CN1522591A - 一种微生物复合酶绿色饲料促长剂及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用微生物工程技术，选用多株菌经复活、分离、纯化、诱变高活性菌种，制作果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、a淀粉酶、植酸酶、光合细菌等生物菌群与矿物质、微量元素等，采用现代化工艺生产高效绿色动物促长剂。该技术由于含有大量的活性酶和促长因子，提高了动物新陈代谢功能，使之产生对动物机体互相协同及综合平衡作用，使营养物质在动物肠道中快速降解，促进动物对饲料营养成分的吸收和转化，以达到促进动物增长和节约饲料的目的。该技术的原料以农作物秸秆、壳皮、饼等副产物，使废物得到了有效的利用，变废为宝，原料来源取之不尽，用之不竭，提高了饲料投入产出比，具有显著的经济效益和社会效益。该技术主要应用于猪、鸡等动物饲料添加剂。本发明生产方法及工艺易掌握，投资小，成本低，适宜个体、中小企业和乡镇投资建厂。

Description

一种微生物复合酶绿色饲料促长剂及其生产方法

本发明涉及一种采用微生物工程技术，选用多株菌经复活、分离、纯化、诱变高活性菌种，制作果胶酶、纤维素酶、蛋白酶、a淀粉酶、植酸酶、光合细菌等生物菌群与矿物质、微量元素等，采用现代化工艺生产高效绿色动物促长剂。该技术由于含有大量的活性酶和促长因子，提高了动物新陈代谢功能，使之产生对动物机体互相协同及综合平衡作用，使营养物质在动物肠道中快速降解，促进动物对饲料营养成份的吸收和转化，以达到促进动物增长和节约饲料的目的。该技术的原料以农作物秸秆、壳皮、饼等副产物，使废物得到了有效的利用，变废为宝，原料来源取之不尽，用之不竭，提高了饲料投入产出比，具有显著的经济效益和社会效益。该技术主要应用于猪、鸡等动物饲料添加剂。本发明生产方法及工艺易掌握，投资小，成本低，适宜个体、中小企业和乡镇投资建厂。

现有技术中有多篇专利文件公开了种种微生物复合酶饲料添加剂及其生产方法，其中最接近的对比文献为：

公开号1296765A公开了利用绿色乳杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等制作微生物饲料添加剂，其缺点是：一是菌种名称没有全部公开；二是工艺设计过于简单。

公开号1223081A公开了利用EM原液制作微生物饲料添加剂，其缺点是：一是EM原液制作及菌种没有公开；二是生产工艺没有完全公开，生产和制作很难实现。

公开号1284286A公开了利用多种生物菌制作微生物饲料添加剂，其缺点是：一是生物菌种的名称和编号没有完全公开，很难制作生物菌剂；二是工艺没有完全公开。

本发明的目的在于克服现有技术工艺设计和配方不足，提供一种采用制作微生物复合酶与微量元素、维生素、矿物质、氨基酸等以及载体复配生产畜禽饲料添加剂的方法，采用制作多菌生物复合酶与合理的微量元素、维生素、矿物质、氨基酸等复配，使之产生对动物机体互相协同及综合平衡作用，通过生物多菌复合酶与其它物质的作用，充分利用饲料的利用率，提高动物对饲料的吸收及其转化，以达到促进动物增长和节约饲料的目的。其中，果胶酶对饲料中不易消化的胶质类物质，具有改善消化和提高饲料的利用率；纤维素酶对饲料中不易消化的纤维素物质，在酶的催化下可转化为糖类成分，利于动物的消化和吸收；蛋白酶可提高饲料中蛋白的利用率，并利用自身菌体蛋白，达到促长效果；a淀粉酶对饲料中不易消化的大量淀粉类物质，在酶的催化下可转化为糖类成分，利于动物的消化和吸收；植酸酶是特异性水解植酸的酶，释放出可以利用的磷，它不仅可以促进植酸磷的消化吸收，还可改善蛋白质和氨基酸以及能量的利用效果，同时，可以减少磷酸氢钙的加入和因磷酸氢钙倒置的氟中毒来源，改善动物因饲用磷酸氢钙的排放对环境的污染；光合细菌含有丰富的叶酸、维生素B群、类胡萝卜素、辅酶Q10、氨基酸、蛋白质等营养成分，特别是用作养鱼饵料添加剂，可实现高密度鱼虾养殖，大幅度提高产量，并有净化水质和防治鱼病的作用。

本技术发明中应用了以下几个生物菌种和有机物、微量元素，其中，生物菌种是从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购进并经复活、分离、纯化、诱变后，选取高活性菌株作为生产菌种；无机原料以及微量元素，需从市场购买；有机物农作物副产物需从有关部门收取或收购，经发酵和烘干处理。

本技术发明的，包括以下几个步骤：

1菌种的诱变

(1)菌悬液的制备

取以上任一种纯化好的斜面菌种一支，在无菌在无菌操作下用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入剩有玻璃珠的锥形瓶中，混合振荡10分钟，以打碎菌块，离心(3000/分钟)5-10分钟，弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤两次，加入10ml无菌生理盐水制成菌悬液，调整菌液浓度为10⁸；

(2)平板制作

将以上预诱变菌种的培养基和培养皿及其它所用器具全部灭菌，培养基取出后降温到60℃左右倒平板，凝固后待用；

(3)诱变处理

①诱变处理采用紫外线灯照射(15w灯管)

②预热：正式诱变照射前先开启紫外线灯10-20分钟；

③取制备好的菌悬液用移液器或移液管移入6厘米无菌培养皿中，加入微量的抗菌素链霉素使之和匀，放入无菌磁力棒并置磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，打开培养皿盖，打开红灯(关闭其它照明灯)，紫外线灯管30厘米照射(视菌钟不同)1-3分钟；

④稀释涂平板

在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5毫升，进行稀释，一般取10⁶-10⁹稀释度的菌液0.2毫升涂于平皿培养基上，每个稀释度涂3个培养皿，用无菌玻璃棒涂匀平板，注意，在每个培养皿背后要标明处理时间、稀释度、组号。28-30℃恒温下培养24-72小时(培养皿用黑布包上)。挑选生长旺盛、活性高的菌株接入试管斜面培养基中进行培养，如此反复诱变、分离、筛选，直至从试管或培养皿中筛选出无杂菌、活力强的有效菌种，然后接入斜面试管中作为生产菌种或做成真空冷冻干燥安瓶管常期保存。其余菌种按以上要求进行诱变，诱变时，要按照每个菌种的生长条件综合因素进行：

2.生物菌酶和发酵菌种及菌剂的发酵制作：

1)黑曲酶AS3.316果胶酶的制作与培养：

(1)斜面菌种制作：

①斜面菌种培养基制作：

首先量5°Be度麦芽汁，测PH值为5～6左右，加入琼脂2，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种；

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上，塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，待培养基表面长出黑褐色孢子为正常，其它颜色为感染杂菌则应淘汰。

(2)二级菌剂培养制作：

①培养基制作：

称豆饼粉60，麦麸35，玉米面4，糖0.5，K₂HPO₄0.1，碳酸钠0.3，硫酸镁0.05，氯化钾，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜(料水比为：1∶0.8左右)，调PH值为6-6.5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水到入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右；

③培养：

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在25℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，直到培养基表面长出黑色孢子时并结饼为成品，如长有其它颜色为感染杂菌。

(3)三级菌酶培养制作：

①培养基制作：豆饼粉60，麦麸34，玉米面5，糖0.5，K₂HPO₄0.1，碳酸钠0.3，硫酸镁0.05，氯化钾，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜(料水比为：1∶0.8左右)，调PH值为6-6.5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，凉至40℃左右时开始接种，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在25℃～30℃之间的无菌室内培养，案培养时间为48小时左右，直到培养料表面长出白色菌并有少量绿色孢子结饼为成品，如有其它颜色为杂菌。

2)康宁木酶AS3.2774纤维素酶的制作与培养：

(1)斜面菌种培养制作：

①斜面培养基制作

马铃薯去皮去芽，称20克切细放入100ml水中，用微火煮开后15分钟即可用双层纱布过滤。取汁为100ml，如水分不足再加些开水补足。另外称葡萄糖1，琼脂2，纤维素0.5(纤维素为将草粉过100目)放置电炉上溶解。

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48小时左右，待培养基表面长出绿色孢子为正常，如长有其它颜色为感染杂菌。

(2)二级菌剂培养制作：

①培养基制作：

草粉50，麦麸39，玉米面10，尿素0.3，硫酸铵0.3，氯化钠0.4，PH值用磷酸调为5左右，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种；

②接种

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水倒入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右；

③培养

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在25℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为72小时左右，培养料表面长出绿色孢子并结饼为成品，如长有其它颜色为感染杂菌。

3)三级菌酶培养与制作：

①培养基制作：

草粉50，麦麸39，玉米面10，尿素0.3，硫酸铵0.3，氯化钠0.4，PH值用磷酸调为5左右，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，然后装入塑料袋或布袋内放置高压锅中1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种。接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为30-48小时左右，直到培养料表面长出白色或有少量绿色孢子并结饼为成品，如长有其它颜色为感染杂菌。

3)黑曲酶AS3.350蛋白酶的制作与培养：

(1)斜面菌种制作：

①斜面菌种培养基制作：

首先量5°Be度麦芽汁，测PH值为5～6左右，加入琼脂2，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立，打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种。

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48小时左右，培养基表面长出黑色孢子为正常，如长有其它颜色为感染杂菌。

(2)二级菌剂培养

①培养基制作：

称豆饼粉60，麦麸35，玉米面5，糖0.5，K₂PO₄0.1，碳酸钠0.3，硫酸镁0.05，氯化钾，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜(料水比为：1∶0.8左右)，调PH值为6-6.5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种。

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水到入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右。

③培养：

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，直到培养料表面长出黑色孢子时并结饼为成品，如长有其它颜色为杂菌。

(3)三级菌酶培养制作：

①培养基制作：

豆饼粉60，麦麸34，玉米面5，糖0.5，K₂HPO₄0.1，碳酸钠0.3，硫酸镁0.05，氯化钾，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜(料水比为：1∶0.8左右)，调PH值为6-6.5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种。

接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％。

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％。

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，培养料表面长出白色菌或有少量黑色孢子并结饼为成品，如长有其它颜色为感染杂菌。

4)黑曲霉淀粉酶AS3.40斜面菌种和菌剂及菌酶的制作：

(1)斜面菌种制作

①斜面培养基制作：

马铃薯去皮去芽，称20克切细放入100ml水中，用微火煮开后15分钟即可用双层纱布过滤。取汁为100ml，如水分不足再加些开水补足。另外称葡萄糖2，琼脂2，蒸馏水100ml，PH7.0，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种。

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，待培养基表面长出并布满黑色孢子时为正常，如有其它颜色为感染杂菌。

(2)二级菌剂培养制作：

①培养基制作：

培养基为：豆饼粉30，麸皮50，玉米粉15.淀粉4，Nacl 0.2，磷酸氢二钠0.8，PH值7.1-7.2；

(3)三级菌酶培养与制作：

培养基为：豆饼粉30，麸皮50，玉米粉15.淀粉4，Nacl 0.2，磷酸氢二钠0.8，PH值为7左右，常压灭菌1小时或1kg/cm2压力灭菌30分钟，降温至40℃按种子液0.5-1％，深层通风发酵或浅层发酵，室内温度为25℃左右，品温35-40℃左右，培养发酵24-40小时，在35-40℃下烘干，即为成品。

5)黑曲酶植酸酶AS3.4322斜面菌种和菌剂及菌酶的制作：

(1)斜面菌种制作：

①斜面菌种培养基制作：

5°Be度麦芽汁30毫升，糖1克，碳酸钠0.1克，硫酸镁0.02克，氯化钾0.03，硫酸铁0.001克，磷酸氢二钾0.1克，蒸馏水加至100毫升，测PH值为5～6左右，加入琼脂2，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立，打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种。

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，培养基表面长出并布满黑色孢子为正常，如长有其它颜色为感染杂菌。

(2)二级菌剂培养

①培养基制作：

称豆饼粉15，麦麸55，蛋白粉或玉米粉29，糖0.5，K₂HPO₄0.1，碳酸钠0.3，硫酸镁0.05，氯化钾，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜(料水比为：1∶0.8左右)，调PH值为6-6.5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种。

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水到入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右。

③培养：

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，直到培养料表面长出并布满黑色孢子为成品，如长有其它颜色为杂菌。

(3)三级菌酶培养制作：

①培养基制作：

称豆饼粉15，麦麸55，蛋白粉或玉米粉29，糖0.5，K₂HPO₄0.1，碳酸钠0.3，硫酸镁0.05，氯化钾，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜(料水比为：1∶0.8左右)，调PH值为6-6.5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种。

接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％。

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％。

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为20-36小时左右，培养料表面长出并布满白色菌丝为成品，如长有其它颜色为感染杂菌。

6)光合细菌的培养：

(1)培养基配方为：

①氯化胺NH₄C1   0.3-1.5克

②碳酸氢钠         0.3-1.5克

③磷酸氢二钾       0.1-0.5克

④醋酸钠(乙酸钠)CH₃COONa 0.5-2.8克

⑤硫酸镁           0.1-0.4克

⑥氯化钠           0.5-2.5克

⑦生长因子         0.5-1.8克

⑧微量元素水溶液   5-15毫升

(2)制作工艺：将以上原料用40毫升蒸馏水溶解，加蒸馏水至1000毫升，加入生长因子1克，微量元素水溶液10毫升，用磷酸调ph值7左右，在加入10％的菌液摇晃均匀，放入透明度比较好的瓶内，用40瓦电灯进行对称照射，距离为10-20厘米，温度控制在28-30℃左右，经三天培养即可成功：

(3)生长因子配方：

①维生素B10.0005-0.002mg，②尼克丁酸0.05-0.25mg，③对氨基苯钾酸0.05-0.25mg，④生物素0.0005-0.002mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至10ml，过滤除菌备用；

(4)微量元素溶液配方：①氯化铁0.1-15mg，②硫酸铜0.01-0.15mg，③硼酸0.01-10mg，④硫酸锰0.01-0.1mg，⑤硫酸锌0.1-10mg，⑥硝酸钴0.1-1.5mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至1000ml，过滤除菌备用；

(5)培养好的光合细菌用麦芽根或麸皮或麦糠吸附后在40-50℃烘干、粉碎，作为饲料添加剂：

3.生物复合酶混合比例为：

蛋白酶∶植酸酶∶α淀粉酶∶果胶酶∶纤维素酶∶光合细菌比例为：3∶3∶1∶1∶1∶1

4.饲料添加剂配方(1000质量份)：

1)复合多维素(克)                     5----22

2)硫酸亚铁(克)                       0.5--10

3)硫酸锰(克)                         0.5--8

4)硫酸铜(克)                         4----12

5)硫酸锌(克)                         2----6

6)碘化钾(毫克)                       6----40

7)氯化钴(毫克)                       6----60

8)***钠(毫克)                     4----25

9)磷酸氢钙(克)                       50---200

10)腐植酸钠(克)                      5----30

11)硼酸(克)                          0.2---4

12)生物复合酶(克)                    400--600

13)氢质碳酸钙(克)                    50---200

14)钼(克)                            0.2--2

15)蛋氨酸(克)                        20----80

16)赖氨酸(克)                        40----120

17)氯化胆碱(克)                      40---180

18)贝壳粉(克)                        40---200

5.实施例

实例1.中猪饲料添加剂配方(1000质量份)饲料中按1％加入

(1)复合多维素(克)                    10

(2)硫酸亚铁(克)                      8

(3)硫酸锰(克)                        1

(4)硫酸铜(克)                        6

(5)硫酸锌(克)                        8

(6)碘化钾(毫克)                      20

(7)氯化钴(毫克)                      80

(8)***钠(毫克)                    25

(9)磷酸氢钙(克)                      300

(10)硼酸(克)                         1

(11)生物复合酶(克)                   500

(12)轻质碳酸钙(克)                   45

(13)钼(克)                           2

(14)赖氨酸(克)                       80

(15)贝壳粉(克)                       38.875

实例2.肉中鸡饲料添加剂配方(1000质量份)饲料中按1％加入

(1)复合多维素(克)                                      10

(2)硫酸亚铁(克)                                        12

(3)硫酸锰(克)                                          12

(4)硫酸铜(克)                                          2

(5)硫酸锌(克)                                          10

(6)碘化钾(毫克)                                        70

(7)***钠(毫克)                                      30

(8)碳酸氢钙(克)                                        120

(9)腐植酸钠(克)                                        1

(10)生物复合酶(克)                                     500

(11)钼(克)                                             2

(12)蛋氨酸(克)                                         120

(13)氯化胆碱(克)                                       120

(14)贝壳粉(克)                                         87.900

(15)氯化钠(克)                                         3

实例3.育肥牛饲料添加剂配方(1000质量份)饲料中按1％加入

(1)复合多维素(克)                                      2

(2)硫酸亚铁(克)                                        10

(3)硫酸锰(克)                                          3

(4)硫酸铜(克)                                          2.5

(5)硫酸锌(克)                                          6.5

(6)碘化钾(毫克)                                        50

(7)氯化钴(毫克)                                        100

(8)***钠(毫克)                                      50

(9)磷酸氢钙(克)                                        300

(10)生物复合酶(克)                                     500

(11)氢质碳酸钙(克)                                     175.800

光合细菌固体粉料可作为生物复合酶的原料与以上生物酶混合，添加到饲料中；用于水产养殖可直接用液体泼洒水面(3公斤/亩)，每10天泼洒一次：

6.操作工艺与步骤：

1)原料的预处理：

(1)硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌因含水分在加工中会有很大的困难，因此须先进行处理，主要以干燥处理为主，可采用强制干燥，在条件及设备较差的情况下，可用日光晾晒，粉碎过100目；

(2)碘化钾、氯化钴的预处理：

采用吸收剂平衡法，将碘化钾和氯化钴原料分别准确的称量，然后各以1∶15-1∶20的比例溶解于水中，再分别按照1∶100的比例喷在石粉等吸收剂上进行混合，而后进行干燥、粉碎过200目；

(3)***钠的预处理：

一般采用将含50％以上的***钠加入81℃的热水中，经过5min溶解后制成10kg水溶液(即1kg原料溶解于10kg水中然后再喷洒在搅拌机内的糠粉上，糠粉过200目以1∶100的比例喷在糠粉上，混合烘干后过200目)，混合均匀制成稀释剂，再与其它原料混合成为硒的预混合料；

2)载体和稀释剂的选择：

载体一般选择石粉、氢质碳酸钙、沸石粉、淀粉、麦麸、玉米粉等，以3-8％的比例逐级扩大；

3)原料的粒度：

微量元素一般要求通过80-400目，即粒度在0.17-0.05mm以下，铁、锌、锰、铜、镁等微量元素的粉碎粒度应全部通过80目(0.3mm)钴、碘、硒等级微量成分粉碎至200目(0.076mm)以下，为了达到很细的粒度，需要使用特别磨进行细磨，如碘、钾、硒用球磨机细磨才能达到所需求的粒度，氯化钴、铜、铁、锰、锌要使用微米极磨细至几个微米才能保证适宜的粒度，达到最佳的混合均匀度；

4)操作：

(1)一次扩大稀释：

①先将碘化钾、氯化钴、***钠用磷酸氢钙或碳酸氢钙为载体以3倍的比例扩大稀释，先加入1％载体量的油脂，混合5分钟然后加入以上微量元素，混合搅拌20分钟后取出，再进行二次稀释；

②将铁、锌、铜、锰等微量元素用磷酸氢钙或碳酸钙或玉米粉为载体以3倍的比例扩大稀释，先将载体加入混合机中，加入载体量1％的油脂，混合5分钟然后加入以上微量元素，混合20分钟后取出，再进行二次稀释；

③将其它生长剂、多维素等用碳酸钙或玉米粉为载体以3倍左右的比例混合稀释，先将载体加入混合机中，加入载体量1％的油脂，混合5分钟，然后加入生长剂等混合20分钟取出，再进行二次扩大稀释；

(2)二次扩大稀释：

将以上一次预混剂用麦麸、玉米面为载体以3倍左右的比例进行稀释扩大，复合酶也采取二次稀释扩大。

(3)三次扩大稀释与混合：

将全部二次混合的预混剂合并称重，载体以磷酸氢钙加入足量，然后加入1％的油脂，混合5分钟，然后将全部二次稀释剂加入混合剂搅拌混合20分钟，即为动物促长剂。

Claims (5)

1.一种微生物复合酶绿色饲料促长剂及其生产方法，包括菌种和菌剂以及酶制剂培养基的制作及培养发酵；菌种的复活、分离、纯化、诱变；有机肥的准备与制作；微量元素的准备与制作；复合肥的配方与工艺：

其中，微生物菌种为：

1)黑曲霉果胶酶AS3.316

2)康宁木霉纤维素酶AS3.2774

3)黑曲霉蛋白酶AS3.350

4)黑曲霉淀粉酶AS3.40

5)黑曲酶植酸酶AS3.4322

6)光合细菌

2.根据权利要求1所述的一种微生物复合酶绿色饲料促长剂及其生产方法，其特征在于动物复合促长剂的配方(1000质量份)为：

1)复合多维素(克)                         5----22

2)硫酸亚铁(克)                           0.5--10

3)硫酸锰(克)                             0.5--8

4)硫酸铜(克)                             4----12

5)硫酸锌(克)                             2----6

6)碘化钾(毫克)                           6----40

7)氯化钴(毫克)                           6----60

8)***钠(毫克)                         4----25

9)磷酸氢钙(克)                           50---200

10)腐植酸钠(克)                          5----30

11)硼酸(克)                              0.2--4

12)生物复合酶(克)                        400--600

13)氢质碳酸钙(克)                        50---200

14)钼(克)                                0.2---2

15)蛋氨酸(克)                            20----80

16)赖氨酸(克)                            40----120

17)氯化胆碱(克)                          40---180

18)贝壳粉(克)                            40---200

3.根据权利要求1所述的一种微生物复合酶绿色饲料促长剂及其生产方法，其特征在于生物复合酶菌种的复活、分离、纯化、诱变为：

1)按以上菌种的要求制作斜面和倒平板培养基；

2)培养基在1.5公斤/平方厘米灭菌30分钟；

3)取一支预诱变的斜面或安瓶管，在无菌操作下把菌种接入斜面试管进行多次培养复活、培养皿划线分离、再多次斜面试管培养，最后选取活性高、生长旺盛的菌种作为诱变菌株；

4)菌种的诱变

(1)菌悬液的制备

取以上任一种纯化好的斜面菌种一支，在无菌在无菌操作下用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入剩有玻璃珠的锥形瓶中，混合振荡10分钟，以打碎菌块，离心(3000/分钟)5-10分钟，弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤两次，加入10ml无菌生理盐水制成菌悬液，调整菌液浓度为10⁸；

(2)平板制作

将以上预诱变菌种的培养基和培养皿及其它所用器具全部灭菌，培养基取出后降温到60℃左右倒平板，凝固后待用；

(3)诱变处理

①诱变处理采用紫外线灯照射(15w灯管)

②预热：正式诱变照射前先开启紫外线灯10-20分钟；

③取制备好的菌悬液用移液器或移液管移入6厘米无菌培养皿中，加入微量的抗菌素链霉素使之和匀，放入无菌磁力棒并置磁力搅拌器上，开动磁力搅拌器，打开培养皿盖，打开红灯(关闭其它照明灯)，紫外线灯管30厘米照射(视菌钟不同)1-3分钟；

④稀释涂平板

在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5毫升，进行稀释，一般取10⁶-10⁹稀释度的菌液0.2毫升涂于平皿培养基上，每个稀释度涂3个培养皿，用无菌玻璃棒涂匀平板，注意，在每个培养皿背后要标明处理时间、稀释度、组号。28-30℃恒温下培养24-72小时(培养皿用黑布包上)。挑选生长旺盛、活性高的菌株接入试管斜面培养基中进行培养，如此反复诱变、分离、筛选，直至从试管或培养皿中筛选出无杂菌、活力强的有效菌种，然后接入斜面试管中作为生产菌种或做成真空冷冻干燥安瓶管常期保存。其余菌种按以上要求进行诱变，诱变时，要按照每个菌种的生长条件综合因素进行：

4.根据权利要求1所述的一种微生物复合酶绿色饲料促长剂及其生产方法，其特征在于生物复合酶的制作：

1)黑曲霉果胶酶AS3.316斜面和菌剂及菌酶的制作

(1)斜面一级菌种的制作：

5°Be度麦芽汁20毫升，糖1克，碳酸钠0.1克，硫酸镁0.02克，氯化钾0.03，硫酸铁0.001克，磷酸氢二钾0.1克，蒸馏水加至100毫升，调PH值为5-6左右，加入琼脂2，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种；

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上，塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，待培养基表面长出并布满黑褐色孢子为正常，其它颜色为感染杂菌则应淘汰。

(2)二级菌剂培养制作：

①培养基制作：

称豆饼粉15，麦麸55，果渣29，(NH₄)SO₄ 0.7，K₂HPO₄ 0.3，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，调PH值为5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水到入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右；

③培养：

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在25℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，直到培养基表面长出并布满黑色孢子为成品，如长有其它颜色为感染杂菌：

(3)三级菌酶培养制作：

①培养基制作：称豆饼粉15，麦麸55，果渣29，(NH₄)SO₄ 0.7，K₂HPO₄ 0.3，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，调PH值为5左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，凉至40℃左右时开始接种，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在25℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为20-36小时左右，直到培养料长出并布满白色菌丝为成品，如长出有其它颜色为杂菌：

2)康宁木霉纤维素酶AS3.2774斜面菌种和菌剂及菌酶的制作：

(1)斜面菌种培养制作：

①斜面培养基制作

马铃薯去皮去芽，称20克切细放入100ml水中，用微火煮开后15分钟即可用双层纱布过滤。取汁为100ml，如水分不足再加些开水补足。另外称葡萄糖2，琼脂2，纤维素0.5(纤维素为将草粉过100目)放置电炉上溶解。

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，待培养基表面长出并布满绿色孢子为正常，如长有其它颜色为感染杂菌：

(2)二级菌剂培养制作：

①培养基制作：

草粉50，麦麸39，玉米面10，尿素0.3，硫酸铵0.3，氯化钠0.4，PH值用磷酸调为5左右，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种；

②接种

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水倒入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右；

③培养

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在25℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，培养料表面长出并布满绿色孢子为成品，如长有其它颜色为感染杂菌：

(3)三级菌酶培养与制作：

①培养基制作：

草粉50，麦麸39，玉米面10，尿素0.3，硫酸铵0.3，氯化钠0.4，PH值用磷酸调为5左右，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，然后装入塑料袋或布袋内放置高压锅中1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种。接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为20-36小时左右，直到培养料长出并布满白色菌丝为成品，如长有其它颜色为感染杂菌：

3)黑曲霉蛋白酶AS3.350斜面菌种和菌剂及菌酶的制作：

(1)斜面菌种制作：

①斜面菌种培养基制作：

5°Be度麦芽汁30毫升，糖1克，碳酸钠0.1克，硫酸镁0.02克，氯化钾0.03，硫酸铁0.001克，磷酸氢二钾0.1克，蒸馏水加至100毫升，测PH值为5～6左右，加入琼脂2，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立，打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种；

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种；

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，培养基表面长出并布满黑色孢子为正常，如长有其它颜色为感染杂菌：

(2)二级菌剂培养

①培养基制作：

称豆饼粉15，麦麸55，蛋白粉29，(NH₄)SO₄ 0.7，K₂HPO₄ 0.3，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，测调PH值为5～6左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水到入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右；

③培养：

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，直到培养料表面长出并布满黑色孢子时为成品，如长有其它颜色为杂菌；

(3)三级菌酶培养制作：

①培养基制作：

称豆饼粉15，麦麸55，蛋白粉或玉米粉29，(NH₄)SO₄ 0.7，K₂HPO₄ 0.3，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，测调PH值为5～6左右，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％；

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为20-36小时左右，培养料表面长出并布满白色菌为合格，如长有其它颜色为感染杂菌；

4)黑曲霉淀粉酶AS3.40斜面菌种和菌剂及菌酶的制作：

(1)斜面菌种制作

①斜面培养基制作：

马铃薯去皮去芽，称20克切细放入100ml水中，用微火煮开后15分钟即可用双层纱布过滤。取汁为100ml，如水分不足再加些开水补足。另外称葡萄糖2，琼脂2，蒸馏水100ml，PH7.0，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种；

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上，划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种。

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，待培养基表面长出并布满黑色孢子时为正常，如有其它颜色为感染杂菌；

(2)二级菌剂培养制作：

①培养基制作：

培养基为：豆饼粉30，麸皮50，玉米粉15.淀粉4，NaCl 0.2，磷酸氢二钠0.8，PH值7.1-7.2；

(3)三级菌酶培养与制作：

培养基为：豆饼粉30，麸皮50，玉米粉15.淀粉4，Nacl 0.2，磷酸氢二钠0.8，PH值为7左右，常压灭菌1小时或1kg/cm2压力灭菌30分钟，降温至40℃按种子液0.5-1％，深层通风发酵或浅层发酵，室内温度为25℃左右，品温35-40℃左右，培养发酵24-40小时，在35-40℃下烘干，即为成品：

5)黑曲酶植酸酶AS3.40斜面菌种和菌剂及菌酶的制作：

(1)斜面菌种制作：

①斜面菌种培养基制作：

5°Be度麦芽汁30毫升，糖1克，碳酸钠0.1克，硫酸镁0.02克，氯化钾0.03，硫酸铁0.001克，磷酸氢二钾0.1克，蒸馏水加至100毫升，测PH值为5～6左右，加入琼脂2，放置电炉上溶解，待琼脂溶解后，分别装入试管，每管装量一般为管的四分之一处。装管后管口塞上棉塞，每10支一捆用防水纸包好，放入高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟。灭菌后，拔掉电源，待压力回到0时将放气阀和安全阀直立，打开灭菌锅，将培养基拿出摆成斜面，斜面长度为管的1/3处，等斜面凝固后开始接种；

②接种：

接种前，要将接种用具及接种室用紫外线灯灭菌20～30分钟。关掉灭菌灯后过5～10分钟左右在酒精灯下按无菌要求进行操作，操作步骤如下：

第一，用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，棉塞下部应露在手外，勿放桌上，以免污染；

第二，将试管口迅速在火焰上微烧一周，使试管口上可能沾染的少量杂菌或带菌尘埃得以烧死；

第三，将灼烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体。然后用环轻轻取菌少许，并将接种环慢慢从试管中抽出；

第四，在火旁迅速将接种环伸进另一空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部划起，划成较密的波浪线状，注意勿将培养基划破，也不要使菌体沾污管壁；

第五，灼烧试管口，并在火旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要将试管去迎棉塞，以免试管在移动时污染杂菌；

第六，接种完毕，接种环上的余菌必须彻底烧死后才能进行下一个试管接种：

③培养：

接种完毕将试管菌种包扎好放入恒温箱内培养。温度为28℃～32℃左右，培养时间为48-72小时左右，培养基表面长出并布满黑色孢子为正常，如长有其它颜色为感染杂菌：

(2)二级菌剂培养

①培养基制作：

称豆饼粉15，麦麸55，蛋白粉或玉米粉29，(NH₄)SO₄ 0.7，K₂HPO₄ 0.3，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，测调PH值为5～6左右，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种；

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，然后取出无菌盐水到入试管内半管，用大拇指堵住试管口摇晃几下，使菌液充分混合，倒入培养料中搅拌均匀。接种量为1支斜面菌种可接250克左右；

③培养：

把接好的二级菌种放入恒温箱培养28℃～32℃或室温在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为48小时左右，直到培养料表面长出并布满黑色孢子为成品，如长有其它颜色为杂菌；

(3)三级菌酶培养制作：

①培养基制作：

称豆饼粉15，麦麸55，蛋白粉或玉米粉29，(NH₄)SO₄ 0.7，K₂HPO₄ 0.3，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，测调PH值为5～6左右，加水至用手紧握指缝有水而不滴下来为宜，然后装入塑料袋或罐头瓶中放置高压锅1.05kg/cm²灭菌30分钟，在灭菌的同时，应取0.5％的盐水同时灭菌称无菌盐水，备用。灭菌完毕将物料取出，晾凉至40℃左右时开始接种；

接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％：

②接种：

首先将接种室及接种工具用紫外线灭菌20～30分钟，关掉灭菌灯5～10分钟后再进行操作。接种时先将手和接种工具用酒精消毒，把二级菌剂倒入培养料中搅拌均匀，接种量湿菌种为3％，干菌种为1.5％：

③培养：

把接好的三级菌剂放入恒温箱或发酵机或浅层在20℃～30℃之间的无菌室内培养，培养时间为20-36小时左右，培养料表面长出并布满白色菌丝为成品，如长有其它颜色为感染杂菌：

6)光合细菌的培养：

(1)培养基配方为：

①氯化胺NH₄Cl  0.8克

②碳酸氢钠        0.5克

③磷酸氢二钾      0.2克

④醋酸钠(乙酸钠)CH₃COONa 0.4克

⑤硫酸镁          0.1克

⑥氯化钠          0.5克

⑦生长因子        0.6毫升

⑧微量元素水溶液6毫升

(2)制作工艺：将以上原料用40毫升蒸馏水溶解，加蒸馏水至1000毫升，加入生长因子1克，微量元素水溶液10毫升，用磷酸调ph值7左右，在加入10％的菌液摇晃均匀，放入透明度比较好的瓶内，用40瓦电灯进行对称照射，距离为10-20厘米，温度控制在28-30℃左右，经三天培养即可成功：

(3)生长因子配方：

①维生素B₁ 0.00mg，②尼克丁酸0.1mg，③对氨基苯钾酸0.1mg，④生物素0.001mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至10ml，过滤除菌备用；

(4)微量元素溶液配方：①氯化铁0.12mg，②硫酸铜0.1mg，③硼酸0.1mg，④硫酸锰0.05mg，⑤硫酸锌0.4-mg，⑥硝酸钴0.8mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至1000ml，过滤除菌备用；

5.根据权利要求1所述的一种微生物复合酶绿色饲料促长剂及其生产方法，其特征在于操作工艺与步骤：

1)原料的预处理：

(1)硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌因含水分在加工中会有很大的困难，因此须先进行处理，主要以干燥处理为主，可采用强制干燥，在条件及设备较差的情况下，可用日光晾晒，粉碎过100目；

(2)碘化钾、氯化钴的预处理：

采用吸收剂平衡法，将碘化钾和氯化钴原料分别准确的称量，然后各以1∶15-1∶20的比例溶解于水中，再分别按照1∶100的比例喷在石粉等吸收剂上进行混合，而后进行干燥、粉碎过200目；

(3)***钠的预处理：

一般采用将含50％以上的***钠加入81℃的热水中，经过5min溶解后制成10kg水溶液(即1kg原料溶解于10kg水中然后再喷洒在搅拌机内的糠粉上，糠粉过200目以1∶100的比例喷在糠粉上，混合烘干后过200目)，混合均匀制成稀释剂，再与其它原料混合成为硒的预混合料：

2)载体和稀释剂的选择：

载体一般选择石粉、氢质碳酸钙、沸石粉、淀粉、麦麸、玉米粉等，以3-8％的比例逐级扩大；

3)原料的粒度：

微量元素一般要求通过80-400目，即粒度在0.17-0.05mm以下，铁、锌、锰、铜、镁等微量元素的粉碎粒度应全部通过80目(0.3mm)钴、碘、硒等级微量成分粉碎至200目(0.076mm)以下，为了达到很细的粒度，需要使用特别磨进行细磨，如碘、钾、硒用球磨机细磨才能达到所需求的粒度，氯化钴、铜、铁、锰、锌要使用微米极磨细至几个微米才能保证适宜的粒度，达到最佳的混合均匀度；

4)操作：

(1)一次扩大稀释：

①先将碘化钾、氯化钴、***钠用磷酸氢钙或碳酸氢钙为载体以3倍的比例扩大稀释，先加入1％载体量的油脂，混合5分钟然后加入以上微量元素，混合搅拌20分钟后取出，再进行二次稀释；

②将铁、锌、铜、锰等微量元素用磷酸氢钙或碳酸钙或玉米粉为载体以3倍的比例扩大稀释，先将载体加入混合机中，加入载体量1％的油脂，混合5分钟然后加入以上微量元素，混合20分钟后取出，再进行二次稀释；

③将其它生长剂、多维素等用碳酸钙或玉米粉为载体以3倍左右的比例混合稀释，先将载体加入混合机中，加入载体量1％的油脂，混合5分钟，然后加入生长剂等混合20分钟取出，再进行二次扩大稀释：

(2)二次扩大稀释：

将以上一次预混剂用麦麸、玉米面为载体以3倍左右的比例进行稀释扩大，复合酶也采取二次稀释扩大：

(3)三次扩大稀释与混合：

将全部二次混合的预混剂合并称重，载体以磷酸氢钙加入足量，然后加入1％的油脂，混合5分钟，然后将全部二次稀释剂加入混合剂搅拌混合20分钟，即为动物促长剂。