CN103275875A - 一种康宁木霉及其复合微生物菌剂组合和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种康宁木霉及其复合微生物菌剂组合和用途。本发明公开了一种康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）；还公开了一种复合微生物菌剂组合，其由糖化菌制剂和饲料酵母菌制剂组成，二者分开包装，其特征在于所述糖化菌制剂包含康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）。本发明所述康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）产生的纤维素酶活性高，可作为工农业糟渣蛋白饲料生产中的高效糖化菌剂；所述复合微生物菌剂组合能高效利用工农业糟渣生成单细胞蛋白，尤其是马铃薯渣，发酵后菌体蛋白粗蛋白含量为50.49%，远优于现有技术报道。本发明不仅将工农业糟渣变废为宝，所生成的菌体蛋白可用于饲料，部分替代豆粕或鱼粉，同时解决了工农业糟渣导致环境污染问题。

Description

一种康宁木霉及其复合微生物菌剂组合和用途

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种康宁木霉及其复合微生物菌剂组合和用途。 

背景技术

菌体蛋白饲料是一种生物发酵的蛋白原料，是利用各种基质大规模培养细菌、酵母菌、霉菌、藻类和担子菌而获得的微生物蛋白(或菌体蛋白)。菌体蛋白又称微生物蛋白或单细胞蛋白(single cell protein简称SCP)，是食品工业和饲料工业的重要蛋白质来源。 

生产单细胞蛋白的原料种类很多，大体分为3类，（1）工业废液类：包括造纸废液、酒精废液、味精废液、淀粉废液、生产柠檬酸废液、糖蜜废液、木材水解废液、豆制品废液等；（2）工农业糟渣类：包括白酒糟、啤酒糟、果酒渣、醋糟、酱油糟、豆渣、粉渣、玉米淀粉渣、薯渣、甜菜渣、甘蔗渣、果渣、饴糖渣等；（3）化工产品类：包括石油、石蜡、柴油、天然气、正烷烃、甲醇、乙醇、醋酸等。除以上所介绍的外，农作物秸秆、批壳、饼粕类、畜禽粪便、有机垃圾、风化煤等也可作为原料生产单细胞蛋白。 

以马铃薯渣为例，马铃薯渣主要含水、果胶、粗纤维等多糖物质，蛋白质含量仅在1%～4%之间，淀粉含量<1%，营养价值较低；鲜薯渣水分含量高达80%以上，不便于干燥和运输，生产季节若不及时处理，占用场地且易腐败变质，造成环境污染。将马铃薯渣通过微生物发酵，生成单细胞蛋白饲料，是马铃薯渣生物转化的主要途径，但已有研究报道单位重量的发酵饲料中粗蛋白的得率偏低，始终无法大幅提升。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种康宁木霉及其复合微生物菌剂组合和用途，解决现有技术中发酵产物粗蛋白的得率偏低的缺陷。 

为解决的上述技术问题，本发明公开了一种康宁木霉（Trichoderma koningii）HK43-5，保藏号CGMCC No7422。 

本发明所述康宁木霉HK43-5由亲株康宁木霉40144经太空诱变后筛选获得，已于2013年4月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（中国，北京）保藏，保藏号CGMCC No7422。 

另一方面，本申请还公开了上述康宁木霉HK43-5作为糖化菌剂的用途。 

另一方面，本申请还公开了一种复合微生物菌剂组合，其由糖化菌制剂和饲料酵母菌制剂组成，二者分开包装，其特征在于所述糖化菌制剂包含康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）。 

在一些实施例中，所述糖化菌制剂含有质量比1:2-2:1的康宁木霉HK43-5和泡盛曲霉，其中优选所述糖化菌制剂由质量比1:1的康宁木霉HK43-5和泡盛曲霉组成。本发明利用泡盛曲霉能产生果胶酶，以有利于发酵过程中的糖化。 

在一些实施例中，所述饲料酵母菌制剂为热带假丝酵母(Candida tropicalis)或产朊假丝酵母（Candida utilis）菌，其中优选为热带假丝酵母(Candida tropicalis)1779。 

在一些实施例中，所述饲料酵母菌制剂和所述糖化菌制剂还包含质量百分比的脱脂乳10%，海藻糖5%，维生素C5％。 

另一方面，本发明还公开了所述复合微生物菌剂在制备工农业糟渣蛋白饲料中的用途。 

在一些实施例中，所述工农业糟渣为豆渣、粉渣、玉米淀粉渣、薯渣、甜菜渣、甘蔗渣、果渣、或饴糖渣中之一，其中优选为马铃薯渣。 

在一些实施例中，所述用途包括下列步骤： 

a)马铃薯渣和麸皮以重量份比6:4-9:1混匀，添加2-4%的无机氮源，调节pH值3.0-5.0，制备出含水量为60%-80%的发酵原料； 

b)将所述复合微生物菌剂组合中糖化菌制剂加入发酵原料中混匀，加入量为重量百分比0.1%-1%，30℃发酵12-21h，得到发酵底料； 

c)然后将所述复合微生物菌剂组合中饲料酵母菌制剂接种发酵底料中混匀，加入量为重量百分比0.5-1.5%，继续30℃发酵至90-150h。 

本发明所述康宁木霉HK43-5（CGMCC No.7422）产生的纤维素酶活性高，可作为工农业糟渣蛋白饲料生产中的高效糖化菌剂；所述复合微生物菌剂组 合能高效利用工农业糟渣生成单细胞蛋白，尤其是马铃薯渣，发酵后菌体蛋白粗蛋白含量为50.49%，远优于现有技术报道。本发明不仅将工农业糟渣变废为宝，所生成的菌体蛋白可用于饲料，部分替代豆粕或鱼粉，同时解决了工农业糟渣导致环境污染问题。 

附图说明

图1康宁木霉HK43-5产纤维素酶活性检测。 

图2不同微生物制剂组合发酵马铃薯渣生成粗蛋白含量比较。 

图3复合微生物菌剂组成发酵试验。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

试验材料 

菌种：康宁木霉40144，泡盛曲霉40499，热带假丝酵母1779购自购于中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）；诱变菌株：康宁木霉（Trichoderma koningii）HK43-5（CGMCC No7422）。 

材料：马铃薯渣：来自秦安县仪斌淀粉厂，晒干，粉碎。麦麸皮：市售。 

试剂：麦芽浸膏、硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵、氢氧化钠、硼酸、混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合。以上试剂均为分析纯。硫酸、盐酸，化学纯。 

试验器材：海能全自动凯氏定氮仪K9860，电热恒温培养箱，落地恒温振荡器。 

粗蛋白测定方法：凯氏定氮法，利用全自动凯氏定氮仪测定。 

实施例1、康宁木霉HK43-5产纤维素酶活力研究 

1.1试验材料 

原料:马铃薯渣（秦安县仪斌淀粉厂），小麦麸皮（市售） 

菌种:康宁木霉（Trichoderma koningii）40144（购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC），诱变菌株：康宁木霉HK43-5（由康宁木霉40144经太空诱变后筛选获得）。 

种子培养基：麦芽浸膏10g，自来水1000ml，自然pH。 

马铃薯渣固体发酵培养基：马铃薯渣/麸皮=9/1（W/W），水分含量83%,pH自然。 

1.2试验方法： 

①发酵试验 

将处在对数生长期的康宁木霉孢子浓度调整到108个/ml，按照相同的接种量接种到固态发酵培养基上，发酵72h后测定培养基中纤维素酶活变化。 

②浸取发酵液 

取固态发酵曲约5g，加入蒸馏水50ml，置于50℃水浴摇床上，150r/min浸提1h后，静置片刻，取上清，10000/min离心15min，去除孢子，测定上清夜中纤维素酶酶活。 

③纤维素酶活力测定 

纤维素酶活性单位定义:1ml液体酶，在(50±0.1)℃、pH4.8，1h水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位,用u/ml表示。简写为CMCA-DNS。 

CMCA-DNS酶活力计算 

X1=A×1/0.5×n×2 

式中: 

X1---羧甲基纤维素酶活力，u/ml; 

A---吸光度在标准曲线上查得的还原糖量，mg; 

1/0.5---换算成酶液1ml; 

n---酶样的稀释倍数，（50/发酵曲质量）; 

2---时间换算系数. 

1.3试验结果 

所示，利用康宁木霉HK43-5在马铃薯渣固体发酵培养基中发酵72h后，CMC酶活力达到4.1U/ml,与对照（康宁木霉40144，简称CK）的产酶量2.1U/ml相比，产酶能力提高了近一倍。因此康宁木霉HK43-5可作为工农业糟渣蛋白饲料生产中的高效糖化菌剂。 

实施例2、复合微生物菌剂组合 

2.1糖化菌制剂 

分别将康宁木霉HK43-5和泡盛曲霉40499菌株接种到1%麦芽浸膏培养基中，200r/min、30℃摇床培养60h后，4000r/min离心10min，去上清，得到湿重菌体，然后二者按照下表1（质量比）混合，即得到糖化菌制剂，也可加入保护剂，混合后冻干，包装。所述保护剂可为，一个是加入质量比的脱脂乳10%，甘油5%；另一个是加入质量百分比的脱脂乳10%，海藻糖5%，维生素C5％。 

表1 

	配方1	配方2	配方3
				康宁木霉HK43-5	2	1	1
泡盛曲霉40499	1	1	2

2.2酵母菌制剂， 

热带假丝酵母1779菌株接种到1%麦芽浸膏培养基中，200r/min、30℃摇床培养60h后，4000r/min离心10min，去上清，得到湿重菌体，即得到糖化菌制剂，也可加入保护剂，混合后冻干，包装。所述保护剂可为，一个是加入质量比的脱脂乳10%，甘油5%；另一个是加入质量比的脱脂乳10%，海藻糖5%，维生素C5％。 

实施例3、复合微生物菌剂发酵 

3.1发酵条件优化 

根据单因素试验确定的各个因素的水平,采用Plackett-Burman设计从8个影响因素中筛选具有显著影响的因素。每个因素取2个水平:即高水平（+1）和低水平（-1）。如表2所示。 

表2.Plackett-Burman设计各因素水平及取值范围 

结果与分析 

1.Plackett-Burman设计结果如表3。 

表3.Plackett-Burman设计结果 

将以上结果进行方差分析，结果见表4。 

表4.Plackett-Burman设计结果分析 

注：＊代表影响显著，＊＊代表影响极显著 

根据统计学原理，显著性水平达到95%以上，则认为该因素对响应值的影响显著。由表4可知，模型总体的显著性水平为<0.0001，表明模型极显著，对响应值影响较大的因素是B、C、D、G、H，分别是尿素、含水量、pH值、假丝酵母接种时间和糖化酶接种量，其中尿素、含水量、ph值和糖化酶接种量对发酵培养基中蛋白质含量的影响达到极显著水平。 

该模型的线性回归方程为 

R=+29.83+0.035*A+6.16*B+3.61*C-2.39*D+0.51*E+0.26*F+1.46*G-2.56*H 

式中，R代表粗蛋白含量的编码值，A、B、C、D、E、F、G、H分别代表麦麸比、尿素、含水量、初始pH、糖化菌种比、假丝酵母接种量、假丝酵母接种时间、糖化酶接种量的编码值。 

相应的，线性回归方程可以由各因素的真实值给出： 

y=+7.15038+0.027824x₁+6.15992x₂+0.36130x₃-2.39130x₄+0.67753x₅+0.52338x₆+0.48703x₇-5.11124x₈

式中，y代表粗蛋白含量的真实值，x₁、x₂、x₃、x₄、x₅、x₆、x₇、x₈分别代表麦麸比、尿素、含水量、初始pH、糖化菌菌种比、假丝酵母接种量、假丝酵母接种时间、糖化菌接种量的真实值。 

由模型得到的影响因素为尿素、含水量、初始pH值、假丝酵母接种时间和糖化菌接种量，其中尿素含量一定与粗蛋白含量成正比，不能作为影响因素，含水量可以由模型计算得到，因此最终得到的注意影响因素为pH值、假丝酵母接种时间和糖化菌接种量。由此模型预测得到的理论最大粗蛋白含量为52.2498%，此时各主要影响因素的取值分别为：pH3.0、假丝酵母接种时间为21h、糖化菌接种量为0.1%。 

3.2验证试验 

为了验证模型的有效性，进行了6组模型验证实验。验证试验发酵条件为： 麦麸比（马铃薯渣：麸皮）为7:3、尿素含量为3%、含水量为60%、菌种比（康宁木霉：泡盛曲霉）为1:1、假丝酵母接种量为1%、pH3.00、假丝酵母接种时间为21h、糖化菌接种量为0.1%，30℃发酵120h。结果见表5：最大粗蛋白含量预测值与实测值相近，平均相对误差为3.23%，证明该工艺生产的马铃薯渣菌体蛋白有较好的重现性。 

表5马铃薯渣菌体蛋白发酵模型预测值及实验值 

实施例4、初始混合菌发酵与诱变混合菌发酵试验对比 

复合菌剂1：康宁木霉40144、泡盛曲霉40499。 

复合菌剂2：康宁木霉HK43-5；泡盛曲霉40499。 

酵母菌剂：热带假丝酵母1779。 

材料：马铃薯渣：来自秦安县仪斌淀粉厂，晒干，粉碎。麦麸皮：市售。 

试剂：硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵、氢氧化钠、硼酸、混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合。以上试剂均为分析纯。硫酸、盐酸，化学纯。 

试验器材：海能全自动凯氏定氮仪K9860，电热恒温培养箱，落地恒温振荡器。 

试验方法 

发酵工艺：两种菌剂的发酵工艺均通过单因素试验、Plackett-Burman试验 及响应面试验进行优化确定。 

复合菌剂1发酵试验： 

发酵培养基组成：马铃薯渣：麸皮为7:3；添加尿素含量3.6%；含水量63%；调节培养基pH至7.0。 

发酵条件：糖化菌菌种比（康宁木霉：泡盛曲霉）为1:1、接种量为1%（质量百分比），30℃培养12h后，接入1%（质量百分比）的假丝酵母，30℃发酵至120h。 

复合菌剂2发酵试验： 

发酵培养基组成：马铃薯渣：麸皮为7:3、添加尿素含量为3%、含水量为60%，调节培养基pH至3.0。 

发酵条件：糖化菌菌种比（康宁木霉：泡盛曲霉）为1:1、接种量为0.1%（质量百分比），30℃培养21h后接入1%（质量百分比）的假丝酵母，30℃发酵至120h。 

复合微生物菌剂组成比例试验： 

改变复合菌剂2中康宁木霉与泡盛曲霉的质量百分比进行发酵试验，两者比例分别取1:2、1:1、2:1，发酵结果与复合菌剂1发酵结果进行比较。 

粗蛋白测定方法：凯氏定氮法，利用全自动凯氏定氮仪测定。 

试验结果： 

如图2所示，应用复合菌剂1，即康宁木霉40414和泡盛曲霉40499复合菌剂与热带假丝酵母1779菌剂在优化的发酵工艺下，发酵生产的马铃薯渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量在120h达到最大值22.52%。应用复合菌剂2，即康宁木霉HK43-5和泡盛曲霉40499复合菌剂与热带假丝酵母1779菌剂在优化的发酵工艺下，发酵生产的马铃薯渣菌体蛋白饲料中粗蛋白含量在96h达到最大值49.18%。因此应用复合菌剂2和酵母菌剂非同步发酵工艺，能高效利用马铃薯渣生成单细胞蛋白饲料，所得的菌体蛋白饲料中粗蛋白含量显著提高，并且糖化菌剂使用量少，发酵周期短，仅需96小时即可完成对马铃薯渣的降解和转化。 

如图3所示，使用由不同比例康宁木霉与泡盛曲霉组成的复合菌剂进行发 酵试验所得的菌体蛋白饲料中粗蛋白含量没有显著差异，但与复合菌剂1发酵结果相比，差异显著。 

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。 

Claims (10)

1.一种康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）。

2.权利要求1所述康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）作为糖化菌剂的用途。

3.一种复合微生物菌剂组合，其由糖化菌制剂和饲料酵母菌制剂组成，二者分开包装，其特征在于所述糖化菌制剂包含康宁木霉HK43-5（CGMCCNo7422）。

4.如权利要求3所述复合微生物菌剂组合，其特征在于所述糖化菌制剂包含质量比2:1-1:2的康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）和泡盛曲霉。

5.如权利要求3所述复合微生物菌剂组合，其特征在于所述糖化菌制剂包含质量比1:1的康宁木霉HK43-5（CGMCC No7422）和泡盛曲霉。

6.如权利要求3所述复合微生物菌剂组合，其特征在于所述饲料酵母菌制剂为热带假丝酵母或产朊假丝酵母菌。

7.如权利要求1所述复合微生物菌剂组合，其特征在于所述饲料酵母菌制剂为热带假丝酵母。

8.权利要求3-7中任一项所述复合微生物菌剂组合在制备工农业糟渣蛋白饲料中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于所述工农业糟渣为豆渣、粉渣、玉米淀粉渣、薯渣、甜菜渣、甘蔗渣、果渣、或饴糖渣中之一。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于其包含下列步骤：

a)马铃薯渣和麸皮以重量份比6:4-9:1混匀，添加2-4%的无机氮源，调节pH值3.0-5.0，制备出含水量为60%-80%的发酵原料；

b)将所述复合微生物菌剂组合中糖化菌制剂加入发酵原料中混匀，加入量为重量百分比0.1%-1%，30℃发酵12-21h，得到发酵底料；

c)然后将所述复合微生物菌剂组合中饲料酵母菌制剂接种发酵底料中混匀，加入量为重量百分比0.5-1.5%，继续30℃发酵至90-150h。

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