3)L-谷氨酸或谷氨酸钠的含量8～12％为宜。
上述步骤3)发酵液pH值为7.0～7.5为宜。
上述步骤3)中的糖质碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖或为其混合物。
上述步骤3)中的氮源为酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏、玉米浆、(NH4)2SO4、硝酸盐或为其混合物。
其中碳源以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为宜，从成本角度考虑葡萄糖更佳；氮源以蛋白胨或胨白胨与其它氮源组成的混合氮源为宜，若以蛋白胨为氮源时，优选含量为0.8～1.5％；从成本及产率角度考虑，谷氨酸钠优于L-谷氨酸，优选含量为8～12％；发酵液pH值以7.0～7.5为宜，超出此范围会影响γ-聚谷氨酸的产率和产量。
本发明具有以下优点：
1)本发明使用的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01微生物菌株可以在液态发酵培养基中高效合成γ-聚谷氨酸，其生产速率约2.0g/L·h，其较高的产量和生产速率满足工业化生产的要求。
2)本发明使用的菌株对碳源和氮源的要求粗放，碳源可以是单一碳源或混合碳源，氮源可以是单一氮源或混合氮源。
3)在发酵液中适量添加NaCl能提高γ-聚谷氨酸产量，同时降低发酵液粘度，在提高发酵液溶氧水平的同时能减少生产过程中搅拌和离心时的动力消耗。
4)液体发酵合成γ-聚谷氨酸过程中，所用碳源、氮源及谷氨酸(或谷氨酸钠)浓度低，特别是氮源浓度较低，从而大大节约了生产成本。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的说明，但对本发明没有限制。
以下实施例中％单位均表示重量体积百分比，单位是g/100ml。
实施例1
将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01的菌种在固体斜面培养基于37℃恒温培养24小时，然后于2～4℃保藏。其中所述的斜面培养基组成为：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，琼脂2.0％，pH值为6.0。
取斜面保存的约1cm2的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01接入种子培养基，经37℃摇瓶培养20小时，转速210rpm。其中所述的种子培养基组成为：葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，pH 7.1～7.2，装液量50ml/250ml摇瓶。
按5％的接种量将种子培养基接入发酵培养基中，经37℃摇瓶培养24小时，转速210rpm。其中所述的发酵培养基组成为：蔗糖3％，L-谷氨酸5％，酵母膏1.0％，MgSO4·7H2O 0.05％，(NH4)2SO4 1.0％，MnSO4·H2O 0.01％，K2HPO4 0.1％，pH7.5，装液量50ml/250ml摇瓶。
发酵结束后，离心除去菌体，向上清液中加入3倍体积的冷乙醇，冷藏过夜后离心并倾去上清液，将沉淀重新溶解在等体积的去离子水中，水解后经纸层析法检测，γ-聚谷氨酸含量为24.5g/L。
其中所述的纸层析法所用溶剂***为正丁醇:80％甲酸(V/V):水＝15:3:2，显色剂为0.5％茚三酮丙酮溶液，经0.1％硫酸铜(CuSO4·5H2O):75％乙醇(V/V)＝2:38的溶液洗脱后于520nm测定吸光度，通过谷氨酸标准曲线计算γ-聚谷氨酸的含量。
实施例2
同实例1，将其中的碳源改变为相同质量浓度的麦芽糖，分析结果表明发酵液中γ-聚谷氨酸的含量为30.1g/L。
实施例3
将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01在同实例1的种子培养基中活化15小时，然后按5％的接种量按入摇瓶发酵培养基中，经37℃摇瓶培养24小时，转速210rpm。其中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖3％，L-谷氨酸5％，蛋白胨0.8％，NaCl 1％，MgSO4·7H2O 0.05％，MnSO4·H2O 0.01％，K2HPO4 0.1％，pH值为7.4～7.5，装液量50ml/250ml摇瓶。
发酵结束后，按照实施例1的纸层析法检测发酵液中γ-聚谷氨酸的含量，结果表明其含量为48.0g/L。
实施例4
将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01在同实例1的种子培养基中活化15小时，然后按5％的接种量按入摇瓶发酵培养基中，经37℃摇瓶培养24小时，转速210rpm。其中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖3％，L-谷氨酸5％，氮源0.8％，MgSO4·7H2O 0.05％，MnSO4·H2O 0.01％，K2HPO4 0.1％，pH值为7.4～7.5，装液量50ml/250ml摇瓶。
其中所述的氮源为酵母膏、蛋白胨、(NH4)2SO4、牛肉浸膏、酵母膏+(NH4)2SO4(等质量混合氮源)或蛋白胨+(NH4)2SO4(等质量混合氮源)，按上述发酵培养基经摇瓶发酵后，所得发酵液采用实例1所述的纸层析法检测γ-聚谷氨酸的含量如下表所示。
Figure A200810150830D00111
实施例5
将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01的菌种在固体斜面培养基于37℃恒温培养24小时，然后于2～4℃短期保藏。其中固体斜面培养基组成如下：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，琼脂2.0％，pH 7.0。
将约1cm2的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01接入装有液体培养基的250ml三角瓶中，于37℃在转速180-220rpm下恒温培养18小时。其中种子液体培养基组成如下：葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，pH 7.1～7.2，装液量50ml/250ml摇瓶。
按5％的接种量将种子培养基接入发酵培养基中，经37℃摇瓶培养24小时，转速210rpm。其中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖2％，谷氨酸钠5％，蛋白胨0.8％，NaCl 1％，MgSO4·7H2O 0.05％，MnSO4·H2O 0.01％，K2HPO4 0.1％，pH 7.5，装液量50ml/250ml摇瓶。
发酵结束后，按照实施例1的纸层析法检测发酵液中γ-聚谷氨酸的含量，结果表明其含量为21.3g/L。
实施例6
按实例5的方法制备种子液，并按5％的接种量将种子培养基接入发酵培养基中，经37℃摇瓶培养24小时，转速210rpm。其中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖4％，谷氨酸钠10％，蛋白胨1.2％，NaCl 1.25％，MgSO4·7H2O 0.05％，MnSO4·H2O0.01％，K2HPO4 0.15％，CaCl2 0.04％，pH 7.5，装液量50ml/250ml摇瓶。
发酵结束后，按照实施例1的纸层析法检测发酵液中γ-聚谷氨酸的含量，结果表明其含量为56.3g/L。
实施例7
按实例5的方法制备种子液，并按1％的接种量将种子培养基接入发酵培养基中，经37℃摇瓶培养29小时，转速210rpm。其中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖4％，谷氨酸钠8％，蛋白胨0.8％，NaCl 1.5％，MgSO4·7H2O 0.05％，MnSO4·H2O0.01％，K2HPO4 0.1％，pH 7.5，装液量50ml/250ml摇瓶。
发酵结束后，按照实施例1的纸层析法检测γ-聚谷氨酸的含量，结果表明其含量为36.9g/L。
实施例8
同实例7，将其中的接种量改为2.5％，发酵培养基初始pH值为6.5，发酵培养29小时后按照实施例1的纸层析法检测γ-聚谷氨酸的含量，结果表明其含量为39.8g/L。
实施例9
按实例5的方法制备种子液，并按5％的接种量将种子培养基接入发酵培养基中，培养温度37℃，转速210rpm。其中所述的发酵培养基组成为：葡萄糖4％，谷氨酸钠8％，蛋白胨0.8％，NaCl 1.5％，MgSO4·7H2O 0.025％，MnSO4·H2O0.005％，K2HPO4 0.15％，CaCl2 0.04％，pH 7.5，装液量50ml/250ml摇瓶。
发酵24小时后，按照实施例1的纸层析法检测γ-聚谷氨酸的含量，结果表明其含量为37.2g/L。当发酵时间增加至32小时和46小时后，发酵液中γ-聚谷氨酸含量分别增加到40.1g/L和42.7g/L。
实施例10
同实例9，将其中的MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O和CaCl2含量分别调整为0.05％、0.015％和0.02％后，发酵24小时后，发酵液中γ-聚谷氨酸含量为40.3g/L。

Claims (8)

1.一种枯草芽胞杆菌，其特征在于：所述菌为枯草芽胞杆菌(Bacillussubstilis)XN01，于2008年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCC NO：M 208044。
2.一种用权利要求1所述的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)菌种培养保藏
将枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XN01的菌种在固体斜面培养基于25～40℃恒温培养，然后于2～4℃短期保藏；所述固体斜面培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中蛋白胨0.8～1.0％、酵母膏0.5～1.0％、NaCl 1.0～2.0％以及琼脂1.5～2.0％，其pH值为6.0～8.0；
2)制备种子液
将上述斜面上约1cm2的菌株接入装有液体培养基的250ml的三角瓶中，装液量50ml/250ml摇瓶，于25～40℃下恒温培养10～24小时，转速为180～220rpm；所述液体培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中葡萄糖0.1～1.0％，蛋白胨0.8～1.0％，酵母膏0.5～1.0％，NaCl 1.0～2.0％，pH值为6.5～8.0；
3)摇瓶液体发酵
将种子液转入灭菌后的液体发酵培养中，接种量为1～10％，装液量50ml/250ml摇瓶，于30～40℃恒温培养12～48小时，转速180～220rpm；所述的发酵培养基的组成，以重量体积百分比计，单位是g/100ml，其中糖质碳源1～10％，氮源0.4～3％，L-谷氨酸或谷氨酸钠5～12％，NaCl 0～5％，MgSO4·7H2O 0.01～0.1％，MnSO4·H2O 0.005～0.05％，K2HPO4 0.05～0.5％，CaCl2 0.02～0.2％，pH值为6.5～8.0；
4)提取γ-聚谷氨酸
离心除去发酵液中的菌体，在上清液中加入3～4倍体积的无水乙醇，冷藏24小时后离心并收集沉淀，透析除去小分子后，冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3)中糖质碳源为葡萄糖、蔗糖或麦芽糖。
4.根据权利要求2所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3)氮源的含量为0.8～1.5％。
5.根据权利要求2所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3)L-谷氨酸或谷氨酸钠的含量为8～12％。
6.根据权利要求2所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3)发酵液pH值为7.0～7.5。
7.根据权利要求2～6任一所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3)中的糖质碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖或为其混合物。
8.根据权利要求7所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于：所述步骤3)中的氮源为酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏、玉米浆、(NH4)2SO4、硝酸盐或为其混合物。
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