CN105255769B - 一株阴沟肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株阴沟肠杆菌及其应用。该菌株分类命名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)JP6，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC No.9615。本发明菌株具有很好的解磷效果。紫外分光光度法测得该菌株产生长素。表明JP6菌株对促进烟草生长具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于植物根际促生菌及其应用技术领域，具体涉及一株促进烟草生长的具有解磷和产IAA功能的阴沟肠杆菌及其促生特性的应用。
背景技术
烟草是茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)一年生草本植物。喜温、喜光、耐旱、怕涝、耐瘠、需钾较多。烟草叶、茎、花萼和果都有多细胞的毛，其中腺毛细胞中含有叶绿素，能综合含有树胶和树脂的渗出物，与烟草的香气有一定关系。烟草叶柄不明显或成翅状柄，其圆锥花序顶生，花萼筒状，花冠漏斗状，末端粉红色。蒴果，种子黄褐色。烟草原产于南美洲，因其叶片含烟碱(尼古丁)，采收后经过调制、分级和加工处理，可制卷烟、雪茄烟、旱烟等，是烟草工业重要的原料。近年来我国烟田施肥出现很大的问题，具体表现为：(1)肥料利用率不高，有资料表明我国烤烟肥料利用率较低，南方一些省份肥料利用率仅20％左右。其原因是对肥料利用率的相关性技术缺乏深入研究，特别是对南方烟区肥料流失的控制和北方烟区的营养吸收障碍等没有从根本上研究解决；(2)烟田土壤肥力不同程度出现下降趋势，由于缺乏良好的培肥地力措施，加之轮作条件差，烟田常年连作，土壤主要营养元素都不同程度出现下降趋势，同时土壤物理性状变劣；(3)营养不平衡，重氮轻磷缺钾；(4)对旱作烟草的施肥技术缺乏研究。
研究发现植物根际土壤中含有一些可以促进植物生长的微生物，一般有固氮、解磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一能力的细菌、蓝细菌等。统称为植物根际促生菌(PGPR)，其促生作用机制主要有以下几大类：提供植物营养物质、产生植物生长调节物质、植物根际生物修复剂和环境胁迫调节剂等。但筛选出具有多种功能且高效的微生物菌株一直是本领域追寻的目标。
烟草吸收大量元素氮、磷、钾，中量元素钙、镁、硫以及微量元素硼、锌、铜、锰、铁等营养元素。吸收规律是生长初期(移栽后至团棵前)少，中期(团棵至打顶前)吸收量最多，后期(打顶后)吸收量逐渐减少，整个生长期营养吸收呈S型曲线。土壤中现有的磷并不能满足烟草生长的需要。土壤中含有大量有机物，可以利用PGPR将土壤中的含磷的有机物分解，产生可以供给烟草使用的磷。既为烟草补充了营养元素又避免了过多施用化学肥料的弊端，比如容易污染环境，使土壤板结使烟草田的土质受到破坏，损耗土壤中的有机物，降低了土壤肥力等。而且目前还未见同时具有高效解磷和产IAA功能的阴沟肠杆菌及其促进烟草生长的应用报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株阴沟肠杆菌及其促进烟草生长的应用，该菌株具有解磷和产生长素IAA的作用。
一株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)JP6，该菌株保藏编号：CGMCC No.9615。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日。
所述的阴沟肠杆菌的培养条件，采用LB培养基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸馏1000ml，121℃灭菌20min，培养温度37℃，pH 7.0。
所述的阴沟肠杆菌的应用，用于解磷和/或产生长素IAA，从而促进植物的生长。所述的的植物包括烟草。
本发明菌株培养后得到菌悬液作为液态菌剂使用，菌悬液的菌数浓度≥108cfu/mL。菌剂的使用方法：缓苗后灌根，每株烟苗加菌剂1mL。
本发明菌株的菌落及菌体特征为：该菌株在LB培养基(酵母浸膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，琼脂15～20g，121℃灭菌20min，pH7.0，37℃)上培养48h后菌落呈圆形，不透明，表面干燥无***，淡黄色，边缘整齐。菌体呈球状，不产芽孢，革兰氏染色阴性。
该菌株的生理生化特征为：甲基红试验阴性、v-p试验阴性、淀粉水解试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、吲哚试验阳性、硫化氢试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、葡萄糖发酵试验阴性、蔗糖发酵试验阴性、麦芽糖发酵试验阴性、乳糖发酵试验阳性、甘露醇发酵试验阴性、葡萄糖碳源利用试验阳性、乳糖碳源利用试验阳性、甘露醇碳源利用试验阳性、蔗糖碳源利用试验阳性、麦芽糖碳源利用试验阳性、柠檬酸碳源利用试验阴性、2﹪NaCl耐盐试验阳性、5﹪NaCl耐盐试验阳性、7﹪NaCl耐盐试验阳性、10﹪NaCl耐盐试验阴性、产氨试验阳性。
该菌株的最适培养条件为：酵母浸膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，琼脂15～20g，pH7.0，温度37℃。
以上菌株可以用于制备微生物菌剂，用LB培养基培养得菌悬液，作为液态菌剂。
菌悬液的菌数浓度≥108cfu/mL。
菌剂的使用方法：缓苗后灌根每株烟苗加菌剂1mL。
经研究表明，对本发明的菌株的功能测定结果如下：在蒙金娜固体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO40.03g，MnSO4·H2O 0.03g；CaCO35.0g，KCl 0.3g，Ca3(PO4)225.0g，卵磷脂0.3g，琼脂18～20g，pH值7.2～7.4)上培养一周后，测得第一天其菌落直径d为3.5mm，溶磷圈直径D为4.5mm，D/d为1.3，第三天其菌落直径d为4.5mm，溶磷圈直径D为12mm，D/d为2.7，第七天其菌落直径d为5mm，溶磷圈直径D为13mm，D/d为2.6。在无机磷液体培养基(C6H12O610.0g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.03g，Ca3(PO4)225.0g，水1000mL，pH7.0-7.5。)培养4天后，用钼蓝比色法测定培养液中速效磷的含量变化，从而反应细菌的解磷能力，测得JP6培养液中速效磷含量为50.1mg/L。在含有L-色氨酸(200mg/L)的R2A液体培养基(酵母粉0.5g，胰蛋白胨0.5g，酪蛋白氨基酸0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，K2HPO40.3g，MgSO4·7H2O 0.05g，丙酮酸钠0.3g。)中，28℃，180R/min，摇床培养4d后取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液(50mL35％HClO4+1mL 0.5mol/LFeCl3)白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察,颜色变红表示能够分泌IAA，然后用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000R/min离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min使其显色，测定其OD530值，计算菌浓度OD600值为1时，IAA的浓度，测得JP6发酵液中IAA含量为128.9mg/mL。盆栽30天时经JP6处理的烟株叶片数大于对照，最大叶片表面积也大于对照，但是没有达到显著差异，60天时经JP6处理的烟株株高、茎围、最大叶片表面积、叶片数均高于对照，90天时经JP6处理的烟株株高、叶片数与对照达到显著差异，经JP6处理的烟草植株的根、茎、叶、植株总鲜重均好于对照处理，且均达到显著差异，在采收后对生物量的统计中可以看出植株的根、茎、叶干重以及植株总干重均要优于对照，同时茎干重、植株总干重均在达到显著差异。与对照相比，根干重增幅为60.8％，茎干重增幅为54.5％，叶总干重增幅为10.1％，植株干重增幅为24.9％。以上研究结果表明，JP6菌株可以很好的促进烟草生长，在促进烟草生长方面具有潜在的应用价值。
本发明阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)JP6。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC No.9615。
附图说明
图1为60天和90天JP6处理与对照的烟株株高柱形图；
图2为60天和90天JP6处理与对照的烟株茎围柱形图；
图3为30天、60天和90天JP6处理与对照的烟株最大叶表面积柱形图；
图4为30天、60天和90天JP6处理与对照的烟株叶片数柱形图；
图5为JP6处理与对照的烟株鲜生物量柱形图；
图6为JP6处理与对照的烟株干生物量柱形图；
图7为JP6解磷效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)JP6，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月28日，保藏编号：CGMCC No.9615。
(1)CGMCC No.9615的筛选
在牛肉膏蛋白胨液体培养基富集的过程：稀释平板培养法分离，称取采自湖南桑植官地坪烟田新鲜土壤10g，置于内含玻璃珠和90mL无菌水的250mL三角瓶中，170r/min振荡30min，然后按10-5、10-6、10-7梯度进行稀释，各取0.1mL涂布于秸秆培养基(新鲜的稻草秸秆300g，琼脂25g，水1000mL 121℃高压蒸汽灭菌25min。)平板和无机磷培养基(葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，Ca3(PO4)225.0g，水1000mL pH 7.0-7.5，琼脂25g。)平板上，其中秸秆培养基涂布两份，其中一份覆盖一层尽可能厚的水琼脂。每个梯度重复3次。将不盖有水琼脂的秸秆培养基平板放置于15℃培养5-8d，盖有水琼脂的平板和无机磷培养基平板置于37℃培养24－48h。
将水琼脂－秸秆培养基上生长的菌落穿刺接种于盛有半固体秸秆培养基的试管中，然后试管上方封盖一层约1cm厚的水琼脂，再灌注约2cm厚的液体石蜡封口，制造完全无氧环境。
将低温条件下秸秆培养基上培养的菌落和无机磷培养基上的菌落再次接种到相应培养基上在相同的条件下培养。
以上各处理均传代3次，选取生长速度快的细菌分离物纯化保存。其中解磷培养基上挑选含有解磷圈的细菌分离物。
将复筛得到的细菌分离物采用三区划线法进行纯化，纯化后对所得的不同形态的菌落再次按复筛中的条件进行验证，并记录菌落形态。
通过平板溶磷圈法，溶磷圈法和钼蓝比色法，紫外分光光度法(测生长素含量)，保绿法，解钾能力测定法，分别测定其溶磷能力，产生长素能力，产细胞***素的能力和解钾能力。从分离得到的菌株中筛选出一株既能解磷又产生长素的菌株，记为JP6。
(2)CGMCC No.9615菌种鉴定
基因组DNA的提取：将分离得到的菌株划线接种到LB固体培养基上于37℃中培养24h后，挑取单菌落于装有LB液体培养基的试管中37℃，150r/min摇床培养12h。具体方法参阅文献(Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,et al.Short Protocols in MolecularBiology.Chichester:John Wiley&Sons,Inc,1995:36-40.)。将取得的DNA溶于50μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH＝8.0)中，然后保存于-20℃冰箱备用。
16S rDNA序列扩增引物由上海生物工程有限公司合成。
PCR扩增反应体系：Taq DNA聚合酶0.5μL，10×Buffer 5μL，MgCl23μL，dNTPs(10mmol/L)1μL，引物27F 1μL，引物1492R 1μL，模板0.5μL，ddH2O补足至50μL。反应条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。16S rDNA的测序工作由上海生物工程有限公司完成。
将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：本发明的菌株位于***发育树中肠杆菌(Enterobacter.sp)分支中，与Enterobacter cloacae有最近的亲缘关系，其16S rRNA基因序列相似性为99％。
该菌株在LB培养基(酵母浸膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，121℃灭菌20min，pH7.0，37℃)上培养48h后菌落呈圆形，不透明，表面干燥无***，淡黄色，边缘整齐。菌体呈球状，不产芽孢，革兰氏染色阴性。该菌株的生理生化特征为：甲基红试验阴性、v-p试验阴性、淀粉水解试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、吲哚试验阳性、硫化氢试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、葡萄糖发酵试验阴性、蔗糖发酵试验阴性、麦芽糖发酵试验阴性、乳糖发酵试验阳性、甘露醇发酵试验阴性、葡萄糖碳源利用试验阳性、乳糖碳源利用试验阳性、甘露醇碳源利用试验阳性、蔗糖碳源利用试验阳性、麦芽糖碳源利用试验阳性、柠檬酸碳源利用试验阴性、2﹪NaCl耐盐试验阳性、5﹪NaCl耐盐试验阳性、7﹪NaCl耐盐试验阳性、10﹪NaCl耐盐试验阴性、产氨试验阳性。由以上菌落、菌体形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定CGMCC 9615为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。
(3)解磷效果测定
将本发明筛选得到的菌株接种在蒙金娜固体培养基(葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO40.03g，MnSO4·H2O 0.03g；CaCO35.0g，KCl 0.3g，Ca3(PO4)225.0g，卵磷脂0.3g，琼脂18～20g，pH值7.2～7.4)上培养一周，测量其菌落直径d、溶磷圈直径D，计算D/d。解磷圈效果如图7所示，测得第一天其菌落直径d为3.5mm，溶磷圈直径D为4.5mm，D/d为1.3，第三天其菌落直径d为4.5mm，溶磷圈直径D为12mm，D/d为2.7，第七天其菌落直径d为5mm，溶磷圈直径D为13mm，D/d为2.6。将JP6在无机磷液体培养基(葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，Ca3(PO4)225.0g，水1000mL，pH 7.0-7.5。)中培养4天后，钼蓝比色法测定培养液中速效磷的含量变化，从而反应细菌的解磷能力。测得JP6培养液中速效磷含量为50.1mg/L。
(4)产生长素能力测定
将JP6接到含有L-色氨酸(200mg/L)的R2A液体培养基中，28℃，180R/min，摇床培养4d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液(50mL 35％HClO4+1mL 0.5mol/L FeCl3)。将加入50μL 50mg/L IAA的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察,颜色变红表示能够分泌IAA。
对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液10000R/min离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min使其显色，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，IAA的浓度。测得JP6发酵液中IAA含量为128.9mg/mL。
(5)盆栽试验
首先是育苗，选择同一品种的烟草种子进行育苗。育苗30天后选择健壮、无病、长势一致的烟苗进行移栽，每盆栽烟1株，主要将烟苗茎杆全部埋入土内，移栽后立即浇等量的水。
然后是进行处理，一组空白对照，一组加JP6菌剂。培养得本发明菌悬液(菌悬液的菌数浓度cfu≥108个/mL)，作为液态菌剂使用，缓苗后灌根，每株烟苗加菌剂1mL。
摆盆：为减少因大棚不同方向温度的差异对实验结果的影响，盆子应沿与大棚垂直方向摆放。
烟草生长期内注意土壤湿度，低于土壤相对含水量50％以后则需补水至土壤最大持水量的80％(补水可根据烟株的生长和缺水情况而定，但必须保证每盆的浇水量和土壤湿度保持一致)。
移栽后每隔10天调查叶片数，株高，茎围，叶色，最大叶长、宽，长势，所处生育期等。在盆栽进程中发现处理间长势长相有明显差异时，将对照和处理摆在一起拍照，同时将取样烟株的根系进行对比拍照。
结果如表1、表2、表3、表4、表5所示
表1. 30天JP6对烟株农艺性状的影响
注：表中数据位平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示差异显著性(p<0.05)，下同。
表2. 60天JP6对烟株农艺性状的影响
表3. 90天JP6对烟株农艺性状的影响
表4. JP6对烟株鲜重的影响
表5. JP6对烟株干重的影响
上述虽然结合附图和实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (1)
1.一株阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）JP6，该菌株保藏编号：CGMCC No.9615。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |