CN105950502B - 一种复合内生细菌菌剂及其在重金属污染土壤植物修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合内生细菌菌剂及其在重金属污染土壤植物修复中的应用，由乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)组成。本发明的复合菌剂应用于修复重金属污染，集合几种内生细菌的优势，克服植物修复的弱点，促进东南景天生长，增强东南景天对重金属的吸收能力，提高植物修复效率。

Description

一种复合内生细菌菌剂及其在重金属污染土壤植物修复中的 应用
技术领域
本发明涉及植物修复技术领域，具体涉及一种复合内生细菌菌剂及其在植物修复中的应用。
背景技术
随着工业的高速发展、农业生产的现代化以及城镇化的快速推进，土壤重金属污染状况日益严重。
重金属无法被微生物降解，具有移动性差、滞留时间长、隐蔽性、不可逆转性等特点，土壤一旦被重金属污染就极难削减。土壤中的重金属一方面可以影响植物生长、细胞***等多种代谢活动，抑制作物的生长从而降低农作物产量。另一方面，土壤中的重金属可以通过土壤-作物***进入食物链，给人类健康带来了巨大风险。面对过去几年发生的几十起重金属引起的***件，降低土壤环境中重金属含量，减少其对农产品的污染，保障生态***和人类健康已经迫在眉睫。
在有限的土地资源面前，重金属污染土壤的修复成为农业可持续发展的一个重要任务。由于重金属不能像有机物污染物那样可以直接通过在植物根际或植物体内的降解来消除污染物，土壤中重金属的植物修复的难度要大得多。
植物修复(phytoremediation)是利用绿色植物转移、容纳或转化环境中污染物的原位修复技术，与传统技术如客土法、土壤固定、土壤淋洗等物理和化学方法相比，具有高效、环境友好、成本低、不引起二次污染等优点。东南景天最初在浙江省衢州市古老Pb/Zn矿址上发现，是第一个中国原生的Zn/Cd超积累植物，能够有效地提取土壤中的Zn、Cd、Pb元素，不仅是研究植物吸收、转运和超积累Zn/Cd机理的良好模式材料，也是提升植物修复重金属污染技术的良好材料，其植物体中重金属浓度是土壤中的几倍甚至几十倍。尽管东南景天在生长速率和生物量上相比多数重金属超积累植物要有些优势，但其修复土壤重金属污染的效率还是受到生长慢、生物量小、适应性弱和土壤重金属可给性的限制，因此，如何促进东南景天生长、抗逆、提高生物量和对土壤重金属的吸收、转运、积累重金属能力，这对于应用东南景天修复重金属污染土壤的实际应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种内生细菌菌剂，此菌剂能够集合几种内生细菌的优势，克服植物修复的弱点，有效促进东南景天的生长，增强东南景天对重金属的吸收能力，提高植物修复效率。
一种复合内生细菌菌剂，由乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)组成。
以上六株内生细菌均保存到位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏信息如下：
乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)于2013年3月19日保藏，分类命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)，菌株号为Sasm3，保藏编号为CGMCCNo.7334。该菌株在公开号为CN 103266073A的发明专利申请文献中公开。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)于2016年3月3日保藏，分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，菌株号为SM05，保藏编号为CGMCC No.12173。
巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)于2013年3月11日保藏，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，菌株号为SAN1，保藏编号为CGMCC No.7295。该菌株在公开号为CN 103275891A的发明专利申请文献中公开。嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)于2016年3月3日保藏，分类命名为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，菌株号为SMN1，保藏编号为CGMCC No.12171。
短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)于2014年9月19日保藏，分类命名为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)，菌株号为SrN7，保藏编号为CGMCC No.9685。该菌株在公开号为CN104862255A的发明专利申请文献中公开。
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)于2016年3月3日保藏，分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，菌株号为SMN6，保藏编号为CGMCC No.12172。
本发明的复合内生细菌菌剂命名为植物促生复合菌剂PLSa01。
本菌剂所涉及的6株内生菌株均筛选自表面灭菌的超积累植物东南景天茎部和叶片。采用常规的内生菌分离方法，整株东南景天去除不新鲜的叶片，自来水冲洗干净，然后将每一部份分别用70％酒精浸3min，无菌水洗3次，0.5％HgCl2浸泡1min，然后用无菌水冲洗5次以上，并将最后一次洗涤用的无菌水涂LB平板以确认植株表面的无菌状态。
准备LB固体培养基。在洁净超净工作台中，用无菌手术刀(火焰灼烧灭菌后冷却)切割植物样本薄片，并将薄片平铺在培养皿的培养基上，每个培养基约9个(如图1所示)，用封口膜封好培养皿倒置于30℃培养箱中培养一周。用接种环挑下东南景天切片周围的菌斑，反复划线三次分离出单一菌落，分别接种于LB试管斜面，4℃保存(可保存2个月)。
鉴定所筛选得到的内生细菌的理化性质，发现其中6株内生细菌能够耐较高浓度重金属、能耐产生IAA和ACC脱氨酶，相互之间没有生长拮抗因素，制做简单，按常规复合菌剂混合方法将上述六株菌株混合得到复合菌剂，复合菌剂中各菌种数量稳定，能够组成效果良好的内生菌复合菌剂。
组成复合菌剂的6株内生细菌相互之间无拮抗作用，生长速度一致，正常接种和培养即可获得，例如：每株细菌取菌液20μL，加入到100mL液体LB(每1000mL培养基含：氯化钠10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，pH为7.2)培养基中，150rpm，35℃，48h，即可得到菌剂菌液，测定菌液得到每一株细菌浓度均不小于108CFU。
组成复合内生细菌菌剂的6株细菌的理化性质如表1所示：
表1复合内生细菌菌剂的组成及与促生相关的理化性质
“+”表示具备相应能力；“-”表示不具备相应能力。
本发明还提供一种所述复合内生细菌菌剂在植物修复重金属污染中的应用。
优选地，所述重金属为Pb、Zn、和Cd中的至少一种。
优选地，所述植物为东南景天。
当所述植物为东南景天时，一种应用方式为：采用水培法对东南景天进行快速繁殖，在第4周内向培养液中加入所述复合内生细菌菌剂。
进一步地，所述营养液为：K2SO4，0.7mmol/L；KCl，0.1mmol/L；Ca(NO3)2·4H2O，2mmol/L；MgSO4·7H2O，0.5mmol/L；KH2PO4，0.1mmol/L；H3BO3，10μmol/L；MnSO4·H2O，0.5μmol/L；ZnSO4·7H2O，1μmol/L；(NH4)4MoO24·4H2O，0.01μmol/L；FeSO4·7H2O溶解于煮沸的20μmol/L Na2·EDTA溶液中，20μmol/L，用NaOH或HCl调整营养夜pH 5.8。
所述快速繁殖方法为：剪取东南景天新生的枝条，每条约10cm长，只留下枝条顶端的5～8片叶片，将其***到0.1倍水培营养液中，温度为23～25℃，光照条件为200～300μE/m2·s，待3周后枝条生长出少许的根，再用1倍上述营养液培养，并向营养液中通气。每3～4天更换一次营养液。
营养液中所述复合菌剂的接种量为104～108CFU，接种1月后对东南景天根系扫描测量，发现104CFU根系总长度和根尖数量显著低于其它处理，105～108CFU间差异不显著，根据经济性原则，选择最低105CFU作为接种浓度。
按此种方法处理东南景天，生长1个月后与不接种PLSa01的对照相比，接种菌剂PLSa01的东南景天生长更加旺盛，根系更加发达。收集东南景天的根系测量其重量和长度，接种PLSa01后根系的总重量增加200％以上，根系总长度增加近300％。由于东南景天生长期较短，地上部的生物量未体现出显著的差异。
当植物为东南景天时，另一种应用方式为：将在营养液中生长良好的东南景天根系浸入所述复合内生菌的菌剂中3～5h，继续水培一周后移植到矿山土盆栽中。
优选地，所述东南景天在矿山土盆栽中生长时间为4～6月。
盆栽中的土壤为重金属污染的矿山土壤，进一步优选地，所述矿山土的理化性质如表3所示。
按此方法处理东南景天，接种PLSa01后，东南景天地上部生物量明显增加。将东南景天收获后，对地上部和地下部(即根部)的生物量进行称重和分析发现，与对照处理相比，接种PLSa01后，东南景天的地上部和地下部的生物量均有不同程度的显著增加，其中，地上部生物量的增加59％，地下部生物量增加61％，说明内生细菌菌剂PLSa01能够显著促进东南景天地上部和地下部的生长。
本发明的复合内生菌剂还可用用于连续修复重金属污染土壤，优选地，所述应用包括：取东南景天顶端枝条在营养液中生根培养，将所述复合内生菌剂接种至东南景天的根系中，将接种复合内生菌剂后的东南景天种植于重金属复合污染矿山土壤中。
在接种复合内生菌剂后的东南景天初次栽种的一个生长季内不用再次接种内生菌，之后每个生长季节接种一次，第一次刈割从栽种后的第二个生长季开始，收获地上部，收割时地上部保留茎4～8cm左右，以后每个生长季收获一次。
接种后的东南景天刚栽种时生长较慢，每年的9～12月及3～6月为其生长季。即一年收获2季，多年连续种植，实现连续收割，高效连续修复。
所述东南景天在土壤中的种苗密度为每平方米种植70～100株。
之后没个生长季对东南景天进行接种的方法为：接种时，将洗去培养基的内生细菌复合菌剂PLSa01与有机肥或营养土作为基质混合，保持菌体浓度为108CFU基质，湿度60～70％，挖沟深施(也可雨天洒施)，挖沟深施用量为0.12～0.15kg/m2。
按此种应用方法，接种内生菌后，东南景天的成活率接近100％，通常不接种内生菌植株存活率为71.0～90.1％，且在野外生长的东南景天接种后受收割造成苗株死亡率显著减小50％以上，苗株再次生长更加旺盛。在野外生长的东南景天接种内生菌3个月后，同样的生物量地上部吸收重金属Zn、Cd量分别提高了18.7％和47.48％。
附图说明
图1A和图1B是划线确定细菌各菌株间的拮抗关系的结果图。
图2是接种与未接种条件下东南景天根系的生长情况对照图。
图3是土培实验下接种内生菌菌剂对东南景天长势的影响图。
图4接种菌剂PLSa01对东南景天根上部和根系生物量的影响。
图5接种菌剂PLSa01对东南景天根上部和根系Zn浓度的影响。
图6接种菌剂PLSa01对东南景天根上部和根系Cd浓度的影响。
图7接种菌剂PLSa01对东南景天根上部和根系Zn积累量的影响。
图8接种菌剂PLSa01对东南景天根上部和根系Cd积累量的影响。
具体实施方式
实施例1促东南景天生物修复复合内生细菌菌剂的总体特性
将制成的菌剂取200μL接种至100mL培养基中，35℃培养36h，得到的菌剂一部分用以保藏，在1.5mL无菌离心管中加入300μL灭菌甘油和700μL对数期菌液，-80℃保存(可保存2年)，剩余的液态菌剂进行关键生理生化指标的鉴定。
1、致病性鉴定
将上述菌液接种到新鲜的破损叶面(东南景天，烟草，油菜)，以无菌水作对照，未发现叶片病害特征；用无菌注射器抽取100μL菌液注射到新鲜健康的洋葱茎内，以无菌水作对照，30℃培养一周，未发现洋葱有病害特征。
2、植物促生细菌间拮抗实验
通过划线实验测定各促生细菌之间是否存在明显拮抗关系。如图1A和图1B中的黑色线框所示，我们在促生菌剂的选择时，发现有些细菌间存在着明显的拮抗关系，这时需要根据促生效果的好坏去除促生效果较差的菌种。
3、耐Zn/Cd特点
向含Zn/Cd的LB培养基(分别含有浓度梯度：Zn(1、2、4、5、8、10、12、15、20、25、30、35或40mM)或Cd(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0或5.0mM))中接种10μL对数期菌液，37℃培养36小时，观察内生细菌在不同Zn/Cd浓度下生长情况。将培养得到的菌液分别稀释105～109倍，根据细菌群落形态判断各菌种在菌液中数量比例；对于无法通过菌落形态判别的细菌，则通过二者对重金属耐性、产IAA以及产ACC脱氨酶等不同特点进行试管培养并判断二者在细菌群落中的比例。
4、产ACC脱氨酶能力
当将促生根际菌定植到种皮或是植物根系时，会合成并分泌生长激素IAA，新合成的IAA将会被植物体吸收形成内源生长素，从而刺激植物细胞的***与延长。与此同时，IAA会激发ACC合成酶的活性，将S-腺苷甲硫氨酸转化成1-氨基环丙烷-1-羧酸。ACC脱氨酶是测定根际促生菌促进植物生长能力的指标之一。
参考Honma M和Shimomura T(Honma M&Shimomura T.Metabolism of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid.AgricBiolChem，1978，42：1825-1831)建立的以测定α-酮丁酸来检测内生细菌产ACC脱氨酶的活性的方法。
5、产IAA能力
吲哚乙酸(IAA)是一种能够调节植物生长发育的植物生长激素。
采用Salkowski比色法(Sarwar&Kremer.Determination of bacteriallyderived auxins using a microplate method.Letters in Applied Microbiology，2008，20：282-285)测定分离物产生植物生长激素类物质IAA的能力。
6、分泌嗜铁素能力的测定
嗜铁素是由微生物在低铁条件下合成的一类小分子量、能特异螯合铁离子的螯合物，分泌嗜铁素的细菌可用于防治真菌病害。
利用CAS平板法(Schwyn&Neilands.Universal chemical assay for thedetection and determination of siderophores.Analytical Biochemistry，1987，160：47-56)检测细菌分泌嗜铁素的能力。
通过检测，本菌剂具有耐Zn/Cd能力、产ACC脱氨酶能力、产IAA能力、分泌嗜铁素能力，且菌剂对重金属的最低耐性要明显大于单个菌株对重金属的最低耐性，分泌IAA的能力和ACC的能力也明显增强。该菌剂的各项生理生化指标参见下表2。
表2内生细菌菌剂与促进修复相关的生理生化指标
6、内生细菌复合菌剂PLSa01在植物体内的定殖情况
将生根的东南景天根系在菌液中浸泡4h，然后转移至正常水培营养液中培养1周，分别取植物的根、茎、叶各2g，用磷酸盐缓冲液研磨植物组织，吸取并稀释10倍，100倍和1000倍，取200μL涂固体LB培养平板，避光倒置过夜培养24h，根据内生菌群落特征统计各内生细菌的数量，对于群落特征相似的细菌，可通过其耐重金属的能力、产IAA、ACC脱氨酶的能力的不同区别验证。
实施例2内生细菌复合菌剂对东南景天生长和重金属土壤修复的影响
营养液组成为：K2SO4，0.7mmol/L；KCl，0.1mmol/L；Ca(NO3)2·4H2O，2mmol/L；MgSO4·7H2O，0.5mmol/L；KH2PO4，0.1mmol/L；H3BO3，10μmol/L；MnSO4·H2O，0.5μmol/L；ZnSO4·7H2O，1μmol/L；(NH4)4MoO24·4H2O，0.01μmol/L；FeSO4·7H2O溶解于煮沸的20μmol/LNa2·EDTA溶液中，20μmol/L。用NaOH或HCl调整营养夜pH 5.8)
(1)水培环境
采用水培法对东南景天进行快速繁殖。剪取东南景天新生的枝条，每条约10cm长，只留下枝条顶端的5～8片叶片，将其***到0.1倍水培营养液中，温度为23～25℃，光照条件为200～300μE/m2·s，待3周后枝条生长出少许的根，再用1倍上述营养液培养，并向营养液中通气。每3～4天更换一次营养液。在第4周向营养液中加入内生细菌菌剂的菌体(离心收集对数期菌体，无菌水洗涤3次)，接种量为每毫升营养液中的菌体为105CFU，之后换营养液不再接种。
生长1个月后观察东南景天的生长情况，如图2所示，与不接种PLSa01的对照相比，接种菌剂PLSa01的东南景天生长更加旺盛，根系更加发达。收集东南景天的根系测量其重量和长度，接种PLSa01后根系的总重量增加200％以上，根系总长度增加近300％。由于东南景天生长期较短，地上部的生物量未体现出显著的差异。
(2)土培环境
采用土培法种植东南景天。将在营养液中生长均匀良好的东南景天根系浸入菌剂中约4h，继续水培一周后，移植到矿山土盆栽当中，矿山土的理化性质见表3，保持土壤55％左右的湿度，生长时间为4～6月，共2个月。
由图3可见，接种PLSa01后，东南景天地上部生物量明显增加。将东南景天收获后，对地上部和地下部(即根部)的生物量进行称重和分析，发现，与对照处理相比，接种PLSa01后，东南景天的地上部和地下部的生物量均有不同程度的显著增加，其中，地上部生物量的增加59％，地下部生物量增加61％(如图4所示)，说明菌剂PLSa01能够显著促进东南景天地上部和地下部的生长。
表3试验所用矿山土的基本理化性质
进一步对东南景天根部和地上部的重金属量的分析和积累量进行测定和分析，Zn和Cd的检测采用常规方法。如图5～8所示，接种PLSa01后，东南景天地上部和地下部的重金属浓度和积累量均显著增加，其中，地上部和根部Zn含量浓度分别增加30％和41％，地上部Cd的含量浓度增加54％，根部Cd浓度增大量不明显；对照组东南景天地上部Zn的积累量为304.3mg，根部Zn的积累量为5.6mg，接种内生菌PLSa01后，东南景天地上部Zn的积累量可达到627.7mg，提高了106％，根部Zn的积累量也达到12.7mg，提高了126％。同时，接种PLSa01后，东南景天地上部Cd的积累量达到了41.2mg，提高了144％，根部积累提高73％。
与未接种PLSa01处理相比，植物-微生物修复技术体系显著提高了东南景天生物量(P<0.01)和地上部重金属Cd浓度(P<0.01)。
另外，我们还通过试验发现，实验室条件下，不接种内生菌植株存活率约为71.0～90.1％，而接种内生菌后，使东南景天插苗成活率达96.8～99.5％。由于矿山土土质贫瘠，若在矿山土壤中增加20％左右营养土菌剂(腐烂水草，浓度为107～108/g的菌剂PLSa01)后，生物量更提高至94.7～136.2％。
实施例4促东南景天生物修复内生细菌的应用
东南景天苗株快速繁殖(参照实施例3的方法)：取东南景天顶端枝条在营养液中生根45天左右。LB液体培养基过夜培养PLSa01菌剂，无菌水洗去培养基，按105CFU接种到生根苗筐中，通气培养1周。此时东南景天内生菌将定殖在根内部，与根系形成共生关系。
扦插繁殖：东南景天接种内生菌1周后，内生菌将定殖在其根内部，将东南景天苗株种植于重金属复合污染矿山土壤中，种苗密度为每平方米种植70～100株。刚栽种时生长较慢，每年的9～12月及3～6月为其生长季。在初次栽种一个生长季内不用再次接种内生菌，以后每个生长季节接种一次，接种时，将洗去培养基的Sasm3菌液与有机肥或营养土作为基质混合，保持菌体浓度为108CFU基质，湿度60～70％，挖沟深施(也可雨天洒施)，挖沟深施用量为0.12～0.15kg/m2，生长两个季度后，会生长出更多的新植株。
刈割收获：第一次刈割从接种后的第二个生长季开始，待生物量最大时刈割，收获地上部，收割时地上部保留茎4～8cm左右，以后每个生长季收获一次，即一年收获2季，多年连续种植，实现连续收割，高效连续修复。
统计发现，接种内生菌后，东南景天的成活率接近100％，通常不接种内生菌植株存活率为71.0～90.1％，且在野外生长的东南景天接种后受收割造成苗株死亡率显著减小50％以上，苗株再次生长更加旺盛。在野外生长的东南景天接种内生菌3个月后，同样的生物量地上部吸收重金属Zn、Cd量分别提高了18.7％和47.48％。

Claims (10)

1.一种复合内生细菌菌剂，其特征在于，由保藏号为CGMCC No.7334的乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、保藏号为CGMCC No.12173的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、保藏号为CGMCC No.7295的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、保藏号为CGMCC No.12171的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、保藏号为CGMCCNo.9685的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)和保藏号为CGMCC No.12172的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)组成。
2.如权利要求1所述复合内生细菌菌剂在重金属污染植物修复中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述重金属为Pb、Zn、和Cd中的至少一种。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述植物为东南景天。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用包括：采用水培法对东南景天进行快速繁殖，在第4周内向培养液中加入所述复合内生细菌菌剂。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述复合内生细菌菌剂的接种量为105～108CFU。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用包括：将在营养液中生长良好的东南景天根系浸入所述复合内生细菌菌剂中3～5h，继续水培一周后移植到矿山土盆栽中。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述东南景天在矿山土盆栽中生长时间为4～6月。
9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述应用包括：取东南景天顶端枝条在营养液中生根培养，将所述复合内生细菌菌剂接种至东南景天的根系中，将接种复合内生细菌菌剂后的东南景天种植于重金属复合污染矿山土壤中。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，在接种复合内生细菌菌剂后的东南景天初次栽种的一个生长季内不用再次接种此菌剂，之后每个生长季节接种一次，第一次刈割从栽种后的第二个生长季开始，收获地上部，收割时地上部保留茎4～8cm，以后每个生长季收获一次。
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