CN103906847A - 用树木为原料制造乙醇的方法、以及由此得到的乙醇溶液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使发酵困难的树木发酵，从而生成燃料用乙醇或可用作粮食的乙醇的方法，该方法的特征在于具有以下步骤：在目标树木中施用母细胞溶解酶群，由此将所述树木分解为粉末状从而得到树木分解物的步骤，其中所述母细胞溶解酶群是在伴随着作为MRE共生菌群的产孢子好氧细菌的孢子形成的细胞溶解中生成的；对所述树木分解物灭菌的步骤；对灭菌后的所述树木分解物施用曲霉菌从而进行一次发酵的步骤；向通过所述一次发酵而得到的发酵液中添加酵母菌从而进行二次发酵的步骤；以及对通过所述二次发酵而得到的发酵液进行过滤的步骤，所述母细胞溶解酶群是通过以下方式获得的：培养作为所述MRE共生菌群的产孢子好氧细菌并将所得到的培养液置于饥饿状态，由此使该细菌内生孢子化，并从该培养液中除去含有该内生孢子化细菌的杂质。

Description

用树木为原料制造乙醇的方法、以及由此得到的乙醇溶液
技术领域
本发明涉及由树木制造乙醇的方法以及通过该方法得到的乙醇溶液。具体而言，本发明涉及通过使原本发酵困难的树木发酵来制造乙醇的方法。
背景技术
现在，在地球变暖和原油枯竭问题等的背景下，世界范围内正进行以低碳社会为目标的努力。其中，利用生物质的能源生产方法受到关注，特别是生物乙醇作为代替汽油的能源而备受关注。但是，生物乙醇的制造中使用了用作粮食的淀粉类?糖类作为原料，因此在将它们转用于生物乙醇的生产时，从谷物价格高涨和粮食危机的观点等来看被认为是有局限性的。
因此，人们研究了以不与粮食相冲突的木质类生物质为原料、通过对纤维素进行化学处理和微生物的酶利用等来生产乙醇的方法。但是，即使在使用了这种木质类生物质的燃料用乙醇的生产中，作为主要的障碍依然存在生产成本的问题，现阶段的现状是作为燃料用乙醇使用是困难的。
另一方面，使用木质类生物质以有助于粮食供应的研究也在进行中。例如，在专利文献1中，使竹笋皮或幼竹发酵以生产肥料，另外在专利文献2中生产了含有茶氨酸等成分的健康食品成分。但是，专利文献1只生产了肥料，不能制造粮食。此外，专利文献2中由于使用了厌氧菌，不适合用于饮料和调味料。
另外，专利文献3中提出了一种竹醋的制造方法，该竹醋作为健康食品的竹醋，不含在传统竹炭制造中附随的、从烟当中蒸馏得到的竹醋中所含的苯并芘等致癌物质或对人体有害的物质。但是，在低温减压下的蒸馏会花费5天至15天这样长的时间，另外杂质也多。此外，专利文献4中提出使用曲霉菌进行乙醇发酵的方法，但专利文献4中的原材料是谷物，为了制作具有抗菌物质的竹子等树木的发酵物，不能直接应用该技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-131487
专利文献2：日本特开2006-180832
专利文献3：日本特开2004-141141
专利文献4：日本专利第4113252号
发明内容
发明要解决的问题
本发明鉴于这样的状况而进行，目的在于使由于含有特定的抗菌物质因而发酵困难的树木发酵，从而生成燃料用乙醇和可用作粮食的乙醇。此外，本发明的目的还在于，不进行任何的使用硫酸等化学品的化学处理，而是使用自然界中原本存在的菌来酿造饮料用乙醇，从而提供不会对人体产生有害影响、安全的乙醇饮料以及含有乙醇的粮食。
此外，本发明的目的还在于，不进行化学品处理和菌的基因重组，而将乙醇发酵后产生的发酵残渣和发酵后的液体等用作家畜的饲料和植物用肥料，由此有效地利用在传统的乙醇发酵饮料制造中需要进行不可缺少的废弃物处理的残渣。
解决问题的手段
本发明基于以下发现而完成：在不供给来自谷物和糠等的糖类的情况下，曲霉菌或酵母菌可以仅通过树木自身的纤维素和糖类直接由树木的分解物进行乙醇发酵。本发明人发现，由于含特定抗菌物质且几乎没有营养，因此曲霉菌和酵母菌的生存?繁殖是困难的，结果，对于利用该曲霉菌和酵母菌发酵困难的树木而言，通过施用本发明所述的母细胞溶解酶群，使得以该树木为原料利用曲霉菌或酵母菌的发酵成为可能。
因此，根据本发明的第一主要观点，提供了一种由树木制造乙醇的方法，其特征在于，具有以下步骤：施用步骤，其为在目标树木中施用母细胞溶解酶群的步骤，由此将所述树木分解为粉末状从而得到树木分解物，其中所述母细胞溶解酶群是在伴随着产孢子好氧细菌的孢子形成的细胞溶解中生成的；对所述树木分解物灭菌的步骤；对灭菌后的所述树木分解物施用曲霉菌从而进行一次发酵的步骤；向通过所述一次发酵而得到的发酵液中添加酵母菌从而进行二次发酵的步骤；以及对通过所述二次发酵而得到的发酵液进行过滤的步骤，所述母细胞溶解酶群是通过以下方式获得的：培养所述产孢子好氧细菌并将所得到的培养液置于饥饿状态，由此使该细菌内生孢子化，进一步从该培养液中除去含有该内生孢子化细菌的杂质，其中所述产孢子好氧细菌为MRE共生菌群。
根据这样的构成，可以提供这样一种方法：在不供给谷物和糠等的糖类的情况下，通过曲霉菌和酵母菌，仅利用树木自身的纤维素和糖类直接由树木的分解物进行乙醇发酵。另外，根据本发明，由于只对成为乙醇原料的树木分解物进行灭菌，因此生成的乙醇保持了树木本来的成分，另外能够提供还保持了树木香味的乙醇。
此外，根据本发明的一个实施方案，在这样的方法中，所述树木选自竹子、杉木、柏木。
此外，根据本发明的另一个实施方案，在这样的方法中，所述曲霉菌选自甘酒曲霉菌（Aspergillus amazake）、米曲霉菌（Aspergillusorgzae）(NBRC30104)、米曲霉菌（Aspergillus orgzae）(NBRC30113)、放线曲霉菌（Aspergillus cellulosae）(NBRC4040)、放线曲霉菌（Aspergillus cellulosae）(IFO4297)、宇佐美曲霉菌（Aspergillususami）(NBRC4033)、泡盛曲霉菌（Aspergillus awamori）(NBRC4388)。
此外，根据本发明的又一个实施方案，在这样的方法中，所述酵母菌选自面包酵母、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC0244)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC0249)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC0282)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC2373)、酿酒酵母（Saccharomycescelevisiae）(NBRC2377)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(IFO1728)。
此外，根据本发明的又另一个实施方案，在这样的方法中，将所述树木浸渍在分解溶液中，并通过对该溶液进行曝气使所述树木分解，其中所述分解溶液含有所述母细胞溶解酶群和/或通过所述产孢子好氧细菌的孢子形成而生成的孢子。
根据本发明的第二主要观点，提供了含有由上述方法得到的乙醇溶液的烧酒。
此外，根据本发明的第三主要观点，提供了一种发酵残渣，其为在通过上述方法得到的乙醇溶液的制造过程中得到的发酵残渣，其特征在于，该发酵残渣是通过对由所述二次发酵得到的发酵液进行过滤而得到的。
根据本发明的一个实施方案，在这样的发酵残渣中，所述发酵残渣被用作农业用堆肥或家畜饲料。
需要说明的是，通过参考下面的发明实施方案部分和附图，上述以外的本发明的特征和显著的作用、效果对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图简要说明
[图1]图1是本发明的一个实施方案中乙醇发酵的流程图。
[图2]图2是本发明的一个实施方案中糖化后的乙醇发酵的流程图。
[图3]图3是本发明的一个实施方案中菌丝伸长试验的流程图。
[图4]图4是本发明的一个实施方案中，用于研究乙醇发酵条件的流程图。
[图5]图5是本发明的一个实施方案中，用于研究不同酵母的乙醇发酵能力的流程图。
[图6]图6是本发明的一个实施方案中，利用了经MRE处理的竹子的分段酿造（段仕込み）流程图。
[图7]图7是本发明的一个实施方案中，向经MRE处理的竹子中均匀混合米曲（米糀）的分段酿造流程图。
[图8]图8是本发明的一个实施方案中，边逐步减少经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造流程图。
[图9]图9是本发明的一个实施方案中，边逐步增加经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造流程图。
[图10]图10是本发明的一个实施方案中，经MRE处理的竹子的大容量发酵实验的流程图。
[图11]图11是本发明的一个实施方案中，不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验中第10天的照片。
[图12]图12是本发明的一个实施方案中，加水率不同的菌丝伸长试验中第10天的照片。
[图13]图13是示出本发明的一个实施方案中，第1次的不同酵母乙醇发酵能力结果的图表。
[图14]图14是示出本发明的一个实施方案中，葡萄糖浓度的图表。
[图15]图15是示出本发明的一个实施方案中，第2次的不同酵母乙醇发酵能力结果的图表。
[图16]图16是示出本发明的一个实施方案中，葡萄糖浓度的图表。
[图17]图17是示出本发明的一个实施方案中，根据本发明所述方法进行乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度的图表。
[图18]图18是示出本发明的一个实施方案中，根据本发明所述方法进行乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度的图表。
[图19]图19是示出本发明的一个实施方案中，根据本发明所述方法进行乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度的图表。
[图20]图20是示出本发明的一个实施方案中，根据本发明所述方法进行乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度的图表。
[图21]图21是示出本发明的一个实施方案中，根据本发明所述方法得到的乙醇的馏分乙醇浓度的图表。
[图22]图22是示出本发明的一个实施方案中，根据本发明所述方法以大容量进行乙醇发酵的结果的乙醇浓度和葡萄糖浓度的图表。
[图23]图23是本发明的一个实施方案中，使用经MRE处理的杉木·柏木进行乙醇发酵的流程图。
[图24]图24是本发明的一个实施方案中，用于研究不同酵母的乙醇发酵能力的流程图。
[图25]图25是本发明的一个实施方案中，经MRE处理的杉木·柏木的分段酿造乙醇发酵的流程图。
[图26]图26是本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的杉木的不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验中第10天的照片。
[图27]图27是本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的柏木的不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验中第10天的照片。
[图28]图28是示出本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的杉木的不同酵母乙醇发酵能力的图表。
[图29]图29是示出本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的杉木情况下的葡萄糖浓度的图表。
[图30]图30是示出本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的柏木的不同酵母乙醇发酵能力的图表。
[图31]图31是示出本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的杉木情况下的葡萄糖浓度的图表。
[图32]图32是示出本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的杉木情况下的分段酿造时的乙醇浓度和葡萄糖浓度的图表。
[图33]图33是示出本发明的一个实施方案中，使用了经MRE处理的柏木情况下的分段酿造时的乙醇浓度和葡萄糖浓度的图表。
具体实施方式
如上所述，根据本发明，提供了一种生成乙醇的方法，其中，利用母细胞溶解酶群将树木分解，以该树木为原料，使用特定的曲霉菌进行发酵，从而制作出含有乙醇和美味成分等的一次发酵液，进一步使用特定的酵母菌进行提高乙醇浓度的二次发酵，其中所述母细胞溶解酶群是在伴随着形成内生孢子（孢子）的好氧细菌的孢子化的母细胞细胞溶解时释放出来的。并且，该好氧细菌只要能形成内生孢子即可，没有特别的限制，优选为MRE共生菌群。另外，在本发明所述的方法中使用的好氧细菌可以是由一种或一种以上的好氧细菌构成的混合菌群。
传统上，不使竹子等树木发酵以提供给饮料和食品。这是因为2,6-二甲氧基-1,4-苯醌、对苯醌、单宁等抗菌物质抑制曲霉菌等的活动，使得利用曲霉菌和酵母菌等的发酵难以持续。此外，在使用了树木等木质类生物质的乙醇制造中，需要从纤维素·半纤维素得到葡萄糖的过程，但是，为了从纤维素·半纤维素回收糖，需要进行前处理，该前处理也存在成本和劳力时间的问题。本发明基于这样的发现而完成：在没有谷物和糠等的糖类供给的情况下，曲霉菌或酵母菌可以仅通过纤维素或树木的糖类直接由树木分解物进行乙醇发酵。
利用MRE共生菌群的树木分解物的生成通过以下方式进行：利用伴随着MRE共生菌群孢子化的母细胞溶解酶将树木批量分解，将所得物通过筛网筛分分离，将该结果得到的粉末状分解物用作树木发酵的原料。通过这样做，一方面抑制了树木所具有的抗菌能力，另一方面保持了树木当中具有的香味等，同时发酵变得容易。
然后，往该发酵原料中加水，用高压灭菌器或蒸汽机加热灭菌后，投入曲霉菌，在25℃下进行一次发酵4天，从所得发酵液中除去固体。向除去了该固体后的发酵液中进一步加入酵母菌，在15℃下进行二次发酵1天。用过滤器过滤二次发酵所得到的发酵液，得到最终发酵液。通过这样做，可以得到几乎不含异丙醇的树木发酵液。该发酵液保持了作为原料的树木的香味和若干抗菌成分。
需要说明的是，在使用（例如）竹子作为树木的情况下制造竹醋时，如果就这样持续发酵进行过度发酵的话，能够生成不含有害成分的竹醋。此外，竹子烧酒是通过在80℃～90℃的范围内进行蒸馏、并将2次发酵原液混入所得的蒸馏液中而制造的。此外，通过2次发酵得到的该树木的发酵液中含有鲜味成分谷氨酸和天冬氨酸，因此也可以用作树木风味的调味料。
进一步详细说明，在第一阶段中，将精细粉碎为1cm～5mm左右的树木用使用了MRE的干式分解装置来分解。该分解装置利用了母细胞溶解酶群的溶酶体同源降解酶，其中所述母细胞溶解酶群是在MRE共生菌群的内生孢子形成过程中生成的。
这里，上述MRE共生菌群由芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(FERMBP-11209、识别号MK-005)、梭形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)(FERM BP-11206、识别号MK-001)、枯草芽孢杆菌(Bacillussonorensis)（识别号MK-004）、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillussp.)(FERM BP-11207、识别号MK-002)、以及丛毛单胞菌属(Comamonas sp.)(FERM BP-11208、识别号MK-003)构成，均为好氧细菌类。
在本发明的方法中，通过用0.2μm的膜和0.02μm的过滤器对所形成的内生孢子沉淀后的溶液进行过滤，除去了残存的极微量的培养细胞和残存浮游的内生孢子（孢子），并将通过对该溶液进行通气（曝气）而得到的溶液适用于树木。并且，本发明人发现，将由于分解困难这样的理由因而传统上不能用作乙醇原料的树木作为原料，能够有效地生成乙醇，从而完成了本发明。
进一步详细说明，将作为上述形成内生孢子的好氧细菌的集合的MRE共生菌群（MK-001、MK-002、MK003、MK-004和MK-005）的培养液1m3装入同样形状的2个1.2m3的曝气培养容器中，对其进行通气（曝气）使得溶解氧浓度为0.5mg/L至1.2mg/L。将其中一个命名为细胞培养槽，另一个命名为孢子化槽。向细胞培养槽中加入鱼粉500g、米糠500g、油渣250g、肉汁50g作为最低限度的营养物质，在培养pH为6.0-6.8以及培养温度为25℃-35℃的培养条件下通气并继续进行培养。另一方面，当在孢子化槽中断绝一切营养以置于饥饿状态下，并且在25℃-35℃的条件下进行连续通气时，以氮成分的枯竭为诱因开始内生孢子化。等培养液的透明度增加时停止通气（供氧），这时内生孢子一起开始沉淀，成为透明的溶液。将该溶液用0.2μm的膜过滤，再用0.02μm的过滤器进行过滤，将所得滤液再次装入仔细洗净的孢子化槽中，这样就做好了树木分解的准备。这里，将使用过滤器从MRE菌孢子化的溶液中除去了残存母细胞和孢子之后所得到的溶液称为MRE滤液。因此，可以说处于MRE溶液中几乎不存在菌和孢子的状态，而该MRE溶液中存在母细胞溶解酶群。本发明利用了该母细胞溶解酶群的分解能力。需要说明的是，在本说明书中，使用了“MRE溶液”、“孢子化后的溶液”、“孢子化后的菌不存在的溶液”等表达方式，但是，除了特别提及，否则都是指含有本发明所述的母细胞溶解酶群的溶液。
在本申请发明中，对适用于上述溶液的膜和过滤器的大小没有特别限定。例如，所述膜可以为1μm、0.7μm、0.5μm、0.3μm，优选为0.2μm。另外，过滤器可以为0.15μm、0.1μm、0.07μm、0.05μm、0.03μm，优选为0.02μm。
另外，在本申请发明中，使用上述细胞培养槽和孢子化槽2者，对其进行通气（曝气）使得两者中的溶解氧浓度都变为0.5mg/L至1.2mg/L，同时进行以下实验。
该MRE溶液通过在60℃～80℃的温度范围内使用而发挥威力。特别是，在通常氧气流入的环境中喷洒含有母细胞溶解酶群的溶液，边用散热器搅拌加热使得温度为80℃以下边将对象树木分解是优选的，该溶液可以同时含有母细胞溶解酶群和孢子（孢子）。将根据该原理运行的装置称为利用了MRE的干式分解装置，可以将通常无法分解的树木在80℃以下的低温下分解，并能够成为乙醇发酵的原料。
在本申请的发明中，可以使用上述干式分解装置来分解处理成为问题的竹子、柏木、杉木等树木、疏伐材、稻草等，从而制成用于乙醇生产的原料。
另外，在本发明中，分解树木时所使用的上述MRE溶液可以是原液也可以是稀释液，优选为1～100倍稀释，更优选为1～50倍稀释，进一步优选为1～25倍稀释，更进一步优选为1～10倍稀释，最优选为稀释3～6倍后使用。
在本申请的发明中，使用上述干式分解装置处理粉碎后的树木，经过约36～48小时后，得到含水率为3.8%～6%的干燥状态的微细粉末状残留物。将该残留物通过特定的筛网筛分，可以得到经MRE处理的树木粉末。该经MRE处理的树木粉末由于处于超干燥状态因而具有不容易吸湿且即使长时间放置也不会腐败的性质。
此外，在本申请发明所述的一个实施方案中，上述分解装置可以被分为分解槽和完成槽（仕上槽），可以首先通过分解槽进行前处理，接着转移到完成槽中完成分解。此时，优选的是，在分解槽中于60～80℃、优选在70℃下进行36～48小时前处理，接着向通过分解槽所得到的原料中加水，在完成槽中于60～80℃、优选在70℃下进行24小时的处理。
此外，在本申请发明所述的一个实施方案中，将成为发酵原料的树木浸渍在溶液中，并且可以边对该溶液进行通气边进行分解，其中所述溶液含有本申请发明所述的母细胞溶解酶群和/或通过上述产孢子好氧细菌的孢子形成而生成的孢子（孢子）。
在本申请的发明中，对适用于上述残留物的筛网的大小没有特别的限制。例如，可以是5～8mm筛目或者2～5mm筛目，优选为1mm筛目。此外，残留在筛网上的残渣可以在上述分解槽中再处理。
需要说明的是，在对本申请发明的一个实施方案所述的经MRE处理的树木粉末（竹粉末）进行分析时，纤维素为43.1%、半纤维素为12.6%、木质素为25.2%。剩余的19.1%是碳水化合物、蛋白质和脂质。
此外，在本申请发明的一个实施方案中，作为一次发酵中使用的曲霉菌，可以使用甘酒曲霉菌（Aspergillus amazake）、米曲霉菌（Aspergillus orgzae）(NBRC30104)、米曲霉菌（Aspergillus orgzae）(NBRC30113)、放线曲霉菌（Aspergillus cellulosae）(NBRC4040)、放线曲霉菌（Aspergillus cellulosae）(IFO4297)、宇佐美曲霉菌（Aspergillus usami）(NBRC4033)、泡盛曲霉菌（Aspergillus awamori）(NBRC4388)，但是只要能够糖化树木粉末即可，不局限于这些，也可以使用米曲。
此外，在本申请发明的一个实施方案中，作为二次发酵中使用的曲霉菌，可以使用面包酵母、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC0244)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC0249)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC0282)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(NBRC2373)、酿酒酵母（Saccharomycescelevisiae）(NBRC2377)、酿酒酵母（Saccharomyces celevisiae）(IFO1728)，但是只要是可以进行通常的乙醇发酵的酵母菌即可，不限于这些。
此外，在本申请发明的一个实施方案中，可以按以下的步骤进行从树木粉末的乙醇发酵。首先，向经MRE处理的树木粉末中以10倍重量的比率加入水，用高压灭菌器在120℃下进行15分钟灭菌。加入甘酒曲霉菌或黑曲Aspergillus orgzae NBRC4388菌等曲霉菌，在25℃下进行一次发酵4天。然后，从该一次发酵的生成物中除去固体，向其中加入酵母菌，在15℃下进行二次发酵1天。对二次发酵的生成液进行0.45μm的过滤后进一步进行0.2μm的过滤，可以得到乙醇浓度为0.29%以上的二次发酵生成液。需要说明的是，在本发明中，用于从树木粉末生成乙醇的步骤不限于上述步骤，发酵条件（温度、时间等）可以根据所使用的曲霉菌和酵母菌的种类来采用适合的最佳的条件，也可以采用传统的乙醇发酵和烧酒制造中的步骤。
此外，在本申请发明的一个实施方案中，当用气相色谱对本发明的二次发酵生成液进行分析时，可知是不优选作为饮料的异丙醇极少的、以乙醇为成分的酒精。此外，本发明的二次发酵生成液含有游离谷氨酸和游离天冬氨酸这样的与海藻的海带相同的鲜味成分。因此，当将本发明的二次发酵生成液作为调味料使用时，可以提供含有微量的乙醇、游离谷氨酸和游离天冬氨酸的树木风味的调味料。
当进一步持续该二次发酵以进行过度发酵时，乙醇变为100%醋酸。通过该过度发酵，可以得到含有游离谷氨酸和游离天冬氨酸这样的鲜味成分的树木风味的醋酸。也可以通过添加该树木醋酸蒸馏后的醋酸来制造任意醋酸浓度的食醋。
此外，在本申请发明的一个实施方案中，通过在79℃～90℃下对本发明的二次发酵生成液连续蒸馏以提取乙醇、并进一步加入2%以内范围的二次发酵生成液调整乙醇浓度为20%～40%，由此可以制成具有树木风味的烧酒。此外，在本申请发明的一个实施方案中，对在得到烧酒的连续蒸馏中所得到的残液进一步加热浓缩，使得谷氨酸和天冬氨酸等鲜味成分的浓度上升，由此也可以得到来自树木成分的调味料。
此外，在本申请的发明中，作为成为乙醇发酵原料的树木，可以使用竹子、柏木、杉木等，但是，只要是由于含有抗菌物质而在传统方法中难以发酵的树木即可，没有特别的限制。
在本申请发明的一个实施方案中，也可以将除去了发酵后的乙醇的发酵残渣用作农业用的堆肥。传统上，烧酒等发酵过程的残渣的处理从环保的观点来看是困难的，另外还存在处理成本高的问题。在本发明中，也可以将所得发酵残渣直接用作农业用的良好的堆肥和动物饲料。
以下参考附图对本发明所述的一个实施方案和实施例进行说明。
实施例
(实施例1)
MRE溶液的制造
MRE共生菌群的培养采用好氧性革兰氏阳性菌的一般培养方法来进行培养。将1000升水装入1.2立方米的曝气培养槽中，进行通气（曝气）。向该曝气培养槽中加入鱼粉3kg、米糠3kg、油渣1.6kg、肉汁350g作为营养物质，然后加入适量硫酸镁和二氧化硅等矿物质。进一步加入菌体，在培养pH为6.0至6.8以及培养温度为25℃至35℃的培养条件下，边施加通气（曝气）使溶解氧浓度达到0.5mg/L至1.2mg/L，边对MRE共生菌群进行培养。
等菌充分繁殖并稳定后，断绝MRE共生菌群的一切营养以置于饥饿状态下，进一步在15℃至35℃的条件下继续进行通气时，以氮成分的枯竭为诱因开始MRE共生菌群的内生孢子化。等培养液的透明度迅速增加时停止通气（供氧），内生孢子一起开始沉淀，得到透明的上清液。
再将这样得到的上清液用0.2μm的膜进行加压过滤，得到MRE溶液。另外，利用相差显微镜确认孢子化完成之后，可以停止通气。
(实施例2)
经MRE处理的竹子的制作方法
本实施例中使用的竹子是用MRE溶液处理过的，按照以下的步骤1～5进行处理。
1.使用地板材料中筛分残余物60L的竹子
2.将用于地板材料的粉碎竹子40L、MRE溶液投入到分解槽中，在70℃下进行分解处理36小时
3.36小时后，从分解槽中取出原料，称量体积、重量
4.往分解槽取出物中加水20L，投入到完成槽中
5.在完成槽中于70℃下处理24小时（水分8%以下），用1mm筛目的筛网筛分。将残留在筛网上的残余物按照步骤2再次投入
该流程如下所示。
Figure BDA0000421286520000131
经MRE处理的竹子的制作方法
(实施例3)
用面包酵母进行乙醇发酵的可能性试验
实验材料如下所述。
·MRE酶处理的竹子粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·粉碎的生竹子(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·甘酒酒曲(Aspergillus amazake)
·干酵母(日清食品株式会社制，日清Super Camelia)
(1)使用酵母的发酵方法
生竹子和经MRE处理的竹子各取125g，加入250g水(矿泉水)并充分搅拌。然后在高压灭菌器(121℃，15分钟)中进行加热处理，冷却至室温，加入干酵母5g、矿泉水灭菌后的酿造水(以后称为酿造水)400mL充分混合后，在15℃下乙醇发酵3天。发酵结束后，用棉制的布绞，进行单向蒸馏，测定乙醇浓度。图1A中示出了生竹子的乙醇发酵流程，图1B中示出了经MRE处理的竹子的乙醇发酵流程。
(2)使用甘酒曲霉菌的糖化·发酵方法
向250g经MRE处理的竹子中加入250mL矿泉水并充分搅拌。然后在高压灭菌器(121℃，15分钟)中进行加热处理，冷却至室温，作为1次发酵，加入甘酒酒曲，在25℃下静置7天。接下来，作为2次发酵，加入干酵母2g、灭菌水(矿泉水)700mL并充分混合后，在15℃下乙醇发酵3天。发酵结束后，用棉制的布绞，进行单向蒸馏后，测定乙醇浓度。图2中示出了实验方法的流程。
(实施例4)
1次发酵用曲霉菌的培养实验和乙醇发酵的条件研究
实验材料和使用的菌株如下。
·经MRE酶处理的竹子粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
[表1]
表1使用的菌株
Figure BDA0000421286520000141
(1)不同曲霉菌的菌丝伸长试验
向经MRE处理的竹子中加入矿泉水，将加水80%的所得物以每份20g等分到盘子中。然后在高压灭菌器(121℃，15分钟)中进行加热处理，冷却后，接种3种白曲(甘酒曲霉菌、米曲霉菌NBRC30104、NBRC30113)、2种黄曲(放线曲霉菌NBRC4040、IFO4297)、2种黑曲(宇佐美曲霉菌NBRC4033、泡盛曲霉菌NBRC4388)共计7株菌株，在25℃下生长10天，检查菌丝的伸长。
(2)不同加水率的菌丝伸长试验
使用在不同曲霉菌的菌丝伸长试验中得到良好结果的曲霉菌，进行不同加水率的菌丝伸长试验。向经MRE处理的竹子中加入矿泉水，将加水分别为60%、80%和100%的所得物以每份20g等分到盘子中。然后在高压灭菌器(121℃，15分钟)中进行加热处理并冷却后，接种曲霉菌，在25℃下生长10天，检查菌丝的伸长。图3A示出了不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验流程，图3B示出了不同加水率的菌丝伸长试验流程。
(实施例5)
乙醇发酵的条件研究
实验材料如下所述。
·经MRE酶处理的竹子粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·甘酒酒曲(Aspergillus amazake)
·干酵母(日清食品株式会社制，日清Super Camelia)
气相色谱（GC）的测量条件
乙醇浓度测定使用GL Sciences公司制的气相色谱仪。测量条件如下表所示。
[表2]
表2GC测定条件
Figure BDA0000421286520000151
乙醇发酵条件研究方法
向MRE竹粉末100g中加入矿泉水100mL并充分搅拌。然后在高压灭菌器(121℃，15分钟)中处理，冷却后，加入甘酒酒曲并充分搅拌，在25℃下发酵7天(1次发酵)。然后加入900mL酿造水并充分混合，静置1天。然后，仅取出液体300mL置于500mL容量的烧杯中，分别分为仅有液体以及竹子固体+液体(对照)，使它们2次发酵。2次发酵的条件为：加入干酵母5g，充分搅拌，在15℃下发酵5天，隔天搅拌。图4中示出了实验方法的流程。
(实施例6)
适用于乙醇发酵的酵母的研究
实验材料和所使用的酵母如下所述。
·经MRE酶处理的竹子粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·使用的菌株；
1次发酵用菌株：甘酒曲霉菌(池屋酿造合名株式会社从甘酒酒曲中分离)
使用的酵母：乙醇发酵能力研究用酵母7种
[表3]
表3乙醇发酵能力研究用酵母7种
Figure BDA0000421286520000161
使用的培养基
使用的培养基(PD液体培养基)的组成如下。
马铃薯淀粉  4.0g/L
葡萄糖      20.0g/L
将上述培养基组成用于酵母的液体培养。另外，琼脂培养基为在上述培养基组成中加入琼脂使其为1.5%而使用。
使用的试剂盒
使用了和光纯药工业株式会社制造的葡萄糖测量用试剂盒GlucoseCII-TestWako。操作方法根据所用试剂盒的操作步骤进行。需要说明的是，关于葡萄糖浓度的计算，根据下式算出。
葡萄糖浓度(g/L)=吸光度(Es)/0.0001×0.001
气相色谱（GC）的测量条件
测量条件如下表所示。
[表4]
表4GC测定条件
Figure BDA0000421286520000171
高效液相色谱(HPLC)的测量条件
使用了Agilent Technologies株式会社制的HPLC的葡萄糖浓度的测量条件如下所示。
HPLC测量条件
色谱柱:TSK-GEL AMIDE-80HR、
TSKgel G2500PWXL、
TSKguardcolumn PWXL
柱温:40℃
洗脱液:H2O
流速:0.5mL/min
检测器:RI35℃
不分流:20μL
实验方法
图5中示出了实验方法的流程。
向MRE处理的竹子200g中加入矿泉水200g，充分混合后，在高压灭菌器中于121℃下处理15分钟。冷却至室温后，添加约0.1g甘酒曲霉菌作为种曲，充分混合后，在25℃下静置发酵7天，将其作为1次发酵。向该1次发酵后的所得物中加入1800mL灭菌水(矿泉水)，充分混合后，静置24小时。24小时后，将发酵液的上清液分到300mL容量的高型烧杯中，每个烧杯100mL。
在装有上述PD液体培养基10mL的18φ试管中，在每个试管中都接种一白金环的表3所示酵母，在30℃、100cpm下培养24小时。将所得物作为前培养液，将1%前培养液分别接种在500mL容积的迈尔烧瓶(工作容积200mL PD介质)中，在30℃、100cpm下培养24小时，将所得物作为主培养液。24小时后，用小型冷却离心机(TOMY公司制)在4℃下以8krpm的速度离心分离200ml主培养液10分钟，得到培养酵母。将该培养酵母全部悬浮在3mL灭菌水中后，加入到1次发酵液中，开始2次发酵。2次发酵在15℃、静置条件下进行3天发酵，每24小时轻轻地进行搅拌。2次发酵中每24小时用GC(GL Sciences公司制)进行乙醇浓度的测定，0时间和3天后用HPLC(Tosoh株式会社制)进行葡萄糖浓度的测定。需要说明的是，将在1次发酵液中未添加酵母的所得物作为对照进行比较。
根据图5中所示的流程图，重复2次实验。需要说明的是，第二次中使用的酵母如下表所示。
[表5]
表5第2次的乙醇发酵能力研究用酵母4种
Figure BDA0000421286520000181
第二次研究的时候，乙醇浓度的测定与第一次相同，在葡萄糖浓度的测定中，每24小时的测定使用上述的葡萄糖试剂盒，0时间、1天、3天这3次的测定同时使用试剂盒和HPLC。
(实施例7)
分段酿造时乙醇发酵的研究
实验材料如下所述。
·经MRE酶处理的竹子粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·甘酒酒曲(Aspergillus amazake)
·干酵母(日清食品株式会社制，日清Super Camelia)
实验方法
(1)利用了经MRE处理的竹子的分段酿造
在不锈钢罐中向经MRE处理的竹子150g加入水(矿泉水)150g，并充分混合。用高压灭菌器在121℃下处理15分钟，冷却至室温后，加入约0.1g甘酒曲霉菌，充分搅拌以使菌均匀混合。将混合物在25℃下静置3天。每天轻轻地搅拌一次，确认在经MRE处理的竹子全体上菌丝充分地伸长，将所得物作为1次发酵原料。然后，加入酿造水500g和烧酒酵母(酿酒酵母NBRC0249)0.6g，充分混合。将混合物在15℃下静置1天，加入酿造水1200g，充分搅拌，在15℃下静置3天后，仅取出发酵液。向该发酵液中加入1次发酵原料150g作为2段酿造，在15℃下静置3天。再次仅取出发酵液，加入1次发酵原料150g作为3段酿造，在15℃下静置3天。期间，每天轻轻地搅拌，目视观察发酵状态并测定乙醇的浓度。乙醇浓度的测定使用了GC。流程图在图6中示出，添加的原料在表6中示出。
[表6]
表6  添加的原料一览
1段酿造 2段酿造 3段酿造
经MRE处理的竹子 150g 150g 150g
米曲 ― ― ―
酿造水 2000 0 300
(2)在经MRE处理的竹子中均匀混合了米曲的分段酿造
向经MRE处理的竹子150g中加入水(矿泉水)150g，并充分混合。用高压灭菌器在121℃下处理15分钟，冷却至室温后，添加约0.1g甘酒曲霉菌，充分混合搅拌以使菌均匀。将混合物在25℃下静置3天。每天轻轻地搅拌一次，确认在经MRE处理的竹子全体上菌丝充分地伸长，将所得物作为1次发酵原料。然后，加入酿造水500g和烧酒酵母(酿酒酵母NBRC0249)0.6g，充分混合。将混合物在15℃下静置1天，向其中加入米曲50g和酿造水1350g，充分搅拌，在15℃下静置3天后，仅取出发酵液。向该发酵液中加入1次发酵原料和米曲50g作为2段酿造，在15℃下静置3天。再次仅取出发酵液，加入1次发酵原料和米曲50g、以及酿造水300ml作为3段酿造，在15℃下静置3天。期间，每天轻轻地搅拌，目视观察发酵状态并测定乙醇的浓度。乙醇浓度的测定使用了GC。流程图在图7中示出，添加的原料在表7Table2-2-12中示出。
[表7]
表7添加的原料一览
1段酿造 2段酿造 3段酿造
经MRE处理的竹子 150g 150g 150g
米曲 50g 50g 50g
酿造水 2000g 0g 300g
(3)边逐步减少经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造
在不锈钢罐中向经MRE处理的竹子150g加入水(矿泉水)150g，充分混合。用高压灭菌器在121℃下处理15分钟，冷却至室温后，添加约0.1g甘酒曲霉菌，充分搅拌以使菌均匀混合。将混合物在25℃下静置3天。每天轻轻地搅拌一次，确认在经MRE处理的竹子全体上菌丝充分地伸长，将所得物作为1次发酵原料。然后，加入酿造水500g和烧酒酵母(酿酒酵母NBRC0249)0.6g，充分混合。将混合物在15℃下静置1天，加入酿造水1350g，充分搅拌，在15℃下静置3天后，仅取出发酵液。向该发酵液中加入1次发酵原料175g和米曲25g作为2段酿造，在15℃下静置3天。再次仅取出发酵液，加入1次发酵原料187.5g和米曲12.5g、以及酿造水500g作为3段酿造，并在15℃下静置3天。期间，每天轻轻地搅拌，目视观察发酵状态并测定乙醇浓度。乙醇浓度的测定使用了GC。流程图在图8中示出，添加的原料在表8中示出。
[表8]
表8添加的原料一览
1段酿造 2段酿造 3段酿造
经MRE处理的竹子 150g 175g 187.5g
米曲 50g 25g 12.5g
酿造水 2000g 0g 500g
(4)边逐步增加经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造
在不锈钢罐中向经MRE处理的竹子175g加入水(矿泉水)175g，并充分混合。用高压灭菌器在121℃下处理15分钟，冷却至室温后，添加约0.1g甘酒曲霉菌，充分搅拌以使菌均匀混合。将混合物在25℃下静置3天。每天轻轻地搅拌一次，确认在经MRE处理的竹子全体上菌丝充分地伸长，将所得物作为1次发酵原料。然后，加入酿造水500g和烧酒酵母(酿酒酵母NBRC0249)0.6g，充分混合。将混合物在15℃下静置1天，加入灭菌水(矿泉水)1325g，充分搅拌，在15℃下静置3天后，仅取出发酵液。向该发酵液中加入1次发酵原料150g和米曲50g作为2段酿造，在15℃下静置3天。再次仅取出发酵液，加入1次发酵原料175g和米曲25g作为3段酿造，在15℃下静置3天。期间，每天轻轻地搅拌，目视观察发酵状态并测定乙醇的浓度。关于乙醇浓度的测定，乙醇浓度使用气相色谱法测定。流程图在图9中示出，添加的原料在表9中示出。
[表9]
表9添加的原料一览
1段酿造 2段酿造 3段酿造
经MRE处理的竹子 175g 150g 125g
米曲 25g 50g 75g
酿造水 2000g 0g 0g
（实施例8）
大容量的乙醇发酵的研究
实验材料如下所述。
·经MRE酶处理的竹子粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·甘酒酒曲(Aspergillus amazake)
·干酵母(日清食品株式会社制，日清Super Camelia)
实验方法
在6个钢罐中分别量取经MRE处理的竹子粉末300g(共计1.8kg)，每个都加入矿泉水300g(共计1.8kg)，充分搅拌混合后，在121℃下用高压灭菌器进行加热处理15分钟。将加热处理后的样品1.8kg转移到30L容量的发酵槽中，加入米曲200g，每24小时混合搅拌一次，使之在25℃下生长7天，将其作为1次发酵。1次发酵后，加入酿造水18.2kg和干酵母9g并充分搅拌后，在15℃下进行乙醇发酵5天，将其作为2次发酵。隔天测量2次发酵中的乙醇浓度和葡萄糖浓度。流程图如图10所示。
结果
(1)使用面包酵母的乙醇发酵可能性试验
对于只使用酵母的生竹子和经MRE处理的竹子，作为1次发酵在用甘酒曲霉菌进行糖化处理后乙醇发酵的结果在下表中示出。
[表10]
表10各条件下的乙醇浓度测定结果
乙醇浓度(%)
生竹子 0.04
经MRE处理的竹子 0.06
MRE处理的竹子+用甘酒曲霉菌糖化 023
在该结果当中，生竹子的乙醇浓度最低，为0.04%，其次是经MRE处理的竹子，为0.06%，作为1次发酵进行了甘酒曲霉菌糖化处理的经MRE处理的竹子的乙醇浓度高，为0.23%。
(2)1次发酵中使用的曲霉菌的培养实验
不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验的结果在表11中示出，第10天的照片在图11中示出。
[表11]
表11不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验的目视结果
Figure BDA0000421286520000231
另外，不同加水率的菌丝伸长试验的结果在表12中示出，第10天的照片在图12中示出。
[表12]
加水率60%的菌丝伸长试验的目视结果
Figure BDA0000421286520000232
加水率80%的菌丝伸长试验的目视结果
Figure BDA0000421286520000233
加水率100%的菌丝伸长试验的目视结果
Figure BDA0000421286520000234
由表11可知，甘酒曲霉菌从第5天这样早的阶段开始菌丝就延伸，在第10天也是菌丝延伸最好的。曲霉菌当中白曲的伸长较好，其次是2种黄曲与黑曲A.usami NBRC4033的程度相同，菌丝伸长也较好。没有观察到黑曲A.awamori NBRC4388的菌丝伸长。
在加水率变化引起的菌丝伸长培养试验中，使用在不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验中菌丝伸长最好的甘酒曲霉菌进行试验。
在不同加水率的菌丝伸长试验中，从表12可知，菌丝伸长的顺序为加水率100%>80%>60%。可以认为加水率100%时从第5天这样早的阶段开始在经MRE处理的竹子全体上就有菌丝伸长。
(3)乙醇发酵的条件研究
仅有糖化后的竹子液体的乙醇发酵的结果在表13中示出，带有经MRE处理的竹子固体(对照)的乙醇发酵在表14中示出。
[表13]
表13仅使用了糖化后竹子的液体的发酵
乙醇浓度(%)
第1天 0.18
第2天 0.20
第3天 0.17
第5天 0.21
[表14]
表14竹子固体+液体(对照)的发酵
乙醇浓度(%)
第1天 0.10
第2天 0.13
第3天 0.08
第5天 012
从表13和14可知，关于乙醇浓度，在第1天、第2天、第3天、第5天全部的天数里，仅有液体的一方比对照要高。另外，仅有液体的一方在第5天的乙醇浓度最高，为0.21%，而对照在第2天的乙醇浓度最高，为0.13%。
(4)适用于乙醇发酵的酵母的研究
第1次的不同酵母乙醇发酵能力研究结果在表15和图13中示出，葡萄糖浓度在图14中示出。
[表15]
表15不同酵母的乙醇发酵能力研究结果(第1次)
Figure BDA0000421286520000251
乙醇浓度示出高值的是面包酵母、酿酒酵母NBRC0282、NBRC2377(图13)。然而，在香味方面，如表15所示，作为酒酵母的酿酒酵母NBRC0249和烧酒酵母—酿酒酵母NBRC2373倾向于更优异。
研究中所用的各酵母在发酵第二天乙醇浓度为稳态或者有减少的倾向(参考表15和图14)。关于图14的葡萄糖浓度，暗示了在第3天葡萄糖浓度也没有减少，而是全部增加。这里，在7株酵母中，选择面包酵母和3株香味较好的酵母，按照图5中示出的流程图，进行第2次研究。此时，为了调查葡萄糖浓度的倾向，使用葡萄糖试剂盒，每24小时测量一次。第2次的乙醇发酵能力研究结果在图15中示出，葡萄糖浓度在图16中示出。
结果，随着乙醇浓度的上升，观察到葡萄糖浓度的减少(参考图15和图16)。从0时间开始到第1天为止葡萄糖大量消化，转变为乙醇，但第2天以后可认为葡萄糖的消化能力变缓。另外，在第3天时，观察到葡萄糖浓度增加，乙醇浓度减少。
不同酵母的葡萄糖消化性研究(第2次)
HPLC测量的结果在表16中示出。
[表16]
表16第2次不同酵母的葡萄糖消化性研究(HPLC)
                                      单位(g/L)
Figure BDA0000421286520000261
HPLC测量的结果也和图16相同，示出了葡萄糖浓度在第1天减少、在第3天增加的结果。
(5)分段酿造的乙醇发酵研究
(5-1)仅利用经MRE处理的竹子的分段酿造
按照流程图进行乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度在表17和图17中示出。
[表17]
表17仅利用经MRE处理的竹子的分段酿造9天的乙醇发酵和葡萄糖浓度(蒸馏前)
Figure BDA0000421286520000262
结果，乙醇浓度在乙醇发酵第一天最高，为0.015%，之后维持在0.004～0.008%之间(参考表17和图17)。另外，从表17可知，葡萄糖浓度每经过1天都不断增加，浓度上升。需要说明的是，由于乙醇浓度低，因此没有进行蒸馏。
(5-2)在经MRE处理的竹子中均匀混合了米曲的分段酿造
按照流程图进行的乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度在表18和图18中示出。
[表18]
表18在经MRE处理的竹子中均匀混合了米曲的分段酿造9天的乙醇浓度和葡萄糖浓度(蒸馏前)
Figure BDA0000421286520000271
结果，观察到乙醇浓度的上升以及伴随该上升的葡萄糖浓度的减少(参考表18和图18)。第一天乙醇的浓度为0.28%，第3次分段酿造的最后一天(第9天)上升到4.55%，与此相对，葡萄糖的浓度变为0%。
(5-3)边逐步减少经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造
按照流程图进行的乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度在表19和图19中示出。
[表19]
表19边逐步减少经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造9天的乙醇浓度和葡萄糖浓度(蒸馏前)
Figure BDA0000421286520000281
结果，观察到乙醇浓度的上升以及伴随该上升的葡萄糖浓度的减少(参考表19和图19)。第一天乙醇的浓度为0.46%，分段酿造第3次时，一旦葡萄糖浓度上升后，随之就会观察到乙醇浓度的减少。然而，第3次分段酿造的最后一天(第9天)上升到2.26%，葡萄糖的浓度变为0%。另外，随着米曲的减少葡萄糖浓度变为0%的天数变早了。
(5-4)边逐步增加经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造
按照流程图进行的乙醇发酵的结果和葡萄糖浓度在表20和图20中示出。
[表20]
表20边逐步增加经MRE处理的竹子中的米曲边酿造的分段酿造9天的乙醇浓度和葡萄糖浓度(蒸馏前)
Figure BDA0000421286520000291
结果，观察到乙醇浓度的上升，第一天的乙醇浓度为0.12%，第3次分段酿造的最后一天(第9天)上升到5.88%(参考表20和图20)。虽然观察到葡萄糖浓度每3天就会减少，但第3次分段酿造时，其减少的浓度比其他2次少，残留1.6%左右的葡萄糖。
关于(5-2)～(5-4)中酿造的物质，由于乙醇度数高，因此在分段酿造的最后一天进行蒸馏。其结果在表21和图21中示出。
[表21]
表21加入米曲的竹子烧酒的馏分乙醇浓度(%)比较一览表
Figure BDA0000421286520000292
结果，均匀添加了米曲所酿造的物质的乙醇浓度最高，其次是逐步添加米曲的酿造物，乙醇浓度最低的是逐步减少米曲的酿造物(参考表21和图21)。
(6)大容量的乙醇发酵的研究
增大规模以大容量进行乙醇发酵的结果的乙醇浓度和葡萄糖浓度的测量值在表22和图22中示出。
[表22]
表22大容量乙醇发酵的结果
葡萄糖浓度(g/L) 乙醇浓度（%）
第0天 0.0101 0.003
第1天 0.0033 0.011
第2天 0.0009 0.015
第3天 0.0006 0.015
第4天 0.0004 0.017
第5天 00003 0021
结果，乙醇浓度每次测定都在上升，2次发酵结束的第5天为0.02%。另外，葡萄糖浓度每次测定都在减少，2次发酵结束的第5天为0.004%(参考表22和图22)。
(实施例9)
使用经MRE处理的杉木和柏木的乙醇发酵
用于1次发酵的曲霉菌的培养实验和乙醇发酵的研究
实验材料如下所述。另外，所使用的菌株的详细情况在表23中示出。
·经MRE酶处理的杉木、柏木粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·使用的菌株；7个菌株
·干酵母(日清食品株式会社制，日清Super Camelia)
[表23]
表23使用的菌株
Figure BDA0000421286520000301
实验方法
(1-1)不同曲霉菌的菌丝伸长试验
向经MRE处理的杉木·柏木粉末中加入矿泉水，将加水100%的所得混合物以每份20g等分到盘子中。然后在高压灭菌器(121℃，15分钟)中进行加热处理，冷却后，接种2种白曲(甘酒曲霉菌、米曲霉菌NBRC30104)、2种黄曲(放线曲霉菌NBRC4040、IFO4297)、2种黑曲(宇佐美曲霉菌NBRC4033、泡盛曲霉菌NBRC4388)共计6株菌株，在25℃下生长10天，检查菌丝的伸长。需要说明的是，关于加水率，由竹子的实验结果作为100%。实验方法参考图3a。
(1-2)使用在菌丝伸长试验中结果良好的曲霉菌的乙醇发酵
经MRE处理的杉木·柏木分别量取125g，加入矿泉水125g并充分搅拌，使加水率为100%。然后在高压灭菌器(121℃，15分钟)中处理，冷却后，作为1次发酵，在25℃下发酵7天。作为2次发酵，向干酵母(日清食品株式会社制，日清Super Camelia)中加入酿造水800g并充分混合，加入到1次发酵所得物当中，充分搅动使之2次发酵。2次发酵在15℃下进行3天。取发酵的上清液，用过滤器过滤，测定葡萄糖浓度和乙醇浓度。操作方法在流程图图23中示出。
(实施例10)
适用于乙醇发酵的酵母的研究
实验材料如下所述。另外，所使用的酵母的详细情况如表3所述。
·经MRE酶处理的杉木·柏木粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·使用的菌株；
1次发酵用菌株：泡盛曲霉菌NBRC4388
使用的酵母：乙醇发酵能力研究用酵母7种
另外，使用的培养基、使用的试剂盒、气相色谱（GC）的测量条件、高效液相色谱(HPLC)的测量条件等都与竹子实验中的那些条件相同。
实验方法
实验方法的步骤如图24所示。
向经MRE酶处理的杉木·柏木200g中加入矿泉水，以使得按重量比计加水为100%，充分混合后，在高压灭菌器中于121℃下处理15分钟。冷却至室温后，加入约0.1g泡盛曲霉菌作为种曲，充分混合后，在25℃下静置发酵7天，每24小时就轻轻地进行搅拌。将其作为1次发酵。向1次发酵所得物中加入酿造水1800mL，充分混合后，静置24小时。24小时后，将发酵液的上清液分装到300mL容量的高型烧杯中，每个烧杯100mL。在装入有10mL PD液体培养基的18φ试管中，将一白金环的上述酵母分别接种在各试管中，于30℃、100cpm下培养24小时。将其作为前培养液，将1%前培养液分别接种在500mL容量的迈尔烧瓶(工作容积200mL PD介质)中，于30℃、100cpm下培养24小时，将其作为主培养液。24小时后，用小型冷却离心机(TOMY公司制)在4℃下以8krpm的速度离心分离200mL主培养液10分钟，得到培养酵母。将该培养酵母全部悬浮在3mL灭菌水中以后，加入到1次发酵液中，开始2次发酵。2次发酵在15℃、静置条件下进行3天，每24小时就轻轻地进行搅拌。2次发酵中每24小时用GC(GL Sciences公司制)进行乙醇浓度的测定并用葡萄糖试剂盒进行葡萄糖浓度的测定。需要说明的是，将在1次发酵液中未添加酵母的所得物作为对照进行比较。
(实施例11)
分段酿造的乙醇发酵的研究
实验材料如下所述。
·经MRE酶处理的杉木·柏木粉末(用1mm筛目的筛网筛分)
·矿泉水(来自森林的水可口可乐公司出售)
·使用的菌株；
1次发酵用菌株：泡盛曲霉菌NBRC4388
使用的酵母：乙醇发酵能力研究用酵母7种
实验方法
在不锈钢罐中向经MRE处理的杉木·柏木各150g中加入矿泉水150g，充分混合。在高压灭菌器中于121℃下处理15分钟，冷却至室温后，加入约0.1g泡盛曲霉菌NBRC4388，充分搅拌以使菌均匀混合。将混合物在25℃下静置3天。每天轻轻地搅拌一次，确认在整体上有菌丝充分伸长，将其作为1次发酵原料。然后，加入酿造水500g和酵母(杉木：酿酒酵母NBRC0244，柏木：干酵母)各0.6g，充分混合。将混合物在15℃下静置1天，加入酿造水1200g，充分搅拌，在15℃下静置3天后，仅取出发酵液。向该发酵液中加入1次发酵原料150g作为2段酿造，在15℃下静置3天。再次仅取出发酵液，作为3段酿造加入1次发酵原料150g，在15℃下静置3天。期间，每天轻轻地搅拌，目视观察发酵状态并测定乙醇浓度。关于乙醇浓度的测定，乙醇浓度使用气相色谱测定。需要说明的是，关于仅有经MRE处理的杉木·柏木的分段酿造，在进行作为2次发酵的乙醇发酵时，如果存在杉木·柏木粉末的固体成分的话，据认为可能会抑制乙醇发酵，因此采用了在1次发酵后仅取出液体进行2次发酵的方法。流程图在图25中示出，添加的原料在表24中示出。
[表24]
表24添加的原料一览
1段酿造 2段酿造 3段酿造
经MRE处理的杉木·柏木 150g 150g 150g
米曲 ― ― ―
酿造水 2000g 0g 0g
结果
用于1次发酵的曲霉菌的培养实验和乙醇发酵的研究
使用了经MRE处理的杉木的不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验结果在表25中示出，第10天的照片在图26中示出。
[表25]
表25使用了经MRE处理的杉木的菌丝伸长试验结果
Figure BDA0000421286520000341
另外，使用了柏木的不同种类曲霉菌的菌丝伸长试验结果在表26中示出，第10天的照片在图27中示出。
[表26]
表26使用了经MRE处理的柏木的菌丝伸长试验结果
Figure BDA0000421286520000342
经MRE处理的杉木、柏木两者都使用泡盛曲霉菌NBRC4388的情况下从第3天这样早的阶段起菌丝就围绕粉末整体，菌丝的生长最好(参考表25和表26)。此外，对经MRE处理的杉木来说，可以确认除了放线曲霉菌NBRC4040以外的5种菌株都有良好的菌丝生长；但对于经MRE处理的柏木来说，与经MRE处理的杉木相比，结果是，采用除了泡盛曲霉菌NBRC4388以外的菌株生长缓慢。
将在经MRE处理的杉木、柏木的菌丝伸长试验中结果良好的泡盛曲霉菌NBRC4388用于1次发酵的糖化以进行乙醇发酵，结果在表27中示出。
[表27]
原料中使用了经MRE处理的杉木的乙醇发酵
乙醇浓度(%) 葡萄糖浓度(g/L)
第1天 0.03 1.01
第2天 0.04 1.04
第3天 0.05 1.04
原料中使用了经MRE处理的柏木的乙醇发酵
乙醇浓度(%) 葡萄糖浓度(g/L)
第1天 0.01 1.20
第2天 0.02 1.26
第3天 0.02 1.31
经MRE处理的杉木中乙醇浓度是0.05%，经MRE处理的柏木中乙醇浓度是0.02%(参考表27)。另外，关于葡萄糖浓度，在乙醇发酵第3天，经MRE处理的杉木·柏木二者的发酵液中都有1%以上残留，未被完全消化。
适用于乙醇发酵的酵母的研究
使用经MRE处理的杉木的不同酵母乙醇发酵能力研究结果在表28和图28中示出，葡萄糖浓度在表29和图29中示出。
[表28]
表28经MRE处理的杉木的不同酵母乙醇发酵能力研究结果(单位%)
Figure BDA0000421286520000361
[表29]
表29经MRE处理的杉木的不同酵母葡萄糖浓度测量结果(单位g/L)
Figure BDA0000421286520000362
另外，经MRE处理的柏木的不同酵母乙醇发酵能力研究结果在表30和图30中示出，葡萄糖浓度在表31和图31中示出。
[表30]
表30经MRE处理的柏木的不同酵母乙醇发酵能力研究结果(单位%)
Figure BDA0000421286520000371
[表31]
表31经MRE处理的柏木的不同酵母葡萄糖浓度测量结果(单位g/L)
Figure BDA0000421286520000372
关于经MRE处理的杉木的不同酵母乙醇发酵能力研究结果，乙醇浓度示出最高值的是酿酒酵母NBRC0244(参考表28和图28)。另外，当原料使用经MRE处理的柏木时，面包酵母的乙醇浓度最高(参考表30和图30)。关于香味，杉木、柏木的木材特有的香味强烈地残留，几乎不会感觉到酵母的香味(参考表28和表30)。
仅利用了经MRE处理的杉木·柏木的分段酿造中的乙醇发酵研究
利用了经MRE处理的杉木的分段酿造中的乙醇浓度和葡萄糖浓度的结果在表32和图32中示出。
[表32]
表32仅利用了经MRE处理的杉木的分段酿造9天的乙醇发酵和葡萄糖浓度(蒸馏前)
Figure BDA0000421286520000381
另外，利用了经MRE处理的柏木的分段酿造中的乙醇浓度和葡萄糖浓度的结果在表33和图33中示出。
[表33]
表33仅利用了经MRE处理的柏木的分段酿造9天的乙醇发酵和葡萄糖浓度(蒸馏前)
Figure BDA0000421286520000382
可以确认经MRE处理的杉木·柏木的乙醇浓度每次测定都上升(参考图32和图33)。另外，关于发酵天数第9天的乙醇浓度，经MRE处理的杉木为0.103%，经MRE处理的柏木为0.046%。但是，杉木、柏木二者的葡萄糖浓度也每天都在上升，表明葡萄糖未被完全消化。
不用说，本发明可以进行各种变形，并不限于上述的一个实施方案，在不改变发明要点的范围内可以进行各种变形。

Claims (8)

1.一种由树木制造乙醇的方法，其特征在于，具有以下步骤：
施用步骤，其为在目标树木中施用母细胞溶解酶群的步骤，由此将所述树木分解为粉末状从而得到树木分解物，其中所述母细胞溶解酶群是在伴随着产孢子好氧细菌的孢子形成的细胞溶解中生成的；
对所述树木分解物灭菌的步骤；
对灭菌后的所述树木分解物施用曲霉菌从而进行一次发酵的步骤；
向通过所述一次发酵而得到的发酵液中添加酵母菌从而进行二次发酵的步骤；以及
对通过所述二次发酵而得到的发酵液进行过滤的步骤，
所述母细胞溶解酶群是通过以下方式获得的：培养所述产孢子好氧细菌并将所得到的培养液置于饥饿状态，由此使该细菌内生孢子化，进一步从该培养液中除去含有该内生孢子化细菌的杂质，
其中所述产孢子好氧细菌为MRE共生菌群。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述树木选自竹子、杉木、柏木。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述曲霉菌选自甘酒曲霉菌Aspergillus amazake、米曲霉菌Aspergillus orgzae(NBRC30104)、米曲霉菌Aspergillus orgzae(NBRC30113)、放线曲霉菌Aspergillus cellulosae(NBRC4040)、放线曲霉菌Aspergillus cellulosae(IFO4297)、宇佐美曲霉菌Aspergillususami(NBRC4033)、泡盛曲霉菌Aspergillus awamori(NBRC4388)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述酵母菌选自面包酵母、酿酒酵母Saccharomyces celevisiae(NBRC0244)、酿酒酵母Saccharomyces celevisiae(NBRC0249)、酿酒酵母Saccharomyces celevisiae(NBRC0282)、酿酒酵母Saccharomycescelevisiae(NBRC2373)、酿酒酵母Saccharomyces celevisiae(NBRC2377)、酿酒酵母Saccharomyces celevisiae(IFO1728)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
将所述树木浸渍在分解溶液中，并通过对该溶液进行曝气使所述树木分解，其中所述分解溶液含有所述母细胞溶解酶群和/或通过所述产孢子好氧细菌的孢子形成而生成的孢子。
6.一种烧酒，其含有通过权利要求1所述的方法而得到的乙醇溶液。
7.一种发酵残渣，其为在通过权利要求1所述的方法得到的乙醇溶液的制造过程中获得的发酵残渣，其特征在于，
该发酵残渣是通过对由所述二次发酵得到的发酵液进行过滤而得到的。
8.根据权利要求7所述的发酵残渣，其特征在于，
所述发酵残渣被用作农业用堆肥或家畜饲料。
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