CN103266073B

CN103266073B - 一种东南景天内生菌及其应用

Info

Publication number: CN103266073B
Application number: CN201310196985.5A
Authority: CN
Inventors: 杨肖娥; 陈宝; 潘风山; 冯英
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2033-05-23
Also published as: CN103266073A

Abstract

本发明公开了一种东南景天内生菌及其应用。本发明的内生菌，命名为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter？calcoaceticus）Sasm3，保藏编号为CGMCC？NO.7334。本发明还公开了所述的内生菌在植物-微生物联合修复重金属污染土壤中的应用。所述应用包括：将东南景天接种所述的内生菌，接种后将东南景天种植于待修复的重金属污染土壤中；从东南景天接种后的第二个生长季开始，每个生长季重新对东南景天接种所述的内生菌，并对东南景天进行刈割。本发明的内生菌能够提高东南景天对高浓度重金属的耐性，促进其在高重金属浓度环境中健康成长，提高东南景天的生物量和增强其对重金属污染土壤的修复效率。

Description

一种东南景天内生菌及其应用

技术领域

本发明属于土壤生物修复技术领域，尤其涉及一种东南景天内生菌及其应用。

背景技术

随着工业的高速发展、农业生产的现代化以及城镇化的快速推进，土壤重金属污染状况日益严重。

重金属无法被微生物降解，而且大多数重金属在土壤中具有移动性差、滞留时间长、隐蔽性、不可逆转性等特点，土壤一旦被重金属污染就极难削减。土壤中的重金属一方面可以影响植物生长、细胞***等多种代谢活动，抑制作物的生长从而降低农作物产量。另一方面，土壤中的重金属可以通过土壤-作物***进入食物链，给人类健康带来了巨大风险。面对过去几年发生的几十起重金属引起的***件，降低土壤环境中重金属含量，减少其对农产品的污染，保障生态***和人类健康已经迫在眉睫。

在有限的土地资源面前，重金属污染土壤的修复成为农业可持续发展的一个重要任务。由于重金属不能像有机物污染物那样可以直接通过在植物根际或植物体内的降解来消除污染物，土壤中重金属的植物修复的难度要大得多。

植物修复（phyto-remediation）是利用绿色植物转移、容纳或转化环境中污染物的原位修复技术，与传统技术如客土法、土壤固定、土壤淋洗等物理和化学方法相比，具有高效、环境友好、成本低、不引起二次污染等优点。东南景天最初在浙江省衢州市古老Pb/Zn矿址上发现，是第一个中国原生的Zn/Cd超积累植物，能够有效地提取土壤中的Zn、Cd、Pb元素，不仅是研究植物吸收、转运和超积累Zn/Cd机理的良好模式材料，也是提升植物修复重金属污染技术的良好材料，其植物体中重金属浓度是土壤中的几倍甚至几十倍。尽管东南景天在生长速率和生物量上相比多数重金属超积累植物要有些优势，但其修复土壤重金属污染的效率还是受到生长慢、生物量小、适应性弱和土壤重金属可给性的限制，因此，如何促进东南景天生长、抗逆、提高生物量和对土壤重金属的吸收、转运、积累重金属能力，这对于应用东南景天修复重金属污染土壤的实际应用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种内生菌，能够促进东南景天的生长，提高东南景天对重金属的吸收能力。

一种内生菌，分类命名为乙酸钙不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus），完整命名为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）Sasm3，该菌株已于2013年03月19日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.7334。

本发明菌株在LB培养基上呈淡黄色圆形菌落，小，无味，表面湿润，透明，边缘光滑整齐，革兰氏阴性，杆状，在LB液体培养基中耐Zn浓度25mM，耐Cd浓度2.5mM，能产生生长激素（IAA），产生ACC脱氨酶，分泌嗜铁素，抗氨苄青霉素100μg/mL和四环素15μg/mL，未检测到分泌纤维素酶和果胶酶。

该菌株从东南景天植物体中分离得到，能够在东南景天的植物体中进行定殖，促进东南景天的生长和对重金属的吸收能力。

本发明还提供了所述的内生菌在植物-微生物联合修复重金属污染土壤中的应用。

所述的重金属污染土壤含镉、锌等。

所述应用具体包括：

（1）将东南景天接种所述的内生菌，接种后将东南景天种植于待修复的重金属污染土壤中；

（2）从东南景天接种后的第二个生长季开始，每个生长季重新对东南景天接种所述的内生菌，并对东南景天进行刈割。

东南景天能够耐受高浓度重金属污染，吸收土壤中的Zn、Cd等重金属并将其积累在地上部组织中，是修复土壤重金属污染的优良种质，但由于其生长慢、生物量较小，故修复效率不高，限制着其在实际中的应用。

本发明从生长在原生地的超积累生态型东南景天的根圈和体内富集分离到能够与东南景天进行良好互作的特异内生细菌，然后筛选能够促进植物生长和强化提取重金属效率的菌株，最终筛选到一株内生菌乙酸钙不动杆菌属（Acinetobacter calcoaceticus）Sasm3，将该菌株应用于植物修复土壤重金属污染中，建立植物-微生物联合修复技术体系，能够使东南景天更好的利用土壤中的营养，增加东南景天的生物量，提高东南景天对重金属的修复效率，充分发挥东南景天的修复潜力。

步骤（1）中，所述内生菌的接种方法为：取东南景天枝条，扦插生根后，浸入含所述内生菌的培养液中，培养5～7天。

为保证接种的成功率，内生菌的浓度一般为10³～10⁶CFU/mL，优选为10⁵CFU/mL。

接种后，内生菌定殖在东南景天根的内部，与根系形成共生关系，即可将东南景天种植于被重金属污染的土壤中。

每年的9～12月及3～6月为东南景天的生长季，东南景天在刚栽种时生长较慢，在初次接种内生菌的一个生长季内不需要再次接种内生菌，以后每个生长季节接种一次。

由于东南景天已经在土壤中进行生长，因此，从东南景天接种后的第二个生长季开始，再次进行内生菌的接种时，可以以机肥或营养土作为基质，将含内生菌的菌液与基质混合后施于所述的重金属污染土壤中。

所述内生菌的浓度为10⁸CFU/g基质。

其中，内生菌的浓度为10⁶～10⁹CFU/g基质，优选为10⁸CFU/g基质。

由于细菌的的存活和生长需要一定的湿度，所述菌液与基质混合后，基质的湿度为60%～70%。

施用方法可以为挖沟深施或雨天洒施，优选的，施用方法为挖沟深施。挖沟深施更有利于内生菌与东南景天的根系充分接触，同时还能够为内生菌提供稳定的生存环境。

东南景天第一次刈割从接种后的第二个生长季开始，待生物量最大时刈割，收获地上部，刈割时，保留东南景天地上部的茎4～8cm或保留东南景天5～10片叶片为宜，以后每个生长季收获一次，即一年收获2季，多年连续种植，实现连续收割，高效连续修复。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的内生细菌能够定殖在东南景天体内，不仅能够显著提高东南景天对高浓度重金属的耐性，促进其在较高重金属浓度环境中健康成长，还能够显著提高东南景天的生物量和增强东南景天对Zn、Cd等重金属的吸收能力，解决了重金属污染土壤中东南景天生长缓慢、生物量小的问题，增强了东南景天的环境适应性，具有良好的社会效益、经济效益和环境效益，为推广东南景天在土壤修复中的应用有重要意义。

本发明通过接种内生菌，使东南景天插苗成活率大大提高，成活后生物量显著提高，对高浓度污染土壤耐性更强，同样的生物量下吸收更多的重金属，显著地提高了东南景天对重金属污染土壤的修复效率。另外，接种内生菌后，在野外生长的东南景天受刈割造成植株死亡率显著减小，植株再次生长更加旺盛。

本发明接种处理简单易行，维护成本低廉，有利于长期、稳定的对重金属污染土壤进行修复，这就避免了农艺化学措施调控中添加化学土壤改良剂引起的二次污染问题，有利于改善生态环境。

附图说明

图1为东南景天内生菌平板筛选示意图；

图2为东南景天内生菌Sasm3的***发育树分析；

图3为水培环境中内生菌Sasm3对东南景天根系生长的影响；

图4为土培环境中内生菌Sasm3对东南景天生长的影响；

图5为土培环境中内生菌Sasm3对东南景天生物量的影响；

图6a为内生菌Sasm3对东南景天地上部重金属Zn和Cd浓度的影响；

图6b为内生菌Sasm3对东南景天根部重金属Zn和Cd浓度的影响；

图7a为内生菌Sasm3对东南景天地上部重金属Zn和Cd积累量的影响；

图7b为内生菌Sasm3对东南景天根部重金属Zn和Cd积累量的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1促东南景天生物修复内生细菌的分离

从矿区采集长势良好的东南景天野生植株，立即进行内生菌分离筛选试验。

采用常规的内生菌分离方法。整株东南景天去除不新鲜的叶片，然后用自来水冲洗30min，再用蒸馏水洗3次，每次3min；用无菌吸水纸吸去植物表面水分，再用无菌剪刀将叶片、茎和根分开，将每一部份分别用70%酒精浸3min，无菌水洗3次，0.5%HgCl₂浸泡1min，然后用无菌水冲洗5次以上，每次1min，并将最后一次洗涤用的无菌水涂LB平板以确认植株表面的无菌状态。

准备LB固体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉1.5%，定容1000mL，pH7.2，121℃灭菌），将培养基倒在9cm培养皿上，每块培养皿约20mL。在洁净超净工作台中，用无菌手术刀（火焰灼烧灭菌后冷却）切割植物样本薄片，并将薄片平铺在培养皿的培养基上，每个培养基约9个（如图1所示），用封口膜封好培养皿倒置于30℃培养箱中培养一周。

用接种环挑下东南景天切片周围的菌斑，反复划线三次分离出单一菌落，分别接种于LB试管斜面，4℃保存（可保存2个月）。

实施例2促东南景天生物修复内生细菌的筛选、纯化、保藏和鉴定

冰箱取出保存菌种，接种于LB液体培养基，37℃过夜培养，接种环蘸取少量菌液再次划线，挑取单菌落于LB液体培养基中，30℃生长至对数期。此菌液一部分用以保藏，在1.5mL无菌离心管中加入300μL灭菌甘油和700μL对数期菌液，-80℃保存（可保存2年），剩余的菌液进行关键生理生化指标的鉴定。

1、致病性鉴定

将上述对数期菌液接种到新鲜的破损叶面（东南景天，烟草，油菜），以无菌水作对照，未发现叶片病害特征；用无菌注射器抽取100μL菌液注射到新鲜健康的洋葱茎内，以无菌水作对照，30℃培养一周，未发现洋葱有病害特征。

2、耐Zn/Cd特点

向含Zn/Cd的LB培养基（分别含有浓度梯度：Zn（1、2、4、5、8、10、12、15、20、25、30、35或40mM）或Cd（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或5.0mM））中接种10μL对数期菌液，37℃过液培养，观察内生细菌在不同Zn/Cd浓度下生长情况。

3、产ACC脱氨酶能力

当将促生根际菌定植到种皮或是植物根系时，会合成并分泌IAA（生长素），新合成的IAA将会被植物体吸收形成内源生长素，从而刺激植物细胞的***与延长。与此同时，IAA会激发ACC合成酶的活性，将S-腺苷甲硫氨酸转化成1-氨基环丙烷-1-羧酸。ACC脱氨酶是测定根际促生菌促进植物生长能力的指标之一。

参考Honma M和Shimomura T（Honma M&Shimomura T.Metabolismof 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid.Agric Biol Chem，1978，42：1825-1831）建立的以测定α-酮丁酸来检测内生细菌产ACC脱氨酶的活性的方法。

4、产IAA能力

吲哚乙酸（IAA）是一种能够调节植物生长发育的植物生长激素。

采用Salkowski比色法（Sarwar&Kremer.Determination of bacteriallyderived auxins using a microplate method.Letters in Applied Microbiology，2008，20：282-285）测定分离物产生植物生长激素类物质IAA的能力。

5、分泌嗜铁素能力的测定

嗜铁素是由微生物在低铁条件下合成的一类小分子量、能特异螯合铁离子的螯合物，分泌嗜铁素的细菌可用于防治真菌病害。

利用CAS平板法（Schwyn&Neilands.Universal chemical assay for thedetection and determination of siderophores.Analytical Biochemistry，1987，160：47-56）检测细菌分泌嗜铁素的能力。

通过检测，筛选到一株耐Zn/Cd能力、产ACC脱氨酶能力、产IAA能力、分泌嗜铁素能力均较好的内生菌菌株，命名为Sasm3，该菌株的各项生理生化指标参见表1。

表1内生菌Sasm3与促进修复相关的生理生化指标

6、菌株鉴定和保藏

（1）形态特征

该菌株Sasm3在LB培养基上呈淡黄色圆形菌落，小，无味，表面湿润，透明，边缘光滑整齐，革兰氏阴性，杆状，在LB液体培养基中耐Zn浓度25mM，耐Cd浓度2.5mM，能产生生长激素（IAA），产生ACC脱氨酶，分泌嗜铁素，抗氨苄青霉素100μg/mL和四环素15μg/mL，未检测到纤维素酶和果胶酶。

（2）分子生物学鉴定

将Sasm3菌株的菌液7000r/min离心收集菌体，利用上海生工生物细菌DNA提取试剂盒提取DNA，并利用引物27F和1429R扩增该菌株的16S rDNA，其中，引物的碱基序列为：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

将获得的PCR扩增产物纯化后委托华大基因进行测序，经测序得到长度为1458bp的16S rDNA片段，在GenBank中的注册登记号为KF002588，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过Blast比对，并利用MEGA5.0软件进行***发育分析，结果表明，菌株Sasm3与乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）的16S rDNA核苷酸序列的同源性在99%以上（如图2）。因此，鉴定该Sasm3菌株为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus），命名为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）Sasm3，并将该菌株送至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.7334，保藏日期为2013年03月19日。

实施例3内生菌对东南景天生长和重金属土壤修复的影响

营养液组成为：K₂SO₄，0.7mmol/L；KCl，0.1mmol/L；Ca(NO₃)₂·4H₂O，2mmol/L；MgSO₄·7H₂O，0.5mmol/L；KH₂PO₄，0.1mmol/L；H₃BO₃，10μmol/L；MnSO₄·H₂O，0.5μmol/L；ZnSO₄·7H₂O，1μmol/L；(NH₄)₄MoO₂₄·4H₂O，0.01μmol/L；FeSO₄·7H₂O溶解于煮沸的20μmol L^-1Na₂·EDTA溶液中，20μmol/L。用NaOH或HCl调整营养夜pH5.8）

（1）水培环境

采用水培法对东南景天进行快速繁殖。剪取东南景天新生的枝条，每条约10cm长，只留下枝条顶端的5～8片叶片，将其***到0.1倍水培营养液中，温度为23～25℃，光照条件为200～300μE/m²·s，待3周后枝条生长出少许的根，再用1倍上述营养液培养，并向营养液中通气。每3～4天更换一次营养液。在第4周向营养液中加入内生菌Sasm3的菌体（离心收集对数期菌体，无菌水洗涤3次），每毫升营养液中的菌体为10⁵CFU，之后换营养液不再接入Sasm3菌体。

生长1个月后观察东南景天的生长情况，如图3示，与不接种内生菌Sasm3的对照相比，接种内生菌Sasm3的东南景天生长更加旺盛，根系更加发达。

（2）土培环境

采用土培法种植东南景天。水培东南景天接种一周后，将其根部洗涤干净，移植到矿山土盆栽当中，矿山土的理化性质见表2，保持土壤55%左右的湿度，生长时间为2个月。

由图4可见，接种内生菌Sasm3后，东南景天地上部生物量明显增加。将东南景天收获后，对地上部和地下部（即根部）的生物量进行称重和分析，发现，与不接内生菌Sasm3的对照相比，接种内生菌Sasm3后，东南景天的地上部和地下部的生物量均有不同程度的显著增加，其中，地上部生物量的增加18.35%，地下部生物量增加35.03%（如图5所示），说明内生菌Sasm3能够显著促进东南景天地上部和地下部的生长。

表2试验所用矿山土的基本理化性质

进一步对东南景天根部和地上部的重金属量的分析和积累量进行测定和分析，Zn和Cd的检测采用常规方法。如图6a、图6b、图7a和图7b，发现，接种内生菌Sasm3后，东南景天地上部和地下部的重金属浓度和积累量均显著增加，其中，地上部和根部Zn含量浓度分别增加18.7%和9.31%，地上部Cd的含量浓度增加47.48%，根部Cd浓度增大量不明显；对照组东南景天地上部Zn的积累量为401.52mg，根部Zn的积累量为8.314mg，接种内生菌Sasm3后，东南景天地上部Zn的积累量可达到561.07mg，提高了39.73%，根部Zn的积累量也达到12.22mg，提高了47.02%。同时，接种内生菌Sasm3后，东南景天地上部Cd的积累量达到了26.75mg，提高了74.17%，根部积累提高29.86%。

与未接种内生菌处理相比，植物-微生物修复技术体系显著提高了东南景天生物量（矿山土处理时，地上部和根系生物量的显著水平分别为0.027和0.034）和地上部重金属Cd浓度（矿山土处理时，Zn和Cd浓度显著水平分别为0.002和0.0001）。

另外，我们还通过试验发现，实验室条件下，不接种内生菌植株存活率约为71.0%～90.1%，而接种内生菌后，使东南景天插苗成活率达92.8%～99.5%。由于矿山土土质贫瘠，若在矿山土壤中增加20%左右营养土菌剂（腐烂水草，浓度为CFU10⁷～10⁸/g的Sasm3内生菌）后，生物量更提高至94.7%～136.2%。

实施例4促东南景天生物修复内生细菌的应用

东南景天苗株快速繁殖（参照实施例3的方法）：取东南景天顶端枝条在营养液中生根45天左右。LB液体培养基摇Sasm3菌液过夜，无菌水洗去培养基，按10⁵CFU/mL接种到生根苗筐中，通气培养1周。此时东南景天内生菌将定殖在根内部，与根系形成共生关系。

扦插繁殖：东南景天接种内生菌1周后，内生菌将定殖在其根内部，将东南景天苗株种植于重金属复合污染矿山土壤中，种苗密度为每平方米种植70～100株。刚栽种时生长较慢，每年的9～12月及3～6月为其生长季。在初次栽种一个生长季内不用再次接种内生菌，以后每个生长季节接种一次，接种时，将洗去培养基的Sasm3菌液与有机肥或营养土作为基质混合，保持菌体浓度为10⁸CFU/g基质，湿度60%～70%，挖沟深施（也可雨天洒施），挖沟深施用量为0.12～0.15kg/m²，生长两个季度后，会生长出更多的新植株。

刈割收获：第一次刈割从接种后的第二个生长季开始，待生物量最大时刈割，收获地上部，收割时地上部保留茎4～8cm左右，以后每个生长季收获一次，即一年收获2季，多年连续种植，实现连续收割，高效连续修复。

统计发现，接种内生菌后，东南景天的成活率接近100%，通常不接种内生菌植株存活率为71.0～90.1%，且在野外生长的东南景天接种后受收割造成苗株死亡率显著减小50%左右，苗株再次生长更加旺盛。在野外生长的东南景天接种内生菌3个月后，同样的生物量地上部吸收重金属Zn、Cd量分别提高了18.7%和47.48%。

Claims

1.一种内生菌，其特征在于，命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)Sasm3，保藏编号为CGMCC NO.7334。

2.如权利要求1所述的内生菌在东南景天-微生物联合修复锌和/或镉污染土壤中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括：

(1)将东南景天接种所述的内生菌，接种后将东南景天种植于待修复的重金属污染土壤中；

(2)从东南景天接种后的第二个生长季开始，每个生长季重新对东南景天接种所述的内生菌，并对东南景天进行刈割。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述内生菌的接种方法为：取东南景天枝条，扦插生根后，浸入含所述内生菌的培养液中，培养5～7天。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述内生菌的接种方法为：将含内生菌的菌液与基质混合均匀，施于所述的重金属污染土壤中。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述内生菌的浓度为10⁶～10⁹CFU/g基质。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌液与基质混合后，基质的湿度为60％～70％。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，施用方法为挖沟深施或雨天洒施。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述刈割时，保留东南景天地上部的茎4～8cm或保留东南景天5～10片叶片。