CN110616153A - 康宁木霉lccc30119在生产纤维素酶和烟叶发酵中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119在生产纤维素酶和烟叶发酵中的应用，康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119能够产生高酶活性的纤维素酶，利用康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119生产纤维素酶，为纤维素酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现纤维素酶的规模化生产；将具有产高酶活力的纤维素酶的康宁木霉应用到烟叶发酵中，能加速烟叶中纤维素的降解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。
Description
技术领域
本发明涉及康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119在生产纤维素酶烟叶发酵中的应用，属于微生物应用的技术领域。
背景技术
纤维素酶不是单一酶，而是指生物降解植物纤维素生成葡萄糖的三种起协同作用的一组酶，只有在三类酶的协同作用下，才能最终把纤维素分子分解为葡萄糖。纤维素酶在烟叶醇化过程中的主要酶类，能促使烟叶理化特性发生变化。
目前，烟叶在采摘经过打叶复烤后，并不能实现工业的可用性，还需要经过自然醇化以及人工醇化，造成时间以及资金的积压，会给烟草企业带来很大的损失，同时一些烟叶随着时间的推移，造成工业的不可用性，会带来更大的损失，而生物酶的意义就在于能够提高烟叶的可用性。
研究发现有很多微生物可以分解纤维素，目前产纤维素酶的真菌主要有木霉属和曲霉属。康宁木霉是产纤维素酶最常使用到的菌株，但未见利用已有的康宁木霉菌株用来生产高活性纤维素酶及发酵烟叶的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119在生产纤维素酶和烟叶发酵中的应用，康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119能够高产纤维素酶，十分适用于生产纤维素酶和烟叶发酵。
一方面，本发明提供了康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119在生产纤维素酶中的应用，康宁木霉LCCC30119能够产生高酶活性的纤维素酶，为纤维素酶的生产来源提供了一个新的来源。
另一方面，本发明还提供了一种利用康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119生产纤维素酶的方法，该方法包括将康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119进行发酵培养，发酵液经离心得粗酶液的步骤。
优选的，所述发酵培养为液体发酵培养或固体发酵培养。
优选的，液体发酵培养的条件为：康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119的接种量为105-107cfu/ml，发酵温度为30～60℃，时间为2～4d，所述发酵培养为通风培养，通风量为1：0.8～1.2V/V·min；
优选的，接种量为106cfu/ml，发酵温度为50℃，时间为3d，通风量为1.0V/V·min。
优选的，所述液体发酵培养所用的液体培养基含有麸皮粉4g/L、酵母膏0.5g/L、玉米粉2g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，pH为5-8，液体培养基的装量为60～80％；
优选的，pH为7.6，液体培养基的装量为75％。
优选的，所述固体发酵培养采用三级发酵工艺，具体包括以下步骤：
(1)在斜面PDA培养基上培养康宁木霉LCCC30119菌种，得到菌悬浮液；
(2)将菌悬浮液接种于液体培养基上扩大培养，得到种子液；
(3)将种子液以105-107cfu/g接种于固体培养基，在温度为30～60℃，通风培养后真空干燥，加蒸馏水过滤，得发酵液。
优选的，所述PDA培养基含有：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L；
和/或液体培养基含有：麸皮粉4g/L、酵母膏0.5g/L、玉米粉2g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L；
和/或固体培养基含有：稻壳粉55％、麸皮30％、玉米粉10％、酵母膏3％、硫酸铵1.5％、磷酸二氢钾0.5％；
优选的，通风培养的通风量为0.8～1.2V/V·min；
优选的，通风量为1.0V/V·min。
优选的，发酵液离心的温度为0～4℃，转速为5000～8000rpm，时间为10～20min；优选的，温度为4℃，转速为6000rpm，时间为15min。
另一方面，本发明还提供了康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119或所述的方法在烟叶发酵中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种烟叶发酵方法，在烟叶中接种康宁木霉LCCC30119进行发酵。
优选的，康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119的接种量为105～107cfu/g，发酵的温度为30～60℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。
本发明的有益效果为：
本发明公开了康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119能够产生高酶活性的纤维素酶，为纤维素酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现纤维素酶的规模化生产；将具有产高酶活力的纤维素酶的康宁木霉应用到烟叶发酵中，能加速烟叶中纤维素的降解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。
本发明中，如未指定，所采用原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。本发明使用的康宁木霉(Trichoderma koningii)购于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为：LCCC30119。
实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1利用康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119发酵生产纤维素酶
液体发酵工艺：综合单因素多水平试验、多因素多水平正交试验结果，确定康宁木酶LCCC30119的液体发酵工艺：
(1)菌种制备：将斜面PDA培养基上的菌种用无菌水制成孢子悬浮液，孢子悬浮液菌数为107-108cfu/ml。
(2)液体发酵培养基：含有麸皮粉4g/L、酵母膏0.5g/L、玉米粉2g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、pH 6.5，培养基装量为罐体容积的75％。
(3)发酵罐培养基灭菌：121℃，2h。
(4)接种：利用火焰圈无菌接种，接种量为5％。
(5)液体培养：培养温度34℃，接种于装量为75％液体培养基的发酵罐中，通风培养72h，通风量为1:1(V/V.min)。
固体发酵工艺：康宁木霉LCCC30119固体发酵工艺采用三级发酵工艺：斜面菌种—液体菌种—固体培养。
(1)斜面菌种：在斜面PDA培养基上培养菌种，得到浓度为107-108cfu/ml的菌悬浮液。
(2)种子液培养：含有麸皮粉4g/L、酵母膏0.5g/L、玉米粉2g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，pH 6.5，通风培养48h，通风量为1:1(V/V.min)，种子液浓度为108cfu/ml。
(3)固体培养：稻壳粉55％、麸皮30％、玉米粉10％、酵母膏3％、硫酸铵1.5％、磷酸二氢钾0.5％，按照物料质量与水的质量比为1:1加入蒸馏水。
(4)培养基灭菌：121℃，4h。
(5)接种量：5-10％。
(6)固体培养：通风培养96h。
(7)通风培养后真空干燥，按固体曲干重的10倍加蒸馏水，于40℃保温振荡(200rpm)45min，脱脂棉过滤，得到发酵液。
粗酶液的制备：将液体发酵培养或固体发酵培养所得的发酵液冷冻离心15min，温度4℃，转速为6000rpm，得到的上清液即为粗酶液。
通过对康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119产纤维素酶最适反应温度、最适pH值、热稳定性、pH稳定性的研究，确定康宁木霉LCCC30119产纤维素酶最适反应温度为50℃，最适pH为7.6，发酵液的酶活达到154U/ml。在30-60℃下均较稳定，温度高于60℃，酶活下降。在pH 3-9内，呈先上升后下降趋势，pH为5.0时，其酶活仍保留在最大值的50％以上。
实施例2康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119在烟叶发酵中的应用
将康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119接种于烟叶，康宁木霉LCCC30119的接种量为105～107cfu/g，发酵的温度为30～60℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。
或将实施例2得到的康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119的发酵上清酶液添加到烟叶中，用于发酵，加入的发酵上清酶液在烟叶中的纤维素酶酶活力为10-20U/mg，发酵条件为：温度30～60℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。
本发明以2018重庆B4F原烟作为对照组，以加入106cfu/g的康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119作为处理组1，加入15U/mg制得的纤维素酶酶粉作为处理组2，来发酵烟叶，发酵的温度为50℃，湿度为55％，时间为8d，明显缩短了烟叶的发酵周期，发酵后烟叶中各化学成分的变化如表1所示。
由表1可知，加入康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119或纤维素酶后，烟叶中绿原酸、淀粉、果胶、木质素含量降低，总糖、莨菪亭含量升高，经评吸后，烟香协调，烟气醇和，烟草本香增加，提高烟气细腻度以及舒适性，丰富性。
表1各处理中烟叶的化学成分
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119在生产纤维素酶中的应用。
2.利用康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119生产纤维素酶的方法，其特征在于，该方法包括将康宁木霉LCCC30119进行发酵培养，发酵液经离心得粗酶液的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养为液体发酵培养或固体发酵培养。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，液体发酵培养的条件为：康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119的接种量为105-107cfu/ml，发酵温度为30～60℃，时间为2～4d，所述发酵培养为通风培养，通风量为1：0.8～1.2V/V·min；
优选的，接种量为106cfu/ml，发酵温度为50℃，时间为3d，通风量为1：1.0V/V·min。
5.根据权利要求2或3所述的方法，所述液体发酵培养所用的液体培养基含有麸皮粉4g/L、酵母膏0.5g/L、玉米粉2g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L，pH为5-8，液体培养基的装量为60～80％；
优选的，pH为7.6，液体培养基的装量为75％。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固体发酵培养采用三级发酵工艺，具体包括以下步骤：
(1)在斜面PDA培养基上培养康宁木霉(Trichoderma
koningii)LCCC30119菌种，得到菌悬浮液；
(2)将菌悬浮液接种于液体培养基上扩大培养，得到种子液；
(3)将种子液以105-107cfu/g接种于固体培养基，在温度为30～60℃，通风培养后真空干燥，加蒸馏水过滤，得发酵液；
优选的，所述PDA培养基含有：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L；
和/或液体培养基含有：麸皮粉4g/L、酵母膏0.5g/L、玉米粉2g/L、硫酸铵0.1g/L、磷酸二氢钾0.2g/L；
和/或固体培养基含有：稻壳粉55％、麸皮30％、玉米粉10％、酵母膏3％、硫酸铵1.5％、磷酸二氢钾0.5％；
优选的，通风培养的通风量为1：0.8～1.2V/V·min；
优选的，通风量为1：1.0V/V·min。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵液离心的温度为0～4℃，转速为5000～8000rpm，时间为10～20min。
8.康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119或权利要求2～7任一项所述的方法在烟叶发酵中的应用。
9.一种烟叶发酵方法，其特征在于，在烟叶中接种康宁木霉(Trichoderma koningii)LCCC30119进行发酵。
10.根据权利要求9所述的烟叶发酵方法，其特征在于，康宁木霉LCCC30119的接种量为105～107cfu/g，发酵的温度为30～60℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。
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