CN114015578B - 康宁木霉菌及其发酵产物、含有其的组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种康宁木霉菌及其发酵产物、含有其的组合物及应用。所述康宁木霉菌的ITS序列与SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有至少99％的同源性，且能够耐受铜离子。本发明的发明人经过创造性劳动，通过大量的筛选、鉴定、评估试验，筛选出一株耐受铜离子的康宁木霉菌菌株(Trichoderma koningiopsis)Ty10，该菌株对铜例子的耐受能力高达到5.6mM。

Description

康宁木霉菌及其发酵产物、含有其的组合物及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一株康宁木霉菌及其发酵产物、 含有其的组合物及应用。
背景技术
重金属是指比重大于5.0g/cm3的金属元素，由于自然或人为的因素在土壤中 过量沉积而造成污染。与有机污染物不同，绝大部分重金属在土壤中不能被降 解，同时会通过食物链在生物体内累积，甚至转化为更具毒性的化合物从而影 响人类的身体健康。这些重金属通过农作物的富集作用进入人体，当超过人体 的生理负荷时就会引起生理功能改变，主要有慢性中毒、致癌作用、致畸作用、 ***反应和对免疫功能的影响等。铜作为一种土壤中的重金属污染物，在所有 的生命***中，细胞内的铜离子平衡机制是受到严格调控的，一旦受到干扰就 会导致威尔逊疾病和门克斯疾病等。铜超标在重金属突然污染中广泛存在。长 期处于重金属污染的土壤微生物种群和多样性会明显减少，不利于农作物生长。
目前，很多微生物用于农业领域，发挥着促进作物生长、防治病害、增加 产量、提升农作物品质等作用，然而这些传统的微生物菌株，对铜的耐受能力 普遍较弱，当将其应用于铜超标的环境中时，菌株难以存活，生长受到抑制， 无法将其应用到在铜超标土壤中进行农业生产的活动中去，在铜超标土壤根本 没办法发挥优势。
因此，筛选一株高耐受铜离子的菌株，应用价值重大。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一株康宁木霉菌及其发酵产物、含有其 的组合物及应用。该株康宁木霉菌能够耐受铜离子。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一株康宁木霉菌，所述康宁木霉菌的ITS序列与SEQ ID NO：1所示的DNA 序列具有至少99％的同源性，且所述康宁木霉菌能够耐受铜离子。
在其中一个实施例中，所述康宁木霉菌对弯孢霉稻瘟病菌CX3具有抑制作 用。
在其中一个实施例中，所述康宁木霉菌对镰刀菌具有抑制作用。
在其中一个实施例中，所述康宁木霉菌的保藏号为：CCTCC M 2017146。
如上所述的康宁木霉菌的发酵产物。
一种组合物，包含有如上所述的康宁木霉菌，和/或，如上所述的发酵产物， 所述组合物还包含有以下a)、b)组分中的至少一种：
a)作为菌剂成分的助剂和/或载体；
b)农业有效量的选自以下的化合物或者组合物中的至少一种：营养素、肥 料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀 虫剂；
其中b)组分中不含有所述康宁木霉菌且不含有所述发酵产物。
一种培养如上所述的康宁木霉菌的方法。
在其中一个实施例中，培养所使用的培养基的碳源是葡萄糖。
在其中一个实施例中，培养所使用培养基的氮源为酪蛋白。
在其中一个实施例中，培养所使用的培养基的pH为6.3～6.7。
在其中一个实施例中，培养所使用的培养温度为27.5℃～28.5℃。
一种在铜含量超标的土壤中种植作物的方法，所述方法包括如下步骤：
土壤前处理：将有效剂量的如上所述的康宁木霉菌，或如上所述的发酵产 物，或如上所述的组合物施用于铜含量超标的土壤；
作物种植：将作物种植于经所述前处理的土壤中。
本发明的发明人经过创造性劳动，通过大量的筛选、鉴定、评估试验，筛 选出一株耐受铜离子的康宁木霉菌菌株Ty10(Trichoderma konigii Ty10)，该菌 株对铜例子的耐受能力高达到5.6mM。
本发明耐受铜离子的康宁木霉菌Ty10(Trichoderma konigii Ty10)，已于2017年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉市武昌珞珈山，武汉大学， 邮编：430072，保藏号为CCTCC NO:M 2017146。
附图说明
图1为耐铜离子菌株的平板复筛结果图；
图2为菌株Ty10-2在不同铜离子浓度平板中的生长情况；
图3为菌株Ty10-2的致死铜离子浓度的线性回归，其中：横坐标“copperconcentration”表示“铜浓度”；纵坐标“colony diameter”表示“菌落直径”；
图4为A为菌株Ty10-2在平板上的生长状况；B为菌株Ty10-2菌丝图；C 为菌株Ty10-2分生孢子梗；D为菌株Ty10-2孢子(注：图中标尺均为10μm)；
图5为A为菌株DNA的电泳图；B为菌株PCR的电泳图；
图6为耐铜菌株Ty10-2的***发育树。
图7为Ty10发酵液对植物病原菌的抑制效果；A为对照；B为对弯孢霉CX3的抑制；C为对照；D为对镰刀菌的抑制。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的康宁木霉菌株及其应用作进一步详细的说 明。
本发明实施例一株康宁木霉菌，所述康宁木霉菌的ITS序列与SEQ ID NO： 1所示的DNA序列具有至少99％的同源性，且所述康宁木霉菌能够耐受铜离子。
在一个具体示例中，所述康宁木霉菌对弯孢霉稻瘟病菌CX3具有抑制作用。
在一个具体示例中，所述康宁木霉菌对镰刀菌具有抑制作用。
在一个具体示例中，所述康宁木霉菌的保藏号为：CCTCC M 2017146。
如上所述的康宁木霉菌的发酵产物。该发酵产物包括菌丝、孢子等，该发 酵产物能够耐受铜离子，并且对弯孢霉稻瘟病菌CX3、镰刀菌具有抑制作用。
一种组合物，包含有如上所述的康宁木霉菌，和/或如上所述的发酵产物， 所述组合物还包含有以下a)、b)组分中的至少一种：
a)作为菌剂成分的助剂和/或载体；
b)农业有效量的选自以下的化合物或者组合物中的至少一种：营养素、肥 料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀 虫剂；
其中b)组分中不含有所述康宁木霉菌以及所述发酵产物。
一种培养如上所述的康宁木霉菌的方法。
在一个具体示例中，培养所使用的培养基的碳源是葡萄糖。
在一个具体示例中，培养所使用培养基的氮源为酪蛋白。
在一个具体示例中，培养所使用的培养基的pH为6.3～6.7。
在一个具体示例中，培养所使用的培养温度为27.5℃～28.5℃。
一种在铜含量超标的土壤中种植作物的方法，所述方法包括如下步骤：
土壤前处理：将有效剂量的如上所述的康宁木霉菌，或如上所述的发酵产 物，或如上所述的组合物施用于铜含量超标的土壤；
作物种植：将作物种植于经所述前处理的土壤中。
本发明实施例的菌株康宁木霉菌Ty10(Trichoderma konigii Ty10)，以下简 称为Ty10-2，在PDA平板上生长迅速，在28℃恒温培养箱培养2d即产孢，48h 即长满平板，在铜环境中，生长速度快，产孢能力不受明显影响；该菌株最适 培养条件为：碳源葡萄糖，氮源酪蛋白胨，pH为6.5；该菌株对铜有明显抗性， 能够在含5mM铜的培养基平板上生长，IC50达到2.8mM。
1材料
1.1生物材料
实验室中已获得的200多株木霉菌株，包括编号如下的菌株：Ts93-3、Ts38-3、Ts59-3、Ts6-4、Ts77-4、Ts6-3、Ts78-3、Ts17-1、Ts68-2以及Ty10-2。
1.2主要药品
Figure BDA0002796305120000051
Figure BDA0002796305120000061
1.3主要仪器及设备
Figure BDA0002796305120000062
1.4培养基
(1)PDA培养基(配方见表3)
Figure BDA0002796305120000063
土豆洗净去皮称取200g，切成小块加入适量水在电磁炉上加热至沸腾，维 持20min～30min，可用4层纱布过滤，称取20g无水葡萄糖溶于滤液中，定容 至1000ml，分装到5个锥形瓶，每瓶200ml，每瓶中加入琼脂粉2.8g 121℃灭菌 20min(1L加14g，每瓶200ml加2.8g)。
(2)CYA培养基(配方见表4)
Figure BDA0002796305120000071
分别称取NaNO3 3g，K2HPO4·3H2O 1g，KCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g， FeSO4·7H2O0.01g，蔗糖30g；溶于蒸馏水中，定容至1000mL。
分装到10个250ml的锥形瓶中，每瓶100mL(其中每瓶加入1.4g琼脂)， 121℃灭菌20min。
(3)基础培养基(瓦克斯曼培养基，配方见表5)
Figure BDA0002796305120000072
分别称取胰蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁带七个结晶水 0.5g；溶于蒸馏水中，定容至500mL。分装置5个250mL的锥形瓶中，每瓶100 mL(其中每瓶加入1.4g琼脂)，121℃灭菌20min。
(4)碳源优化培养基(配方见表6)
Figure BDA0002796305120000073
Figure BDA0002796305120000081
碳源：葡萄糖、酵母提取物、甘露醇、甘油、果糖、乳糖、可溶性淀粉、 蔗糖、麦芽糖。
分别称取胰蛋白胨5.5g，磷酸二氢钾1.1g，硫酸镁带七个结晶水0.55g；先 配制基础成分(除碳源外)溶于蒸馏水中定容至1100mL。分装到18个250mL 的锥形瓶中，每瓶60mL，后将各个碳源按1％用量添加至锥形瓶中(其中每瓶 加入0.84g琼脂)，121℃灭菌20min。
(5)氮源优化培养基(配方见表7)
Figure BDA0002796305120000082
氮源：氯化铵、酪蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵。
分别称取葡萄糖8g，KH2PO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.4g和各种氮源4g；先配 制基础成分(除氮源外)溶于蒸馏水中定容至800mL。分装到12个250mL的 锥形瓶中，每瓶60mL，后将各个氮源按0.5％用量添加至锥形瓶中(其中每瓶 加入0.84g琼脂)。121℃灭菌20min。
(6)优化后培养基(配方见表8)
Figure BDA0002796305120000083
Figure BDA0002796305120000091
pH从5.0～8.0设为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0分为七个梯度。
分别称取酪蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，溶于 蒸馏水中定容至1L，先分装到5个250ml的锥形瓶中，每瓶120ml，另外使用 H2SO4和KOH调pH。
1.5主要试剂配方
(1)1M Tris-HCl(pH8.0)100mL：12.11g Tris碱加入80mL水，浓盐酸4.9mL， 盐酸调pH值到8.0。
(2)0.5M EDTA(pH8.0)100mL：18.01g EDTA钠盐加水80mL，2gNaOH 调pH值到8.0。
(3)5M NaCl 100mL：29.22g NaCl溶解在100mL水中。
(4)3M NaAC(pH5.0)100mL：在60mL水中溶解24.61g无水乙酸钠(NaAc)， 用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，灭菌备用。
(5)CTAB提取液(pH8.0)100mL：2g CTAB(w/v)，10mL 1M Tris-HCl， 4mL 0.5MEDTA，28mL 5M NaCl(在研磨前加入2％的β-巯基乙醇)。
(6)琼脂糖凝胶电泳液：43ml 1×TAE，0.4g琼脂糖加入锥形瓶内，摇匀， 用微波炉加热至沸腾后，倒入电泳槽内。
2方法
2.1菌株分离与纯化
从实验室经过反复筛选和纯化得到200株真菌，将获得的菌株通过筛选培 养基对铜的耐受性进行筛选。
2.2高耐铜菌株的初筛和复筛
2.2.1硫酸铜溶液的配制
配置300mM CuSO4 60ml，称取4.5g CuSO4·5H2O溶于60ml无菌水中，在 超净台中用干净的注射器将硫酸铜溶液用一次性过滤器过滤到已灭好的蓝色玻 璃瓶中备用，注明试剂名称，浓度，配置日期。
2.2.2耐铜木霉菌株的初筛
在超净工作台中，用移液枪取1ml 300mM硫酸铜溶液到200ml CYA培养基 中，使培养基中的Cu2+含量为1.5mM，倒平板后冷却20min～30min。用已灭菌 的黄色枪头在菌斑上打孔，用灭菌后接种针挑选比较圆润的菌饼接种到CYA培 养平板上，封膜后放入28℃恒温培养箱中倒置培养2d。
2.2.3耐铜木霉菌株的复筛
在超净工作台中，用移液枪吸取805μl 300mM CuSO4硫酸铜溶液至120ml CYA培养基中，使培养基中的Cu2+含量为2mM/L，倒平板后冷却20-30min。用 已灭菌的黄色枪头在菌斑上打孔，用灭菌后接种针挑选比较圆润的菌饼接种到 大平板上，封膜后放入28℃恒温培养箱中倒置培养，1.5d后测量直径并记录数 据(精确到0.01)。
2.3致死浓度的测定
融化6瓶120mlCYA培养基，每个浓度重复三次，按下表9依次倒平板编 号：
Figure BDA0002796305120000101
编号后用黄枪头打菌饼到平板上，封膜后放入28℃恒温培养箱中倒置培养， 40h后测量菌落的直径，并记录数据(精确到0.01)。
2.4菌株鉴定
2.4.1形态学鉴定
对复筛所得菌株进行形态学鉴定，将活化后的菌株打菌饼(0.5cm)，将菌 病接种到平铺有玻璃纸的PDA培养基上，28℃倒置培养2d左右。用灼烧后的 接种针刮取少量菌丝到滴有纯净水的载玻片上，用盖玻片盖压，盖压时用镊子 夹着载玻片的一端从一侧慢慢盖压尽量不要有气泡。将制好的装片放到电子显 微镜下观察其生物学形态，找出具有形态学特征的菌丝、分生孢子梗以及孢子， 拍照后注明标尺。
2.4.2分子生物学鉴定
2.4.2.1基因组DNA的提取(CTAB法提取真菌DNA)
(1)收集要提取真菌组织，用载玻片轻轻刮取菌体，放入研钵内写好编号， 加入少量石英砂用研磨棒研磨。
(2)研磨后，取600mg迅速转入第一批15mL的离心管内加入少量CTAB 提取液继续用研磨棒，充分研磨后，加入预热30min(65℃)的CTAB提取液 3mL，60℃水浴60min，每隔10min摇匀一次。
(3)用移液枪吸取混合物中的上清液移到第二批离心管中，静置10min后， 4℃，12000rpm离心15min。
(4)离心后取上清移到第三批离心管中，加入3mL氯仿：异戊醇(24：1)， 4℃，12000rpm离心15min。
(5)离心后再次取上清，加入与样品等量的氯仿异戊醇；再次离心取上清， 加入300μL提前预冷的10×NaAC，9mL无水乙醇，冰冻30min后离心弃上清。
(6)再加入70％乙醇，4℃，12000rpm离心10min。
(7)弃上清，待沉淀沥干后，加入40μL ddH2O溶解，贴上各菌株编号， 放入-20℃储存备用。
2.4.2.2.PCR扩增
利用PCR仪通过通用引物对提取的DNA进行扩增，通过通用引物进行16S rDNA的扩增。PCR扩增25μL反应体系：2.5μL 10×Taq酶缓冲液，0.2μmol/引 物，2μL 200mmol/LdNTP，20ng DNA模板，1U Taq酶(TaKaRa)，17μL ddH2O。 回收目的片段，扩增产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后送至生物科技公司进 行测序。
2.4.2.3凝胶电泳实验
(1)装板：配好的琼脂糖凝胶倒入槽内，插上梳子待其凝固即可拔出梳子。 在电泳槽中倒入电泳液，漫过胶板3cm～4cm即可。
(2)点样：将提取的DNA和PCR仪中的DNA扩增产物用移液枪各吸取7μl， 将其与核酸染料混匀(多次吹吸)，倾斜打入孔内，不能有气泡。
(3)电泳：加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关。
2.4.2.4.构建***发育树
(1)通过已知测定序列在NCBI上进行比对，寻找亲缘关系相近的木霉菌， 确定属或种。
(2)选择同属物种12种和相邻属物种5种木霉菌进行***发育树构建。
(3)通过Clustalx进行序列比对，用MEGA5.0进行***发育树构建，确定已 测木霉菌在真菌中的分类地位。
2.5单因素变量优化培养条件
培养基的优化就是通过实验手段配比和筛选找到一种最适合其生长及发酵 的培养基。“单因素法”是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改 变一个因素的水平而其它因素保持不变，然后逐个因素进行考察，是实验室最 常用的优化方法控制单因素变量(碳源、氮源、pH值)优化培养，只改变基础 培养基中的单个因素，假定各个因素之间没有交互作用，设计不同的碳氮源和 pH值，通过对实验组和对照组的数据分析和比较菌落的大小，从而选择最佳的 碳氮源和pH。
2.6正交优化
本实验采用3因素3水平L9(34)正交设计，其中碳源：15g/L，10g/L， 和5g/L；氮源：8g/L，5g/L，和2g/L；pH：5，6和7。具体设计方案见表10。 共9组培养基，每组两瓶，每瓶60ml，铜离子浓度分别为0、2mM。每瓶倒三 个大平板，将菌饼接到平板上，封膜后放入28℃恒温培养箱中倒置培养，40h 后测量直径并记录数据(精确到0.01)。
Figure BDA0002796305120000131
2.7抑制病原菌实验
选定优化后的培养条件进行发酵培养，发酵液除菌过滤后，按20％的量添 加到培养基，进行抑菌实验。
3结果与讨论
3.1铜耐受菌株的初步筛选
从实验室获得的45株菌株中进行铜耐受的初步筛选，通过测量菌落直径可 以初步判断不同菌株对铜的耐受程度，在含1.5mMCu浓度的筛选培养基中筛选 出长势较好的菌株，包括Ts93-3和Ty10-2。
3.2耐铜菌株的复筛
将初筛得到的两株铜耐受菌株(包括Ts93-3和Ty10-2)，通过不同铜浓度的 CYA筛选培养基测量菌的直径，根据实验结果得出Ty10-2菌株的长势较好(图 1)，因此选择木霉菌Ty10-2作为接下来的实验对象。
3.3耐铜菌株致死浓度的测定
将筛选的菌株接到含不同铜浓度的CYA培养基上，铜浓度设为0mM、1mM、 2mM、3mM、4mM、5mM、6mM分为7个浓度梯度，将接好的菌株放到真菌 培养箱倒置培养40h后，测量菌落直径大小，图2为菌株在不同铜浓度下的生 长情况。
Figure BDA0002796305120000141
如图3所示，耐铜菌株Ty10-2致死浓度的线性回归方程是：y＝6.577-1.256x, 当y＝0时，x＝5.2。即该菌株在铜离子胁迫下，其致死浓度为5.2mM。
3.4耐受铜菌株的分类鉴定
3.4.1形态学鉴定
用电子显微镜观察制好的装片，找到了分生孢子梗、菌丝和孢子的镜像， 用平板相机进行拍照得到如图4所示的形态图片。其中，图A为菌株在平板上 的生长状况；图B为菌株菌丝图；图C为菌株分生孢子梗；图D为菌株孢子(注： 图中标尺均为10μm微米)。
发明人发现，该菌株在PDA培养基上生长迅速，48h即长满平板(直径8.5cm， 图4A)，气生菌丝发达，从中间开始产绿色孢子，培养基背面无颜色；菌线有 隔(图4B)；分生孢子梗对称多个分支，顶端一般3个分支(图4C)；分生孢子 绿色椭圆形(图4D)。根据形态学特征，初步估计该菌株为康宁木霉。
3.4.2分子生物学鉴定
菌株的DNA和PCR扩增产物跑胶40-60min，将胶板拿到凝胶电泳成像系 统中，DNA和PCR扩增产物电泳图像如图5所示。如图5A中有一条明显的 DNA带，图5B中DNA大小在540bp左右。
3.4.3构建***发育树
采用ITS区序列(如SEQ ID No.1所示)分析，对菌株进行鉴定。由凝胶电 泳图可知，目的片段大小在540bp左右。目的片段切胶回收、测序后，得到该 菌株的基因组序列。将其序列提交至NCBI的GenBank数据库中。利用BLAST 程序进行同源性比对，结果表明，目的菌株序列间相似性最高的为Trichoderma koningiopsis strain，相似性为99％。因此该菌株可判定为康宁木霉菌，***发育 树见图6。SEQ ID No.1：
cggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaaccataccaaactgttgcctcggcggggtcacgccc cgggtgcgtcgcagccccggaaccaggcgcccgccggagggaccaaccaaactctttctgtagtcccctc gcggacgttatttcttacagctctgagcaaaaattcaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggca tcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacatt gcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggt cggcgttggggatcgggaacccctaagacgggatcccggccccgaaatacagtggcggtctcgccgcagc ctctcctgcgcagtagtttgcacaactcgcaccgggagcgcggcgcgtccacgtccgtaaaacacccaac ttctgaaatg ttgacctcggatcaggtagg aatacccgct gaacttaagc atatcaaaagccgggagaga a
3.5单因素变量优化培养条件
3.5.1碳源优化
利用单因素法对耐铜菌的培养基组分进行了筛选，保持培养基中其它基础 成分不变，改变培养中的碳源，以此来选择最适生长的碳源。选择9个相关碳 源因素为：蔗糖、乳糖、果糖、甘油、酵母提取物、葡萄糖、可溶性淀粉、甘 露醇、麦芽糖。设置一个对照组和实验组，其中实验组培养基铜浓度为2mM， 培养36h后测量菌饼直径。
Figure BDA0002796305120000151
Figure BDA0002796305120000161
根据实验结果所示，对数据进行处理，如表12所示，得到碳源优化结果， 选择最优碳源为葡萄糖。
3.5.2氮源优化
确定最佳碳源为葡萄糖之后，改变培养基中的氮源成分，其它基础成分保持 不变，pH为原始值。选择6个相关氮源因素为：硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、硫 酸铵、胰蛋白、酪蛋白。
Figure BDA0002796305120000162
通过对照组与实验组，培养36h后测量菌的直径，对实验数据分析处理， 如表13所示，根据实验结果选择酪蛋白作为最佳氮源。
3.5.3pH值优化
确定碳氮源成分之后，保持其它成分不变，改变培养基的pH值，将优化培 养基的pH设为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8分为7个梯度。通过对照组和实验 组，培养36h后测量菌的直径。
Figure BDA0002796305120000163
分析处理数据后如表14所示，当pH值大于7.0以后，CK生长明显减弱， 所以不能选择；另外，pH6.5时，虽然CK不是最大，但是加铜后，耐受能力最 强，因此选择6.5作为最优pH。
3.6正交优化
菌株在9种不同培养基上生长40h后，测量菌饼直径，将数据进行统计。
极差分析表明(表15)，3个因素对菌株生长影响大小依次为氮源>pH>碳源。
Figure BDA0002796305120000171
/>
Figure BDA0002796305120000172
3.7抑制病原菌
抑菌实验表明，Ty10的发酵液对两种病原菌(弯孢霉CX3与镰刀菌)均有 明显抑制效果。结果见图7。图7中：Ty10发酵液对植物病原菌的抑制效果；A 为对照；B为对弯孢霉CX3的抑制；C为对照；D为对镰刀菌的抑制。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。
序列表
<110> 南 昌 师 范 学 院
<120> 康宁木霉菌及其发酵产物、含有其的组合物及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 591
<212> DNA
<213> 康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)
<400> 1
cggagggatc attaccgagt ttacaactcc caaacccaat gtgaaccata ccaaactgtt 60
gcctcggcgg ggtcacgccc cgggtgcgtc gcagccccgg aaccaggcgc ccgccggagg 120
gaccaaccaa actctttctg tagtcccctc gcggacgtta tttcttacag ctctgagcaa 180
aaattcaaaa tgaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga 240
acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 300
aacgcacatt gcgcccgcca gtattctggc gggcatgcct gtccgagcgt catttcaacc 360
ctcgaacccc tccggggggt cggcgttggg gatcgggaac ccctaagacg ggatcccggc 420
cccgaaatac agtggcggtc tcgccgcagc ctctcctgcg cagtagtttg cacaactcgc 480
accgggagcg cggcgcgtcc acgtccgtaa aacacccaac ttctgaaatg ttgacctcgg 540
atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc atatcaaaag ccgggagaga a 591

Claims (6)

1.一株康宁木霉菌，其特征在于，所述康宁木霉菌的ITS序列如SEQ ID NO：1所示，且所述康宁木霉菌能够耐受铜离子；所述康宁木霉菌的保藏号为：CCTCC NO: M 2017146。
2.权利要求1所述的康宁木霉菌的发酵产物。
3.一种组合物，其特征在于，包含有权利要求1所述的康宁木霉菌和/或权利要求2所述的发酵产物，所述组合物还包含有以下a）、b）组分中的至少一种：
a）作为菌剂成分的助剂和/或载体；
b）农业有效量的选自以下的化合物或者组合物中的至少一种：营养素、肥料、杀微生物剂以及杀虫剂；
其中，b）组分中不含有所述康宁木霉菌且不含所述发酵产物。
4.一种培养权利要求1所述的康宁木霉菌的方法，其特征在于，培养所使用的培养基的碳源是葡萄糖；或/和培养所使用培养基的氮源为酪蛋白；或/和培养所使用的培养基的pH为6.3～6.7。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，培养所使用的培养温度为27.5℃～28.5℃。
6.一种在铜含量超标的土壤中种植作物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
土壤前处理：将有效剂量的权利要求1所述的康宁木霉菌，或权利要求2所述的发酵产物，或权利要求3所述的组合物施用于铜含量超标的土壤；
作物种植：将作物种植于经所述前处理的土壤中。
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